Abstract

Os microRNAs regulam diversos aspectos da tumorigênese e progressão do câncer. A maioria dos tecidos de câncer são arquivados fixado em formalina e embebidos em parafina (FFPE). Enquanto microRNAs são uma forma mais estável de RNA pensado para suportar FFPE de processamento e degradação há apenas evidência limitada para a última hipótese. Examinamos se perfil de microRNA podem ser realizados com sucesso em tecidos de câncer FFEP SOLiD sequenciamento baseado ligadura. tempos de armazenamento de tecido (2-9 anos) pareceu não afectar o número de microRNAs detectados em amostras de FFPE em comparação com amostras emparelhadas congelados (teste t emparelhado de p 0,7). Correlações de valores de expressão de microRNA foram muito alta em todo microRNAs em uma dada amostra (r de Pearson = 0,71-0,95). variância mais elevada de valores de expressão entre as amostras foi associada com maiores coeficientes de correlação entre FFPE e tecidos congelados. Uma das amostras FFPE neste estudo foi degradada por razões desconhecidas, com um comprimento de leitura de pico de 17 nucleótidos em comparação com 21 em todas as outras amostras. O número de microRNAs detectados nesta amostra estava dentro da gama de microARNs detectadas em todas as outras amostras. À base de ligadura profunda sequenciamento microRNA em tecidos de câncer FFPE é viável e RNA degradação ao grau observado em nosso estudo parece não afetar o número de microRNAs que podem ser quantificados

Citation:. Meng W, McElroy JP, Volinia S, Palatini J, Warner S, Ayers LW, et ai. (2013) Comparação de MicroRNA profundo Sequenciamento de Matched fixadas em formalina parafina-encaixado e Câncer Fresco Congelado tecidos. PLoS ONE 8 (5): e64393. doi: 10.1371 /journal.pone.0064393

editor: Soheil S. Dadras, da Universidade de Connecticut Health Center, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de janeiro de 2013; Aceito: 13 de abril de 2013; Publicado em: 16 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Meng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Departamento de Radioterapia Oncologia e do Comprehensive Cancer Center, e, pela Bioestatística core e por Microarray recurso compartilhado no The Ohio State University. O trabalho foi financiado pelo Prêmio Número Grant 8UL1TR000090-05 do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translational ou o National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MicroRNAs são pequenos RNAs não-codificante com um comprimento de 22 a 26 nucleótidos (nt). MicroRNAs resultar na degradação de RNA mensageiro complementar em muitas espécies. MicroRNAs desempenham um papel importante no desenvolvimento de células, morte celular, proliferação de células [1], a apoptose [2] e a angiogénese [3]. O método de perfis de citometria de fluxo de microARN expressão com base no talão pioneiro revelaram que os perfis de microRNA reflectir a linhagem de desenvolvimento e diferenciação de tumores [4]. tecidos e tecidos de câncer normal foram mostrados para ter perfis de expressão distintos e perfis de microRNA pode descrever caminhos-driven microRNA em tumores sólidos [5]

Os métodos atuais para a quantificação microRNA são:. reversa em tempo real transcrição-PCR [ ,,,0],6], [7], microarray [8], Nanostring, e na próxima geração seqüenciamento [9] – [11]. Especialmente, as tecnologias de sequenciamento de próxima geração recém-desenvolvidos têm o potencial para descobrir novos microRNAs e outros pequenos RNAs. A maioria dos tecidos processados ​​no contexto dos cuidados de saúde vai sofrer formalina-fixação e-inclusão em parafina (FFPE). A maioria dos ensaios clínicos realizados em laboratórios de patologia são otimizados para tecidos FFPE. tecidos FFPE são tipicamente armazenados à temperatura ambiente. Formalina preserva amostras de tecidos através da criação de ligações cruzadas entre as proteínas, DNA e RNA. DNA extraído a partir de tecido FFPE foi demonstrado ser útil para a análise de número de cópias e a análise de mutações em, pelo menos, uma plataforma em algumas configurações [12]. No entanto, a modificação química entre macromoléculas e RNAs causada por fixação formalina pode acelerar a degradação do ARN [13] [14]. A estabilidade de microARNs é geralmente muito mais robusto do que o ARN mensageiro [15]. A análise da expressão microRNA base próxima geração seqüenciamento foi desenvolvida em várias plataformas, incluindo Roche /454 plataforma, Genome Analyzer da Illumina e sólida plataforma da ABI [16] [17], e diferentes protocolos comerciais para miRNA preparação biblioteca foram desenvolvidos pelas três empresas [ ,,,0],18]. Existe actualmente provas apenas limitado disponível que os resultados microRNA sequenciamento são confiáveis ​​e válidos. Ma et al. demonstrada a viabilidade de miARN perfis baseados em Sanger de sequenciação em tecido arquivado 10 anos de idade [19]. Para o nosso conhecimento, existem apenas dois estudos revisados ​​por pares publicados que compararam resultados microRNA sequenciamento de espécimes congelados e FFPE combinados usando a plataforma Illumina [9], [20]. O objetivo deste estudo foi determinar se as amostras de FFPE pode ser caracterizado com sucesso por sequenciação miRNA profundo. Para este fim, analisados ​​combinado tecidos congelados e FFPE de diferentes histologia para os quais informações processamento e armazenamento pormenorizada disponível.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

amostras de tecidos malignos humanos adquiridos durante o período de 2003-2009 foram obtidos a partir do tecido Rede Cooperativa Humano (CHTN /NCI), Centro-Oeste Divisão, que é financiado pelo National Cancer Institute, baseado em um conselho de revisão interna (IRB) aprovou protocolo de pesquisa (assuntos Ohio State University Humanos Protocolo – 2011E0377). Outros investigadores podem ter recebido amostras dos mesmos assuntos.

Os espécimes de tecido

Oito amostras de tecidos malignos humanos emparelhados foram recebidos. tecidos cirúrgicos remanescentes foram tomadas após amostras de diagnóstico foram fixadas dos pacientes (cinco machos e quatro fêmeas, com idade mediana de 58 anos, intervalo 39-78 anos) com carcinoma ductal invasivo de mama (2), carcinoma de células claras renal (2), adenocarcinoma de pulmão ( 1), adenocarcinoma da próstata (1), melanoma metastático (1), e sarcoma de coxa (1). Os espécimes cirúrgicos foram transportados a partir dos quartos de funcionamento à recolha de tecidos, examinados sob supervisão de um patologista e preservados dentro de 5 a 57 minutos gravados. amostras de tecidos emparelhados seleccionados para pesquisa ou foram imediatamente congelados em azoto líquido e colocada num congelador a -80 ° C para armazenamento ou monitorado fixado em formalina tamponada a 10% durante até 24 horas e, em seguida, transformado em um bloco de parafina incorporado e armazenados na sala temperatura. Quando as amostras de investigação foram recebidas CHTN, as amostras codificadas foram acompanhadas por um relatório patológico final, codificados e um relatório de avaliação da qualidade verificar coleção de tecido tumoral. As amostras foram analisadas por um patologista e 4 casos tiveram 100% de tumor, 3 casos de 90-95% e 1 caso de 50-60% do tumor, e combinados FFPE e amostras congeladas foram geralmente comparáveis ​​em conteúdo e tamanho do tumor. As características clínico-patológicas dos casos usados ​​para microRNA sequenciação e análise de expressão estão listados na tabela 1.

RNA isolamento, quantificação e avaliação da qualidade

RNA a partir de amostras FFPE foram extraídos utilizando Recuperar Todos totais ácido nucleico kit de isolamento (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA). Resumidamente, as amostras de 5-10 mg foram cortados a partir de blocos de parafina e deparaffinizated por xileno a 50 ° C, seguido de lavagem com etanol a 100%. As amostras de tecido de ar seco foram digeridas pela proteinase K durante 24 horas numa incubadora de agitação microtubo fixada em 50 ° C. As amostras digeridas foram misturados com um volume adequado de aditivo de isolamento e 100% de etanol. Depois de passar a mistura através do cartucho de filtro, o ADN e ARN foram retidas no filtro. O DNA foi removido por-filtro na digestão de DNase. O ARN foi purificado por meio de tampão de lavagem e eluiu-se com água isenta de nuclease.

As amostras de microRNA as amostras congeladas frescas foram extraídos utilizando PureLink ™ kit de isolamento de miARN (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA). Resumidamente, 5 mg de amostras de tecido congelado fresco foram misturadas com 300 ul de tampão de ligação (L3) e homogeneizado usando um homogeneizador de tecidos. As amostras homogeneizadas foram centrifugadas, e o sobrenadante foram misturados com 300 ul de etanol a 70%. A solução contendo o ARN foi purificado por meio de dois rodada de colunas de centrifugação de limpeza. O ARN foi eluído com 50-100 ul água livre de RNase estéril

MicroRNA sequenciamento

RNAs pequeno de FFPE e amostras congeladas frescas foram preparadas para a sequenciação sólido como segue:. As amostras de RNA total foram processados ​​pelo fraccionador flashPAGE (Ambion) e flashPAGE Clean-Up Kit (Ambion). O ARN enriquecido pequena foi então processada de acordo com o protocolo do kit contínua pequena Expressão de ARN (Applied Biosystems). Os pequenos RNAs purificados foram ligados com extremidades 5 ‘e 3’ do adaptador mistura utilizando ligase de ARN. Os produtos ligados (40-60 bases de comprimento) foram transcritas inversa e purificado em gel Novex de TBE-ureia a 10%. Subsequentemente, 15-18 ciclos de PCR foram realizados, amplificando o cDNA purificado com código de barras conjuntos de iniciadores de PCR fornecidos no kit, que difere de uma sequência de nucleótido-6 original. Os produtos amplificados foram carregados em Novex gel de TBE a 6% (Invitrogen) e as bandas de gel contendo fragmentos de 110 a 130 pb foram excisados. Os produtos amplificados foram purfied da banda de gel excisada, amplificado por PCR emulsão, então carregados em Applied Biosystems SOLiD sistema de sequenciamento de alto rendimento 4 da próxima geração para aquisição de dados. A qualidade das amostras e as bibliotecas foram verificados no Agilent Bioanalyzer [21], [22]. Os dados de sequenciamento sólidos brutos foram enviados para Omnibus Gene Expression do NCBI e são acessíveis através do número de acesso GEO Series GSE45740 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45740).

RT-qPCR para microRNA validação

O RNA a partir de tecidos congelados e frescos FFPE foram validados por em tempo real (RT) PCR quantitativa. expressão microRNA foi normalizada para o pequeno U6 ARN nuclear utilizando kits TaqMan MicroRNA ensaio (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha). Uma amostra de 30 ng de ARN foi processado pelo kit TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha). Resumidamente, 5 de ARN jil foram misturados com 1 mmol /l de cada trifosfato de desoxirribonucleótido, 50 unidades de MultiScribe transcriptase reversa, 5 × tampões de reacção, 4 unidades de inibidor de RNase, e 5 RT iniciadores mistura específica para o gene × num volume de reacção final de 15 ul. As reacções foram então incubadas a 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min, 85 ° C durante 15 min com uma retenção final em 4 ° C. Em seguida, 15 ul da solução de cDNA foi diluída por água isenta de nuclease para um volume final de 100 ul. Quantitativa PCR foi executado em uma máquina de 7900 HT PCR com o passo de desnaturação a 95 ° C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de um passo de desnaturação a 95 ° C durante 15 segundos, e um passo de recozimento /alongamento a 60 ° C durante 60 segundos . Dobre a mudança de microRNA em amostras de tecido foi então calculada usando a equação 2-ΔCt de teste /controle de 2 ΔCt.

A análise dos dados

As sequências de ligação de bibliotecas de ARN pequenas foram removidas usando software cutadapt ( https://code.google.com/p/cutadapt/) sob parâmetros padrão. A distribuição do comprimento de microRNA foi construído por plotagem lê acusações contra 0-30 comprimentos de nucleotídeos. O pequeno RNA Analysis Tool Pipeline da Applied Biosystems foi usada com os seguintes parâmetros para incluir apenas qualidade suficientemente elevada lê em nosso estudo: 1) o limite de qualidade de leitura média mínima foi de 20 (o valor QV é calculada usando uma Phred como pontuação q = -10 × log10 (P), onde q é o valor de qualidade e (p) é a probabilidade previu que a chamada de cores está incorreto.), 2) para ser rigoroso que permitiu apenas 1 desencontro entre lê e miRBase versão de 16 acessos para cada contado ler 3 ) o comprimento mínimo de alinhados lê tinha de ser 17 bases. Os dados foram normalizados como lê por milhão (RPM). Sequências com valor da expressão abaixo de 5 RPMs foram consideradas não detectado para a correlação entre congelados e FFPE parte de análise

Resultados

Efeitos de degradação da amostra FFPE:. MicroRNA ler distribuição de comprimento

os tempos de fixação de formalina e de armazenagem a longo são conhecidas por resultar na degradação de ARN [23]. Esta degradação resulta em um comprimento médio de RNA mais curto [24]. Para identificar possíveis efeitos de degradação dos microRNAs, foi analisada a distribuição do comprimento de leitura de amostras de tecido de câncer congelados e frescos FFPE combinados. Após as sequências 3 ‘do adaptador de cada lido foram aparadas, sequência lê distribuição de comprimento foi examinada (Figura 1). Foram observadas ler comprimentos para ser centrado em 21 nt em todas as amostras congeladas e todos, mas um amostras FFPE. Houve uma amostra FFPE cujo comprimento microRNA pico foi encontrado em 17 nt, indicando degradação significativa. Em seguida, examinou cuidadosamente os pequenos perfis de classificação RNA e correlação dos valores de expressão de microRNA de amostras congeladas e FFPE frescos. Descobrimos que existem efeitos negligenciáveis ​​ou não sobre essas análises. Períodos de armazenamento ou métodos de preparação não foram diferentes entre esta amostra FFPE degradada e as outras amostras analisadas neste estudo. Além disso, a proporção de pequenos RNAs na gama de 20-22 nt foi menor para os diversos casos da FFPE em comparação com as amostras correspondentes congelados (um caso de carcinoma de células renais, o caso de adenocarcinoma de pulmão, e no caso do cancro da próstata). Esta é também provável devido à degradação em amostras de FFPE, embora pequenas variações durante a preparação da biblioteca poderia contribuir parcialmente para as diferenças observadas

Efeitos de degradação da amostra FFPE:. Armazenamento tempo

A tempo de armazenamento das amostras variou de 2 a 9 anos. 624 micoRNAs e seus precursores foram identificados nas 8 pares de amostras de tecido. Alguns microARNs não podia ser detectada tanto em amostras congeladas ou frescas FFPE. A Figura 2 mostra as percentagens de microARNs que foram detectados em ambas as amostras e congelados frescos FFPE, apenas em amostras congeladas frescas e apenas em amostras FFPE ao longo do ano de recolha de amostras. Não houve alterações dependentes de armazenamento em tempo-nestas percentagens, indicando que não existe uma associação significativa entre o tempo de armazenamento eo número de microRNAs presentes durante esta janela de tempo nove anos.

A seguir, examinou a percentagem de microARN lê de entre o total lê (figura 3) para se compreender a pureza de microARNs foi reduzida nas amostras FFPE. Aproximadamente 70% e 85% de leituras em amostras e congelados FFPE, respectivamente, foram identificadas como sequências microRNA. Uma possível razão para essa diferença poderia ser a presença de fragmentos de lncRNAs e mRNAs na fração de RNA menor do que 40 nucleótidos (nt) em tecidos FFPE (figura 4).

Efeitos de degradação da amostra FFPE: classificação de pequenos RNAs

Para melhor compreender se a diferença de a percentagem de pequenas sequências de ARN entre todas as leituras de dados entre o tecido congelado e FFPE examinámos a distribuição das classes de ARN em uma amostra do cancro da mama . Havia um total de 11563414 e 10273837 sequenciamento lê, nos dois examinaram amostras combinadas e as leituras foram mapeados para o genoma humano (hg19, Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia edifício) usando scripts Python personalizado. As leituras foram classificados em diferentes grupos de ARN de acordo com a base de dados Ensembl. A maioria dos pequenos RNAs em ambas as bibliotecas e congelados frescos FFPE foram microARNs (Figura 4). Comparando os dados de amostras congeladas frescas combinadas a dados de amostras de FFPE havia lincRNA e sequências de aulas desconhecidos em dados obtidos a partir de amostras FFPE. Dado que apenas os RNAs menor do que 40 nt foram extraídos e processadas para sequenciação isto sugere que há fragmentação de lincRNA e outra de ARN longa nos tecidos FFPE, que são mais de 40 nt.

Um total de 469-548 ( significa 519) diferentes microRNAs e seus precursores foram identificados em ambas as amostras congeladas e FFPE frescos. Determinou-se as percentagens de microARNs que têm mais do que uma diferença de 2 vezes da expressão entre as amostras congeladas e FFPE frescas correspondentes (Figura 5). Entre os diferentes casos, 69 a 145 transcrições de microRNA foram mais do que 2 vezes sobre-expressos em amostras congeladas frescas. 73 a 186 transcrições de microRNA foram mais de 2 vezes sobre-expressos em tecidos FFPE (Figura 5).

Correlação dos valores de expressão de microRNA de FFPE combinado e amostras congeladas

A seguir, determinou a correlação de valores de expressão de microRNA de amostras FFPE combinados e amostras congeladas frescas. Havia 250 microARNs detectadas em todas as amostras em estudo. Houve uma forte correlação entre os valores de expressão de microRNA em FFPE combinado e encaixe tecidos congelados frescos em todos os microRNAs e todos os casos (r = 0,85; Figura 6). Correlações entre microRNAs detectados a partir do mesmo tumor /paciente eram altas, com r variando 0,71-0,95 (figura 7) [25].

Apenas os 250 miRs sem dados em falta foram usados.

Cada ponto representa os valores de um microRNA expressão em um par frozen-FFPE fresco.

A média dos coeficientes de correlação de Pearson de valores de expressão microRNA individuais de FFPE e tecidos congelados foi de 0,46 (Figura 8), com apenas 41 microARNs maduros e precursores tendo coeficientes de correlação mais elevado do que 0,8 (tabela 2). O hotel procurado para identificar características que estão associadas com maiores coeficientes de correlação indicando invariância ao método de preservação de tecidos. Para testar se o nível de expressão de um dado microARN está associada com a correlação entre o tecido congelado fresco e FFPE, Fisher transformado (arctanh) correlações foram regredido para expressão significativo FFPE (figura 9). Não houve associação entre os valores de expressão e correlações entre os dados a partir de tecido congelado e FFPE observado. Em seguida, procurou entender se uma possível falta de variação de microRNAs individuais entre as repetições biológicas está resultando em correlações pobres. Fisher transformado correlações foram regrediu em log transformado FFPE variações. A análise de variância revelou que microARNs com maior variância têm correlações significativamente maiores de dados a partir de FFPE e tecidos congelados (Figura 10; arctanh (R) = 0,47 + 0,59 x log 10 (variância FFPE)), o que pode ser devido à presença da verdadeira biológica variação presente nestes microRNAs.

validação PCR de expressão microRNA

foram selecionados dois microRNAs (miR-21 e miR-19a) que eram expressaram maior em amostras congeladas do que em amostras de FFPE em nossos resultados microRNA sequenciamento para validação usando PCR (Taqman). Ambos miR-21 e miR-19a foram encontrados para também ser maior expresso em tecido congelado do que em amostras de FFPE combinados utilizando um ensaio de PCR (Figura 11), consistente com os nossos resultados da sequenciação.

amostras de ARN a partir de congelado fresco ( N = 8) e FFPE (n = 8) foram analisados ​​tecidos. Pequeno U6 ARN nuclear foi usado como referência. MiR-21 e miR-19a teve maior expressão em amostras congeladas frescas do que em amostras de FFPE, consistente com os resultados de sequenciamento.

Discussão

Os microRNAs como reguladores de expressão de genes parecem ter um importante papel na diferenciação de células de cancro [4], a proliferação de [26], metástase [27] e a apoptose [28]. Tem havido muitos esforços Profiling MicroRNA usando tecidos de cancro congelados [29] [30] [31]. amostras de tecido de cancro normalmente são arquivados após fixação em formalina e inclusão em parafina (FFPE) e tecido congelado está disponível apenas para uma minoria de casos nos arquivos de patologia e bancos de tecidos. Uma melhor compreensão da qualidade de microRNA resultados de sequenciamento de tecidos FFPE permitiria uma decisão mais informada a respeito de quando o uso de tecido FFPE para pequenos experimentos RNA sequenciação seria apropriado.

Neste estudo, foram analisados ​​RNA pequeno perfis de sequenciamento de oito pares de amostras congeladas e FFPE frescas combinadas de tecido de cancro utilizando a plataforma ABI Solid 4. tempo de armazenamento de até nove anos apareceu a não afectar o número de microRNAs detectáveis ​​em qualquer congelada de tecido FFPE neste estudo. A presença de maiores percentuais de não-microRNAs na fração de nucleotídeos menor do que 40 sugeridas nt que os tecidos FFPE são mais degradado, apesar de tudo. No entanto, esta degradação aparente não resultar em menos microARNs ser detectado em tecidos FFPE, sugerindo que uma abordagem de sequenciação pode superar degradação da amostra em algum grau. Embora pequenos RNAs em uma das oito amostras FFPE apareceu degradada, tal como sugerido pelos comprimentos de leitura reduzidas centradas em 17 nt em comparação com os outros oito FFPE e todas as oito amostras congeladas centradas em 21 nt, o número de alinhados lê e o número de microRNAs detectados em esta amostra degradada foram semelhantes para os dados de outras amostras, o que sugere que os dados obtidos a partir de amostras com o grau acima descrito de degradação não seria, necessariamente, de ser removido de todos os tipos de análise.

em geral, houve uma excelente correlação entre os valores de expressão de miRNA entre correspondido FFPE congelado e quando se combina todas as amostras e todos os microRNAs (fig. 6), ou quando se analisam todos os microRNAs dentro de pares de amostras individuais do paciente (Fig. 7). Esses resultados são consistiu com os relatórios anteriores, utilizando diferentes plataformas de sequenciamento sugerindo que as abordagens de sequenciamento pode resultar em boas correlações entre FFPE e amostras congeladas quando incluindo várias centenas de microRNAs [32] [33] [9] [34].

As correlações de valores de expressão microARNs individuais (ver Figs. 8, 9, 10) foram menores do que as correlações incluindo todos os microARNs (figs 6, 7). A razão subjacente a esta observação provavelmente é originário da associação identificada de coeficientes de correlação de microRNAs individuais e variância dos valores de expressão microRNA (fig 10). valores de expressão muito semelhante de um microARN individuais entre os oito casos (igual a baixa variância na Fig. 10) resultam tipicamente em coeficientes de correlação baixa porque a variação entre os dados congelado e FFPE é maior do que a variação de expressão entre os oito casos incluídos neste estude. Portanto, não é necessariamente surpreendente ter uma ampla distribuição de correlações de microRNAs individuais, analisados ​​em detalhe nas figuras 8, 9 e 10.

As limitações desta análise incluem a limitação do tamanho da amostra pequeno e trações de PCR em potencial e PCR vieses de seleção durante a amplificação no multiplex construção da biblioteca, baseado na PCR [35] [36]. Esta desvantagem deve ser superado pelo 3

rd geração de tecnologias de sequenciação, que se pensa não requerem amplificação da sequência alvo, mas mais detectar moléculas de ácido nucleico simples [37]. Além disso, a utilização de tecido adjacente para criar amostras combinadas para esta análise apresenta alguns efeitos da heterogeneidade do tecido e contribui provavelmente para as diferenças observadas entre as amostras congeladas e FFPE correspondentes. Em resumo, microARN sequenciação de tecidos FFPE é viável utilizando sequenciação à base de ligação e os valores de expressão de microRNA de pacientes individuais estão altamente correlacionados com os dados de expressão de tecidos congelados correspondentes. MicroRNAs com maior variância parecem ter uma maior correlação de seus valores de expressão em dados de tecidos congelados e FFPE combinados.

Reconhecimentos

Agradecemos Carlo M. Croce para discussões úteis.