Sumário

Snail1 é um fator de transcrição que induz a epitelial para mesenquimal (EMT). Durante EMT, células epiteliais perdem seus entroncamentos, reorganizar as suas citoesqueleto, e reprogramar a expressão do gene. Embora Snail1 é um repressor de destaque da transcrição E-caderina, seus papéis precisos em cada um dos fenômenos da EMT não são completamente compreendidos, particularmente em alterações do citoesqueleto. Estudos anteriores têm utilizado sistemas de genes knockdown para determinar as funções do Snail1. No entanto, a proteína incompleta knockdown é frequentemente associada a esses sistemas, que podem causar interpretação incorrecta dos dados. Para avaliar mais precisamente as funções de Snail1, geramos uma linha celular estável com uma ablação específica de Snail1 (Snail1 KO) usando o sistema CRISPR /Cas9n. células Snail1 KO mostram aumento da adesão celular, diminuição da aderência-substrato celular e migração celular, alterações à sua organização do citoesqueleto, que incluem algumas fibras de stress e abundante actina cortical e regulação positiva de genes marcadores epiteliais como a E-caderina, ocludina e claudin -1. No entanto, alterações morfológicas foram induzidos pelo tratamento de células Snail1 KO com a TGF-beta. Outros factores de transcrição que induzem EMT também foram induzidos por tratamento com TGF-beta. A supressão precisa da Snail1 pelo sistema /Cas9n CRISPR fornece evidências claras de que a perda de Snail1 provoca alterações no citoesqueleto de actina, diminui a aderência-substrato celular, e aumenta a adesão célula-célula. O tratamento de células RMG1 com TGF-beta sugere a redundância entre os fatores de transcrição que induzem EMT

Citation:. Haraguchi M, Sato M, Ozawa M (2015) CRISPR /Exclusão Cas9n-Mediated do caracol 1Gene (

SNAI1

) revela o seu papel na regulação da morfologia celular, interações célula-célula, e expressão genética no cancro do ovário (RMG-1) células. PLoS ONE 10 (7): e0132260. doi: 10.1371 /journal.pone.0132260

Autor: Michael Klymkowsky, Universidade do Colorado, Boulder, Estados Unidos

Recebido: 20 de dezembro de 2014; Aceito: 11 de junho de 2015; Publicação: 10 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Haraguchi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão. Grant number: 22590287 para MH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) é um processo comum que ocorre durante o desenvolvimento, a cicatrização de feridas e metástases de cancro. Durante EMT, células epiteliais perdem seus entroncamentos, mudar a sua forma, reorganizar as suas citoesqueleto, e reprogramar a expressão do gene [1]. Esta mudança na expressão do gene é induzida por várias master reguladores, incluindo a Snail1, torção, e zinc-finger ligação fatores de transcrição (Zeb) E-box. As suas contribuições para a indução de EMT dependem do tipo de célula e da via de sinalização que inicia EMT. Eles frequentemente controlar a expressão de um ao outro e funcionalmente cooperar em genes alvo [1]. EMT é regulada por vias de sinalização mediadas por várias citocinas, incluindo Wnt, Notch e factor de crescimento transformante beta (TGF) [2]. A via de sinalização de TGF-beta tem um papel dominante entre eles [1]. Após a indução de EMT por TGF-beta, factores de transcrição, tais como Snail1 são regulados positivamente [3]. O papel de Snail1 em EMT tem sido extensivamente estudada. Snail1 é um forte repressor de marcadores epiteliais como a E-caderina, os claudinas e os occludins. Por outro lado, Snail1 aumenta a expressão dos marcadores de mesenquimais, tais como fibronectina e vimentina [4], [5]. Confirmámos que Snail1 regula a adesão célula-matriz através da sua regulação da expressão de proteínas de integrina e da membrana basal, tais como as lamininas [6]. Snail1 é pensado principalmente para induzir EMT através da repressão directa de E-caderina, o que leva a translocação nuclear de beta-catenina e alterações adicionais nos transcrição [7]. a expressão do gene Snail1 é relatado para induzir alterações na forma e os movimentos das células [5]. Essas mudanças exigem alterações na organização da actina. No entanto, os mecanismos moleculares que controlam Dynamics F-actina durante EMT não são completamente compreendidos [1]. Recentemente, McGrail investigou o papel da Snail1 na reforma e actina dinâmica do citoesqueleto. Eles investigaram o efeito de Snail1 sobre a expressão de genes-actina do citoesqueleto-relacionada [8]. Nós também tentou esclarecer o impacto da Snail1 na forma da célula e conformação actina apagando Snail1 a partir de células RMG1.

A função de Snail1 foi avaliada em vários tipos de células cancerosas através da utilização de interferência de RNA (RNAi) [9]. No entanto, knockdown da expressão do gene alvo por RNAi é incompleta e temporária [10]. Para determinar o papel preciso de Snail1 durante a indução de EMT, nós empregamos um sistema de edição genoma romance chamado O sistema CRISPR /Cas9 consiste em dois componentes “cluster regularmente espaçadas Curtas Palindromic Repete (CRISPR) /9 (Cas9) associados a CRISPR” : a proteína Cas9 e um RNA de guia (gRNA). A proteína Cas9 possui actividade de nuclease e pode induzir quebras de cadeia dupla (DSB) em qualquer sequência de ADN genómico guiado por um gRNA, desde que um motivo de sequência adjacente protospacer (PAM) existe no locus alvo [11]. Na ausência de um modelo de reparação, são ligados por meio de um processo de junção de extremidade não-homóloga, que faz com que pequenas inserções ou deleções de mutações conhecidas como indels. Assim, CRISPR /Cas9 permite a interrupção genômica específica [12]. Estudos recentes têm mostrado que CRISPR /Cas9 pode ser altamente activa em células humanas, mesmo com as interfaces de ADN-ARN imperfeitamente correspondentes. Portanto, o sistema /Cas9 CRISPR pode induzir de alta frequência mutagénese fora do alvo em células de origem humana [13]. Para evitar fora do alvo de mutagénese, Ran et al [14] desenvolveu uma estratégia que combina a aspartae-para alanina (D10A) nickase versão mutante de Cas9 (Cas9n) com um par de gRNAs deslocamento complementares a cadeias opostas do local alvo. Cas9n DNA nicks para produzir quebras em cadeia simples. Estas pausas são preferencialmente reparado através de reparação dirigida por homologia, o que diminui a frequência de mutações InDel indesejáveis ​​resultantes de LAP fora do alvo [12]. Quando Cas9n é combinado com um par de gRNAs, duplo nicking causa DSB de apenas os loci genómico em que ambos os gRNAs se ligar a uma distância apropriada. Este aumenta efectivamente a especificidade de reconhecimento do alvo. Este sistema nicking dupla é relatado para reduzir a atividade fora do alvo por 50 a 1500 vezes em linhas de células [14].

Neste estudo, utilizamos o sistema /Cas9n CRISPR para bloquear especificamente a expressão Snail1 em humanos adenocarcinoma de ovário (RMG-1) células [15] e determinado o efeito deste knockout Snail (KO) na morfologia e função das células, bem como EMT induzida por TGF-beta.

Materiais e Métodos

Ética declaração

as experiências com tecnologia de DNA recombinante foram realizados de acordo com as orientações do Comitê Universidade do Kagoshima no DNA recombinante. O número de homologação de segurança é 26005.

linha de células e cultura

linha de células de adenocarcinoma de ovário mesonephroid Humano RMG1 [15] foi obtido a partir do JCRB (Coleção japonesa dos recursos biológicos de investigação, Osaka) Cell Bank e cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) (Nissui, Tóquio) suplementado com soro de vitelo fetal a 10% (FCS) (Nichirei Biosciences, Inc., Tóquio).

Anticorpos e reagentes

monoclonal de rato anticorpos (mAbs) contra a E-caderina humana (clone 36, BD Biosciences, San Jose, CA), Snail1 (L7042 clone, Cell Signaling, Danvers, MA) humana, vimentina humana (V9 clone, ZYMED, Carlsbad, CA), humano vinculina (clone hVIN-1, Sigma, St. Louis, MO), vitronectina humana (clone 342603, R D systems, Minneapolis, MN), fibronectina humana (clone 10 /fibronectina, BD Biosciences, San Jose, CA), conforme bem como anticorpos policlonais (pAb) contra humanos claudina-1 (clone MH25, Invitrogen, Waltham, MA), ocludina humano (clone Z-T22, ZYMED, Carlsbad, CA), integrina alfa 5 humano (Ag0860, número de catálogo 0569-1 -AP, Proteintech, Chicago, IL), beta-actina (número de catálogo GTX109639, Genetex, Irvine, CA), e alfa tubulina 4a (número de catálogo GTX112141, Genetex, Irvine, CA) foram comprados como indicado. Anti-rato e anti-coelho conjugados de IgG peroxidase de rábano (Jackson Immunoresearch Laborattories, Inc, West Grove, PA), rhodamine X-conjugado phalloidin (Wako, Osaka) e tiazolil brometo de azul de tetrazólio (MTT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) também foram comprados como indicado.

CRISPR /design plasmídeo Cas9

para selecionar a sequência alvo para edição genoma, a seqüência genômica Snail1 humana em torno do primeiro exão (NC_000020.11) foi submetido a uma ferramenta de design CRISPR on-line (https://tools.genome-engineering.org). Foram selecionados dois locais-alvo (Fig 1A) usando as regras descritas anteriormente [14]. Os oligonucleótidos usados ​​para construir gRNAs para o gene humano foram Snail1: 1s g (5′-snail1 caccgAGAGCGCGGCATAGTGGTCG-3 ‘), g-snail1 1R (5′-aaacCGACCACTATGCCGCGCTCTc-3′), 2S g-snail1 (5’-caccgGCCTAACTACAGCGAGCTGC -3 ‘) e 2R g snail1 (5′-aaacGCAGCTCGCTGTAGTTAGGCc-3’).

(a) Representação esquemática da estrutura do gene snail1 e sequências em torno do locus alvo. Caixas amarelas indicam exons que codificam a proteína Snail1. As caixas azuis indicam exons não-codificantes. As sequências alvo gRNA e domínios PAM são indicadas por sublinhado preto e vermelho, respectivamente. As setas indicam as localizações dos iniciadores de PCR. (B) As sequências genómicas em torno dos locais alvo de tipo selvagem (WT) e as células Snail1 KO1. (C) de forma de onda de dados a partir de um sequenciador de DNA exibindo a sequência obtida a partir de fragmentos de PCR de ADN genómico.

O optimizada por codão SpCas9 nickase humana e guia quimérico expressão do RNA vector pX335-U6-Chimeric_BB-CBH hSpCas9n (D10A), (não 42335, Addgene, Cambridge, MA) [16] foi digerido com

Bbs

I, (FD1014, Fermentas /Thermo Scientific, Waltham, MA) e, em seguida, um par de oligonucleótidos emparelhados para cada local alvo foi clonado no ARN de guia de acordo com um protocolo previamente descrito [12]. Estas construções foram designados pX335-Cas9-g snail1 1 e pX335-Cas9-g snail1 2, respectivamente.

CRISPR /engenharia Cas9n mediada do genoma da célula RMG1

células RMG1 (2 × 10

5) foram co-transfectadas com 3? g de pX335-Cas9-g caracol 1, 3 ug de pX335-Cas9-g caracol 2, e 1? g de pEGFP-N1 (Clontech, mountain View, CA) utilizando lipofectamina 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Dois dias após a transfecção, as células transfectadas foram repicadas e semeadas como colónias únicas (0,5 células /cavidade) em placas de 96 poços. No dia seguinte, G418 (concentração final de 1 mg /ml) foi aplicada a cada poço. Após 3-4 semanas de selecção, as colónias emergentes foram transferidas para placas de 24 cavidades para se expandir. Após 2-3 semanas de expansão, as células em cada colónia foram divididos ao meio; Uma metade foi sujeita a propagação e a outra metade foi utilizada para avaliar a expressão de Snail1 utilizando Western blotting. Cinco clones apresentaram uma redução significativa na expressão Snail1. Portanto, os DNAs genómicos destes clones foram isolados. Os fragmentos de ADN (182 pb de tamanho) que cobriam as regiões alvo gRNA foram amplificadas utilizando PCR. Os iniciadores -57F (5′-GAGTGGTTCTTCTGCGCTAC-3 ‘) e 125R (5′-CCCACGCAGCCTTCGCCTGT-3’) foram usadas para PCR. Os produtos de PCR foram verificados utilizando electroforese em gel, purificado utilizando o kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen, Hilden Alemanha), e directamente sequenciado para detectar a mutação de deleção. Os produtos de PCR a partir de 5 clones continham mutações por supressão. Para confirmar se estas colónias apresentam mutações em ambos os alelos (as chamadas bi-alélico KO), esses produtos de PCR foram sub-clonados no vector pGEM-T Easy (Promega Fitchburg, WI) e amplificado num hospedeiro bacteriano; em seguida, o ADN plasmídico a partir de colónias individuais foi sequenciado.

A transfecção de células com Snail1 KO Snail1 (experiência de recuperação)

células Snail1 KO (2 × 10

5) foram transfectadas com 2,5 ug marcada com HA de plasmídeo Snail1 humana (pCAGGS-Snail1 HA) usando Lipofectamine 2000 ou polietilenoimina max (Polysciences Inc., Warrington, PA). Fomos capazes de transfectar transitoriamente células Snail1 KO com Snail1, no entanto, não fomos capazes de transfectar estavelmente células Snail1 KO com Snail1.

Western blot

Western blot foi realizada como descrito anteriormente, com menor modificações [6]. As células foram fervidas durante 5 min em dodecil sulfato de sódio tampão de amostra de gel (SDS). quantidades idênticas de proteína foram separados por electroforese em gel de poliacrilamida a 10%, e foram transferidos para membranas de nitrocelulose (Protran BA83, Whatman 0,2 um, GE Healthcare, Wauwatosa WI). As membranas foram bloqueadas com leite magro a 5% em solução salina tamponada com Tris (TBS), e foram então incubadas com anticorpos primários específicos (1: 1000) durante a noite. Isto foi seguido por tratamento com anticorpos secundários conjugados com peroxidase. Após a lavagem com TBS, bandas de proteína foram visualizadas por quimioluminescência aumentada (ECL) (PRN 2106, GE Healthcare, Wauwatosa WI).

Imunofluorescência coloração

As células foram cultivadas em lamelas durante 48 horas e fixa com paraformaldeído a 3% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (-) durante 30 min à temperatura ambiente. O citoesqueleto foi visualizado por coloração com rodamina faloidina X-conjugado em PBS (-) contendo 0,1% de Triton X-100 durante 30 min à temperatura ambiente. As células foram analisadas utilizando um microscópio confocal de varrimento a laser (Carl Zeiss LSM700).

Isolamento de ARN e análise em tempo real de PCR

O ARN total foi extraído utilizando ISOGEN II (Wako, Osaka) e reversa transcrita usando ReverTra Ace transcriptase reversa (Toyobo, Osaka). O cDNA resultante foi sujeito a quantitativo RT-PCR (qRT-PCR) utilizando Syber pré-mistura Ex Taq (PR820, Takara Bio, Ohtsu). qRT-PCR foi realizado usando o sistema Passo Um Mais PCR em tempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os níveis de expressão foram quantificadas usando o método ΔΔCt com

GAPDH

como o calibrador. Os iniciadores utilizados nesta análise estão listados na Tabela 1.

Anexo ensaio

O ensaio de ligação foi realizado como descrito anteriormente, com ligeiras modificações [6]. As células foram lavadas e incubadas com 0,125% de tripsina-EDTA a 0,01% durante 10 min à temperatura ambiente. As células destacadas foram colhidas e suspensas em DMEM suplementado com FCS a 10%. As células (1,5 x 10

4) foram semeadas em placas não revestido de 96 poços ou de placas de 96 poços que tinha sido pré-incubadas com DMEM contendo 10% de FCS. O mesmo número de células foi semeado em placas de 96 poços que foram pré-revestidas com poli-lisina para normalização. Após 4 h de incubação, as células não aderentes foram removidas por lavagem e as células aderentes foram fixadas com etanol a 70% durante 20 min. Após a coloração com uma solução a 0,1% de violeta de cristal em PBS durante 30 min, as células foram lavadas e, em seguida, dissolvido usando 0,5% Triton X-100 em PBS. A densidade óptica das células dissolvidos foi medida a 595 nm. O número de células em anexo foi calculada utilizando uma curva padrão (número de células versus valores de absorvância). A proporção de células ligadas foi expressa como o número de células ligadas em poços não-revestidos ou pré-incubados divididas por aqueles em poços revestidos com poli-lisina.

ensaio Scattering

O ensaio de dispersão foi realizada como anteriormente descrito, com modificações de menor importância [17]. As células foram lavadas e incubadas com 0,125% de tripsina-EDTA a 0,01% durante 10 min à temperatura ambiente. As células destacadas foram colhidas e suspensas em DMEM suplementado 10% de FCS. As células (1,5 x 10

4) foram semeadas em placas de 96 poços. Após 72 horas de incubação, espalhamento de células foi examinada por microscopia de contraste de fase. espalhamento celular foi quantificada pela contagem do número de células isoladas a partir de colónias em imagens de contraste de fase seleccionados aleatoriamente. O número relativo de dispersão foi avaliada através da divisão do número de células derivadas de espalhamento Snail1 KO1 ou a partir de células Snail1 KO1 + Snail1 pelo número de células que dispersam a derivados de células do tipo selvagem (WT).

ensaio de dissociação

O ensaio de dissociação foi realizado como anteriormente descrito, com modificações de menor importância [18]. As células (5 × 10

4) foram semeadas em placas de 24 poços e cultivadas em DMEM com ou sem TGF-beta. Depois de atingir a confluência, as células foram lavadas e incubadas com 0,125% de tripsina ou 0,125% de tripsina-EDTA a 0,01% durante 10 min a 37 ° C. As células separadas foram cuidadosamente lavadas com PBS (-) e submetidos a tensão mecânica por pipetagem com uma pipeta de 1 mL por cinco vezes. Os fragmentos celulares foram fixadas com paraformaldeído a 3% durante 20 minutos e coradas com violeta de cristal (Sigma Aldrich, St Louis MO). Após lavagem cuidadosa, o número de partículas por campo foi contado (mínimo de cinco campos diferentes). O número relativo de partículas é representado pelo número de partículas de células fragmentadas derivadas do tipo de célula específico dividido pelo número de partículas de células derivadas de células fragmentadas WT cultivadas sem TGF-beta.

ensaio de migração

O ensaio de migração foi realizada como descrito anteriormente, com ligeiras modificações [6]. Os ensaios de migração foram efectuados em câmaras Transwell com tamanho de poro 8um (Corning, 3422, Tewksbury MA). Resumidamente, 0,1 ml de células (4 x 10

5 células /ml) em DMEM suplementado com albumina de soro bovino 0,1% (BSA) foram semeadas em poços superiores. Nos poços inferiores, 0,6 ml de DMEM suplementado com BSA a 0,1% contendo 2,5% de FCS foi adicionado. Após 4 h de incubação, as células não migratórias na superfície superior da membrana foram completamente limpo fora e 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) (concentração final 0,5 mg /ml) adicionou-se nas cavidades inferiores e incubou-se durante 3 h. As células migratórias ligados à superfície inferior da membrana, contendo manchas azuis de formazano formados. Esses pontos foram fotografadas e contadas. O número relativo de células que migraram é representado pelo número de células que migraram do tipo de célula específico dividido pelo número de células migradas WT cultivadas sem TGF-beta.

Análise estatística

Análise estatística dos amostras independentes foram realizadas utilizando o teste t de Student. Os dados são expressos como a média ± S.E.M. Dois níveis de significância estatística são indicadas por asteriscos (**

P Art 0,05 e *

P Art 0,01).

Resultados

Geração de células Snail1 KO que utilizam o sistema /Cas9n CRISPR

para determinar os papéis de Snail1 durante a indução de EMT, utilizou-se o sistema CRISPR /Cas9n para gerar linhas celulares estáveis ​​que exibem RMG1 ablação do gene que codifica Snail1. células RMG1 foram co-transfectadas com pX335-Cas9-g snail1 1, que realizada sequência alvo 1, pX335-Cas9-g snail1 2, que realizada sequência alvo 2, (figura 1A) e pEGF-N1, que realizado um G418 resistência marcador. Cerca de 50 colónias foram analisadas após selecção com G418. Metade das células em cada colónia foram lisadas, e, em seguida, o lisado foi utilizado para avaliar a expressão Snail1 por western blotting. Cinco clones apresentaram uma redução significativa na expressão de Snail. Portanto, o ADN genómico foi isolado a partir de cada um destes clones. Os fragmentos de ADN que abrangem tanto regiões alvo gRNA foram amplificados e os produtos de PCR resultantes foram sujeitos a sequenciação directa. Cada um destes produtos de PCR tinham mutações de deleção. Para confirmar se ambos os alelos tinha mutações de deleção, os produtos de PCR foram clonados num vector pGEM-T e amplificado num hospedeiro bacteriano. O DNA de plasmídeo isolado a partir de várias colónias que surgiram a partir de cada produto de PCR foi sequenciado. Dois clones mostrou 24 eliminações pb em ambos os alelos (Fig 1B e 1C). Nós designado estes clones Snail1 KO1 e Snail1 KO2. Cada uma das restantes três clones continham um alelo WT. Porque Snail1 KO 1 e Snail1 KO2 tinha a mesma deleção, utilizou-se células Snail1 KO 1 nas experiências seguintes. A ausência de expressão em células Snail1 Snail1 KO 1 foi confirmada por quantitativa PCR em tempo real (Figura 2B) e Western blot (Fig 2C).

(A) Imagens representativas que apresentam a morfologia de células de tipo selvagem ( WT) células RMG (I), as células Snail1 KO1 (II). As células são visualizados por microscopia de contraste de fase. A barra de escala indica 50 um. células WT apresentaram morfologias de paralelepípedo semelhante, ao passo que a maioria das células Snail1 KO1 exibem uma morfologia mais redonda. Imagens representativas dos citoesqueletos actina de células WT células (III) Snail1 KO1 (IV) coradas com X-rodamina faloidina conjugada e visualizado usando um microscópio confocal de varrimento laser (Zeiss LSM700). Fotos de 5 a 10 imagens por amostra foram tomadas. As experiências foram repetidas 5 vezes. células WT são ricos em fibras de stress, enquanto que as células Snail1 KO1 têm fibras de stress escassos, mas actina cortical em suas superfícies celulares. A barra de escala indica 20 um. (B) RT-PCR quantitativa de genes indicados em células do tipo selvagem (wt), células RMG Snail1 KO1, e células Snail1 KO1 transientemente transfectadas com um vector de expressão (células Snail1 Snail1 KO1 Snail1 +). Os valores são expressos como a média ± S.E.M de amostras em triplicado. As experiências foram repetidas três vezes. A significância estatística é indicado por um asterisco (*

P Art 0,05 e **

P Art 0,01 usando Students ‘

t

-teste). células Snail1 KO1 mostrou uma perda total de expressão Caracol e aumento da expressão de

E-caderina

,

claudin-1