evidências

Abstract

Acumulando indica que microRNAs (miRNAs) são anormalmente expressos em câncer humano e contribuir para a tumorigênese, mas seus papéis no cancro do pâncreas são ainda desconhecidos. Neste estudo, os nossos dados mostraram que o miR-130b foi significativamente regulada negativamente em 52 pares de tecidos de cancro do pâncreas e cinco linhagens de células. Além disso, o miR-130b desregulamentado se correlacionou com pior prognóstico, aumento do tamanho do tumor, estágio tardio TNM, invasão linfática e metástases à distância. A análise multivariada mostrou que a expressão de miR-130b foi um preditor prognóstico significativo e independente para pacientes com câncer pancreático. Estudos funcionais indicam que a sobre-expressão de miR-130b suprimiu significativamente a proliferação de células de cancro do pâncreas, tanto in vitro e in vivo, que pode ser atribuídos à indução da apoptose e paragem do ciclo celular na fase S. Enquanto isso, um overexpressed miR-130b significativamente inibida a capacidade invasiva de células de cancro do pâncreas. Além disso, o ensaio da luciferase dupla revelou que a STAT3 foi directamente alvo de miR-130b, o qual foi adicionalmente confirmada pela expressão inversa de miR-130b e STAT3 em amostras de cancro pancreático. Nossos achados sugerem que miR-130b pode ter um potencial considerável na identificação prognóstico e aplicação da terapia para câncer de pâncreas

Citation:. Zhao G, Zhang Jg, Shi Y, Qin Q, Liu Y, Wang B, et ai. (2013) miR-130b é uma célula Proliferação prognóstico marcador e inibe e Invasion no cancro do pâncreas através da segmentação STAT3. PLoS ONE 8 (9): e73803. doi: 10.1371 /journal.pone.0073803

editor: Johannes Haybaeck, Médico da Universidade de Graz, Áustria

Recebido: 31 de dezembro de 2012; Aceito: 24 de julho de 2013; Publicação: 10 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do Comitê da National Science Foundation (NSFC) da China (números de subvenção 30972900 e 30600594). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MicroRNAs são RNAs não-codificantes endógenos constituído por cerca de 22 nucleótidos. MicroRNAs pode regular negativamente a expressão genética através da ligação a sequências parcialmente complementares no mRNA-alvo específico a região 3 ‘não traduzida (UTR), que podem resultar ou na degradação ou inibição de tradução de ARNm [1]. Algumas evidências indicam que miARNs são expressas de forma aberrante em diferentes tipos de tumores e participar na tumorigénese e /ou metástase humano por oncogenes segmentação directamente ou genes supressores de tumor [2] -. [4]

o cancro do pâncreas é um dos malignidades mais letal. Apenas 10-20% dos pacientes diagnosticados com câncer de pâncreas são ressecáveis ​​e em geral a taxa de sobrevida em 5 anos é de apenas 5%, devido à sua alta taxa de recorrência, apesar dos tratamentos multimodalidade [5], [6]. Como outros tipos de câncer, o desenvolvimento de câncer de pâncreas é um processo de várias etapas com acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas. expressões miARN alteradas, tais como o miR-34a, miR-21 e miR-20a, têm sido identificados como moduladores do crescimento celular, apoptose, migração ou invasão do cancro do pâncreas em [7] – [9]. Portanto, as investigações mais amplas são necessárias sobre o papel dos miRNAs, que estão desregulados em câncer pancreático, a fim de elucidar a função de miRNAs em câncer pancreático.

estudos Microarray identificaram um número de microRNAs que foram desregulados no pâncreas cancro, incluindo miARN-130b [10] – [12]. Até à data, miR-130b, foi encontrada a ser desregulamentado em alguns tipos de cancros incluindo a ser sobre-expresso em cancro gástrico [13], [14], glioma [15] e câncer de células renais [16], enquanto está a ser reprimidos no câncer de endométrio [ ,,,0],17] e carcinoma de tireóide papilar [18]. No entanto, não há estudos específicos foram realizados para revelar o papel de miR-130b no cancro pancreático. Assim, nosso estudo teve como objetivo identificar o papel de miR-130b em câncer pancreático. No presente estudo, foram analisados ​​a expressão de miR-130b entre o câncer pancreático e os tecidos pancreáticos adjacentes normais. Além disso, a proliferação e invasão foram avaliados em PANC-1 e ASPC-1 células após ser transfectadas com miR-130b.

A nossa pesquisa identificou ainda mais o potencial alvo direto pelo qual o miR-130b exercido sua função no pâncreas células cancerosas. O software de previsão microARN indicou que o transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) pode ser o alvo a jusante de miR-130b. STAT3 é um factor de transcrição citoplásmica chave que é activado por um crescimento de tirosina-quinase e receptores de citoquinas. STAT3 desempenha um papel importante na mediação de vários processos biológicos, incluindo: a proliferação, a diferenciação e a apoptose [19]. STAT3 foi identificada como um factor chave oncogénica num certo número de doenças malignas e é necessário para a oncogénese na pele e cancros gástricos [20], [21]. No cancro do pâncreas, a activação da STAT3 promoveu o crescimento de células tumorais e invasão, o que levou à sobrevivência do paciente pobre [22]. Além disso, STAT3 knockdown inibiu o crescimento celular e invasão no câncer de pâncreas ambos

in vitro

e

in vivo

, e diminuiu acentuadamente VEGF e MMP-2 expressões [23], [24]. Portanto, o ensaio de luciferase duplo foi aplicado para identificar se STAT3 foi directamente alvo de miR-130b. Além disso, a correlação entre a expressão de miR-130b e STAT3 em amostras de câncer de pâncreas foi explorado.

Materiais e Métodos

Pacientes e tecidos tumorais

Um total de 52 tecidos humanos cancro do pâncreas (PC) e tecidos pancreáticos adjacentes normais pareados (NP) foram obtidos durante a cirurgia no pâncreas Instituto de Doenças, União Hospital (Wuhan, China) entre janeiro de 2007 e dezembro de 2009. o diagnóstico foi baseado na evidência patológica e os espécimes foram imediatamente snap-congelados. Elas foram armazenadas a -80 ° C para futuro miR-130b e extracção STAT3. Nenhum dos pacientes recebeu quimioterapia ou radioterapia antes da excisão cirúrgica. Todos os 52 pacientes forneceram consentimento informado para o uso de seus tecidos e o protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia de Ética, eo número de aprovação ética foi S214.

quantitativo em tempo real Transcrição reversa-Reacção em Cadeia da polimerase (qRT-PCR)

O ARN total foi isolado a partir de tecidos de cancro do pâncreas ou células usando Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, EUA). MiR-130b e U6 foram poliadenilado utilizando poli-A polimerase baseada kit First-Strand Synthesis (Takara Bio, Japão) seguindo o protocolo do fabricante. Para quantificar os níveis de mRNA da GAPDH e STAT3, 1 ug de ARN total foi submetido a síntese da primeira cadeia de ADNc durante 15 min a 37 ° C e 5 s a 85 ° C, utilizando um kit de RT PrimeScript Reagente (Takara). A qPCR foi realizado utilizando SYBR Green PCR master mix (Takara) na 7500HT sistema ABI. O U6 ou GAPDH foram utilizados como um controlo endógeno. As expressões vezes relativamente foram calculados com o método -ΔΔCT 2

. Todas as reacções de qRT-PCR foram realizadas em triplicado. A lista de iniciadores utilizados nas reacções é apresentada na Tabela S1.

Linhas Celulares e Cultura

o cancro pancreático humano PANC-1, ASPC-1, MiaPaCa-2, BxPC-3 e SW1990 As linhas celulares foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos (100 U /ml de penicilina e 100 ug /sulfato de estreptomicina mL). As células foram cultivadas numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO2.

A transfecção

Os microARNs foram concebidos e sintetizados por RiboBio (Ribobio Co., Cantão, China). A transfecção foi realizada utilizando microARN Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As células de cancro pancreático foram semeadas em placas de 12 poços e foram crescidas até 40% de confluência antes da transfecção. O ARN e proteínas foram extraídos às 48 h após a transfecção. A concentração final de miR-130b mímico e anti-miR-130b era de 50 nM. Lentivirus miR-130b (LV-miR-130b) e vazio vector lentiviral (LV-NC) foram construídos por Genechem Company (Xangai, China) e foram usados ​​para transfectar as células de cancro do pâncreas de acordo com as instruções do fabricante. Todas as sequências de oligonucleótidos utilizados nesta experiência são listados na Tabela S2.

Ensaios de Proliferação de Células

A proliferação celular foi determinada por ensaios MTT. Resumidamente, as células de cancro do pâncreas (5 × 10

3 por poço) foram plaqueadas em placas de 96 poços em meio RPMI 1640 e 10% de FBS. Após 24 h de estar na cultura, as células foram transfectadas com 50 nM imita o miR-130b, anti-miR-130b e seu respectivo controle usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As células foram então cultivadas em meio durante mais 48 h e foram avaliados por um ensaio colorimétrico utilizando uma solução de MTT (5 mg /mL) a 570 nm. Todos os experimentos foram realizados três vezes, com cinco repetições.

Avaliação da apoptose e ciclo celular Distribuição

taxa de apoptose e estágio do ciclo celular foram determinadas pelo fluxo FACS citometria relatado como anteriormente [25]. Para a análise da apoptose, as células foram recolhidas, lavadas duas vezes com fosfato frio solução salina tamponada (PBS) e ressuspensas em tampão de ligação a uma densidade celular de 1 x 10

6 /mL. As células foram então coradas com anexina V-FITC e iodeto de propodium de acordo com o protocolo do fabricante. O sinal foi adquirido por um fluxo FACS Calibur citômetro (BD Biosciences) e foi analisado com software Cellquest. Para a análise do ciclo celular, as células foram recolhidas por tripsinização, lavadas duas vezes com PBS frio e fixadas em etanol a 70% durante a noite a -20 ° C. Em seguida, as células foram tratadas com solução de coloração de ADN contendo 3,4 mM de Tris-Cl (pH 7,4), iodeto de propodium, 0,1% de Triton X-tampão 100 e /ml de RNase A. A análise do ciclo celular foi realizada de 100 ug com o fluxo de citometria de FACS.

Matrigel invasão Ensaio

a câmara de invasão de Matrigel foi usada para avaliar a capacidade de invasão de células (placas de 24 poços, 8 mm de tamanho de poro, Corning), como previamente descrito [26]. Em resumo, as células (5 × 10

4) foram semeadas na câmara superior a 37 ° C com os meios contendo 0,1% de albumina de soro de bovino, enquanto que os meios contendo 20% de soro fetal de bovino foi colocada no poço inferior. Após 48 horas, as células foram removidas noninvading com cotonetes de algodão. células invasivas na parte inferior da membrana foram coradas com violeta de cristal a 0,1% e foram contadas sob observação microscópica. Os ensaios foram realizados em triplicado e foram repetidas três vezes.

Análise Western Blot

células de cancro pancreático foram recolhidas após 48 horas de tratamento com 50 nM de miR-130b mímica ou anti-miR-130b e controlos correspondentes. Extracção de proteínas, electroforese em gel de SDS-PAGE e transferência foram realizadas como anteriormente descrito [27]. Várias diferentes anticorpos primários foram utilizados, incluindo: STAT3 (Cell Signaling Technology, Danvers, EUA) e GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EUA). As incubações foram realizadas anticorpo secundário durante 2 h a temperatura ambiente e de proteína foram visualizadas bandas sobre a película de raios-X utilizando um substrato de quimioluminescência ECL melhorada.

duplo de Luciferase Assay

experiências

co-transfecção eram realizado em placas de 96 poços. Um total de 1 × 10

4 células foram semeadas por poço em 200 ul de meio. Um total de 100 ng de tipo selvagem (wt) ou mutante (MUT) construções repórter foram co-transfectados com lipofectamina 2000 reagente de transfecção para as células de cancro do pâncreas com 50 nM de miR-130b ou miR-CN de acordo com as instruções do fabricante. Após 48 h, a actividade da luciferase foi medida com o sistema de ensaio repórter de Dual-Luciferase (Promega). atividade luciferase Firefly foi seguida normalizada para a actividade da luciferase Renilla correspondente.

Xenoenxerto Modelo do cancro do pâncreas

Quatro semanas de idade camundongos nu feminino (BALB /c-nu) foram usados ​​para examinar a tumorigenicidade . Um total de 100 uL de células (soluções contendo 1,5 × 10

7 PANC-1 de células) foram injectados por via subcutânea no flanco direito dos ratos. O tamanho do tumor foi medido com uma craveira de quatro em quatro dias e os volumes dos tumores foram calculados utilizando a seguinte fórmula: comprimento x largura

2 × 0,5 [28]. O uso de ratos pelados cumpriu com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e o estudo foi aprovado pelo Animal Care e Use Committee of Tongji Medical College da Universidade Huazhong da Ciência e Tecnologia.

Análise Estatística

a expressão de miR-130b foi comparado em tecidos de cancro do pâncreas e células por teste t de Student não pareado. As relações entre miR-130b e os parâmetros clínico-patológicas foram avaliadas por χ

2 de teste. As taxas de sobrevivência para a expressão de miR-130b foram estimadas usando o método de Kaplan-Meier ea diferença de curvas de sobrevivência foram testadas pelo teste de log-rank. Os dados de sobrevivência foram avaliados usando uma análise de regressão multivariada de Cox. A relação entre o miR-130b e expressão STAT3 foi explorada por correlação de Spearman. Todas as análises estatísticas foram realizadas por software SPSS13.0 e os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (SD). A p inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Significância Correlação de miR-130b em pacientes com câncer pancreático

Usando um método qRT-PCR, foi detectado miR-130b em todos os 52 pares de tecidos do cancro do pâncreas e dos seus tecidos pancreáticos não cancerosos correspondentes, bem como linhas de células do cancro do pâncreas. Como mostrado na Fig. 1A, 45 tecidos PC apresentou baixa expressão de miR-130b, em comparação com os tecidos que de NP e a mudança de dobragem mediana foi de 1,86 (P 0,01). Enquanto isso, a expressão de miR-130b foi significativamente diminuído em todos os cinco linhagens de células do cancro do pâncreas examinadas quando comparada com a das amostras de pâncreas normal (Fig. 1B).

(A) O nível de expressão relativa de miR-130b em tecidos humanos cancro do pâncreas (n = 52) e tecidos pancreáticos não cancerosas adjacentes combinados (n = 52). PC: tecidos de câncer de pâncreas; NP: tecidos pancreáticos não cancerosas adjacentes. (B) O nível de expressão de miR-130b em cinco linhas de células do cancro do pâncreas (PANC-1, ASPC-1, MiaPaCa-2, BxPC-3) e SW1990. Os dados são apresentados em linhas celulares do cancro do pâncreas em relação ao controlo. Não havia nenhuma linha de células de pâncreas normal, por isso escolhemos aleatoriamente três tecidos pancreáticos normais como controle. U6 foi usado como o controlo para o carregamento de ARN e miARN abundância foi normalizada para a do ARN U6. curvas (C) de Kaplan-Meier de a sobrevida de 52 pacientes com cancro pancreático foram marcados como nível de expressão baixo (abaixo do valor médio, N = 26) e o nível de expressão elevada (acima do valor médio, N = 26) de acordo com o miR expressão -130b. A regulação negativa miR-130b foi significativamente correlacionada com uma menor sobrevida global. Os valores P são mostrados com o uso do teste log-rank. (D) A χ

2 Análise da relação entre miR-130b e invasão /metástase em pacientes com câncer pancreático. *. P 0,05; **. P . 0,01

Além disso, a correlação de miR-130b regulação baixa correlação com o prognóstico do câncer de pâncreas foi investigada. Foi estudada a correlação entre a expressão de miR-130b e características patológicas clínicos de câncer pancreático. O grupo expressão de miR-130b baixo apresentaram uma maior incidência de maior tamanho do tumor (P = 0,001), fase tardia TNM (P = 0,005), invasão linfática (P = 0,012) e metástases à distância (P = 0,012). No entanto, não foram observadas diferenças significativas em relação ao sexo, idade, localização do tumor, grau histológico ou infiltração navio em câncer pancreático (Tabela 1). Além disso, a análise de sobrevivência Kapan-Meier revelou que os pacientes com uma expressão de miR-130b baixo tiveram um prognóstico significativamente pior do que aqueles com uma expressão elevada (Fig. 1C). Como mostrado na Fig. 1D, o χ

2 análises mostraram que os pacientes com uma expressão de miR-130b inferior foram mais frequentemente associado com a invasão tumoral e metástase. Além disso, pacientes com invasão de tumores e metástases tinha uma expressão significativamente mais baixa de miR-130b. Enquanto isso, a análise multivariada de Cox mostrou que a expressão de miR-130b, estágio TNM e metástases à distância foram significativamente associados com a sobrevida global de pacientes com câncer pancreático como fatores prognósticos independentes (Tabela 2). Estes resultados mostraram que a desregulamentação miR-130 foi correlacionada com um prognóstico pior e estava envolvido na invasão /metástase de câncer de pâncreas.

miR-130b suprimiu a proliferação celular tanto

em

vitro Comprar e

In vivo

a fim de identificar os efeitos de miR-130b em células de câncer de pâncreas, nós transfectadas PANC-1 e células ASPC-1 com 50 nm imita miR-130b, anti-miR-130b e seus respectivos SAE. Como mostrado na Fig. 2A, os imitadores de miR-130b causou um aumento de 63,32 e 28,75 vezes na expressão de miR-130b em células PANC-1 e ASPC-1, respectivamente. Enquanto isso, o anti-miR-130b diminuiu a expressão de miR-130b por 2,34 e 2,88 dobras em PANC-1 e células ASPC-1, respectivamente. Após a transfecção com imita o miR-130b, a proliferação foi significativamente inibida na PANC-1 e células ASPC-1 por 30,35 ± 2,90% e 22,03 ± 7,64%, respectivamente (P 0,01). No entanto, o anti-miR-130b promoveu o crescimento das células PANC-1 e ASPC-1 por 15,23 ± 7,40% e 16,70 ± 3,56%, respectivamente (P 0,01; Fig. 2B).

(A) o nível de miR-130b expressão foi testada durante 48 h em células de cancro do pâncreas transfectadas com miR-130b imita (miR-130b), anti-miR-130b e respectivas NCS (50 nM) por qRT-PCR. (B) O efeito de transfecção transiente de miR-130b ou anti-miR-130b (50 nM) durante 48 h, foi examinada no crescimento de PANC-1 e células ASPC-1 pelo ensaio de MTT. (C) O miR-130b inibiu a tumorigenicidade no modelo de ratos de xenotransplante nu. O LV-miR-130b ou LV-NC foi transfectado em células PANC-1 na presença do vírus a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20. As células infectadas PANC-1 foram então injectados subcutaneamente em ratinhos nus. As curvas de crescimento do tumor e as fotografias dos tumores excisados ​​em 32 dias pós-implantação são apresentados como se indica. Os dados estão representados como a média ± DP de 10 ratinhos. (D) Os níveis de expressão de miR-130b foram analisados ​​em tumores excisados ​​por qRT-PCR e foram normalizados ao do controle endógeno (U6 ARN). Os dados são apresentados como a média ± DP de 10 ratinhos. *. P 0,05; **. P 0,01 em comparação com o controle

Para confirmar ainda mais as conclusões acima, um

in vivo

modelo de tumor foi construído através da implantação de células PANC-1 transfectadas com LV-miRNA. -130b ou um controlo negativo. Durante todo o período tumorigénico, tumores a partir de células transfectadas de miR-130b cresceu significativamente mais lenta (Fig. 2C). A expressão de miR-130b em tumores de xenoenxerto de grupo LV-miR-130b foi obviamente maior do que a do grupo de controlo (Fig. 2D). Estes resultados demonstraram que o miR-130b inibiu a proliferação de células de câncer de pâncreas, tanto

in vitro

e

in vivo

.

miR-130b induzida apoptose e ciclo celular prisão em pâncreas câncer Cells

Para investigar os mecanismos de inibição de miR-130b sobre a proliferação de células de cancro pancreático, analisou-se a apoptose e o ciclo celular nas células transfectadas PANC-1 e ASPC-1 utilizando citometria de fluxo. Os imitadores de miR-130b aumentou significativamente a taxa de apoptose em PANC-1 (3,57 ± 0,83%

vs.

11,17 ± 1,96%) e as células ASPC-1 (6,17 ± 1,66%

vs.

12,30 ± 1,30%) quando comparada com a do miR-NC (Fig. 3A e 3C). Além disso, os imitadores de miR-130b reduziu significativamente a proporção da fase G0 /G1 e G2 /M fases. Além disso, aumentou a proporção de fase S em PANC-1 (24,13 ± 4,10%

vs.

41,54 ± 3,80%) e as células ASPC-1 (23,52 ± 3,33%

vs.

47.66 ± 2,04%) quando comparada com a dos controlos (Fig. 3B e 3D).

() células PANC-1 e ASPC-1 foram transfectadas com um miR-130b ou miR-NC (50 nM) durante 48 h e a apoptose foi medida por coloração de anexina V e citometria de fluxo. (B) O PANC-1 e células ASPC-1 foram tratados como indicado acima e a distribuição do ciclo celular foi medida por coloração de PI e citometria de fluxo. Análise citométrica de fluxo dos efeitos de miR-130b apoptose induzida por (C) e a paragem do ciclo celular (D). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão dos resultados a partir de 3 experiências independentes. **. P 0,01 em comparação com o controle

miR-130b inibiu o celular do cancro do pâncreas Invasividade

O efeito de miR-130b sobre a capacidade de invasão de células de câncer pancreático foi investigada por Matrigel invasão. ensaios. Descobrimos que o número de invasores células PANC-1 transfectadas com os imita miR-130b (57 ± 5 células /HP, HP: campo de aumento de alta potência) era notavelmente menor do que o número daqueles transfectadas com miR-NC (122 ± 9 células /HP; A Fig. 4A). Resultados semelhantes também foram obtidos para a capacidade de invasão de células ASPC-1 transfectadas com os imitadores de miR-130b (Fig. 4B). É revelado que o miR-130b mediada a capacidade de invasão de células de cancro pancreático.

(A) As células PANC-1 foram transfectadas com miR-130b ou miR-NC (50 nM) durante 48 h e a capacidade de invasão de células foi medido por ensaios de invasão de Matrigel. (B) As células ASPC-1 foram tratadas como acima e a capacidade de invasão de células foi medida por ensaios de invasão de Matrigel. A quantificação foi efectuada por contagem das células marcadas PANC-1 e ASPC-1 que invadiram para a câmara inferior sob um microscópio de luz. Todos os resultados foram reprodutíveis em três experiências independentes. **. P . 0,01 como comparado com o controlo

STAT3 pode ser o alvo directo de

miR-130b

Para explorar o potencial alvo através da qual o miR-130b inibe a proliferação e invasão de células de câncer de pâncreas, aproveitamos bioinformática para prever os alvos miR-130b putativos usando TargetScan, Miranda e PicTar algoritmos. A nossa análise identificou STAT3, um oncogene chave, como um dos alvos potenciais para miR-130b. Além disso, as sequências alvo de STAT3 3’UTR (tipo selvagem, WT) ou da sequência mutante (tipo mutante, MUT) foram clonados no vector repórter de luciferase, respectivamente (Fig. 5A). Os nossos resultados mostraram que o miR-130b diminuiu significativamente a actividade de luciferase de pirilampo, no repórter com o tipo selvagem 3’UTR, mas a actividade do mutante vector 3’UTR permaneceram inalterados (Fig. 5B). As células PANC-1 foram adicionalmente transfectadas com o miR-130b e foram examinadas quanto à expressão de STAT3 por qRT-PCR e Western blot. Como mostrado na Fig. 5C, a transfecção de miR-130b conduziu a uma diminuição óbvia em ARNm e a expressão da proteína STAT3. Pelo contrário, a transfecção de anti-miR-130b resultou numa regulação positiva da expressão da STAT3.

(A) (painel de cima) o fragmento 3 ‘UTR da STAT3 humana contendo de tipo selvagem ou mutada de miR-130b- sequência de ligação. (Painel inferior) O miR-130b eo site miR-130b de ligação na 3’UTR de STAT3. (B) Ensaio de repórter de luciferase com a co-transfecção de tipo selvagem ou mutante 3’UTR (100 ng) e miR-130b ou miR-NC (50 nM) em células PANC-1. a actividade da luciferase do vaga-lume de cada amostra foi normalizado contra a actividade da luciferase de Renilla. (C) Os efeitos de miR-130b ou anti-miR-130b sobre a expressão endógena de STAT3. QRT-PCR (painel da esquerda) e Western blot (painel direito) foram utilizadas para monitorizar a expressão da STAT3 em células PANC-1 de 48 h após a transfecção com o miR-130b ou anti-miR-130b (50 nM). Todos os dados de três experiências separadas são apresentados como média ± DP. *. P 0,05; **. P . 0,01

STAT3 foi regulada no pâncreas tecidos e foi inversamente correlacionada com os níveis de miR-130b

Os níveis de mRNA STAT3 foram medidos em tecidos de PC e tecidos não cancerosos adjacentes. Como mostrado na Fig. 6A, o nível médio de expressão STAT3 foi significativamente mais elevada em tecidos do PC quando comparada com a dos tecidos NP (P 0,01). Observou-se uma correlação significativa inversa entre STAT3 e expressões miR-130b em tecidos de câncer de pâncreas (correlação de Spearman, r = -0,4903; P 0,01) e tecidos não cancerosos adjacentes (r = -0,4026; P 0,001) (Fig 6B.).

(a) STAT3 foi detectada por qRT-PCR em 52 cancro do pâncreas (PC) tecidos e foi igualado os tecidos pancreáticos não cancerosas adjacentes (NP). A abundância STAT3 foi normalizado contra a GAPDH. (B) A relação entre STAT3 e expressão de miR-130b foi explorada por correlação de Spearman em 52 tecidos PC emparelhados e tecidos NP adjacentes. Todos os dados de três experiências separadas são apresentados como média ± DP. *. P 0,05; **. P . 0,01

Discussão

Os perfis de miRNA foram estabelecidas para uma variedade de sólidos e hematológicas malignas [29], [30]. Nos últimos anos, a descoberta de pequenos RNAs tem sofrido avanços significativos na compreensão da biologia do cancro, fornecendo mecanismos adicionais para desregulação genética. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares pelos quais miARNs de modulação no processo de tumorigénese e o comportamento de células de cancro do pâncreas. Neste estudo, descobrimos que miR-130b era frequentemente regulada para baixo em ambos os tecidos de câncer de pâncreas e linhas celulares. Também foi revelado que o miR-130b suprimiu a proliferação de células cancerosas no pâncreas ambos

in vitro

e

in vivo

por indução de apoptose e ciclo celular, bem como invasão inibido

em vitro

. Além disso, também STAT3 foi caracterizado como um alvo funcional de miR-130b.

MiRNAs têm sido relatados como sendo importantes em cancros pancreáticos, enquanto as associações com a sobrevivência e resultados clínicos são largamente claro. A análise de sobrevivência de presente estudo revelou que miR-130b desregulamentação correlacionada com menor sobrevida dos pacientes com câncer de pâncreas. Enquanto isso, os dados clínicos mostraram que miR-130b desregulamentação foi significativamente associada com grande tamanho do tumor, estágio tardio TNM, invasão linfática e metástases à distância. Além disso, a análise multivariada indicou que a expressão de miR-130b baixa, estágio TNM avançada e metástases à distância foram fatores prognósticos significativos para uma taxa de sobrevida global pobres de pacientes com câncer pancreático. Assim, propomos que as nossas observações fornecem insights para a importância de miR-130b, que poderia ser um biomarcador romance para predizer o prognóstico e progressão de pacientes com câncer pancreático.

Recentemente, acredita-se que a modulação dos miRNAs para segurar substancial potencial clínico na terapia do cancro [31]. Yip et al. revelou que o miR-130b reprimidos foi altamente correlacionada com o fenótipo agressivo de carcinoma papilífero da tireóide [18]. Yang et ai. mostrou que a regulação negativa miR-130b promovido o desenvolvimento de cancro do ovário resistentes a múltiplas drogas parcialmente por segmentação da 3′-UTR do CSF-1, enquanto que o silenciamento de miR-130b pode ser mediada por metilação de ADN [32]. No entanto, os outros resultados demonstraram que miR-130b foi significativamente regulada e agiu como um promotor de tumor. Lai et ai. demonstrado que o miR-130b era, obviamente, sobre-expresso em cancro gástrico e a sua viabilidade celular aumentada e a sobre-expressão de morte celular reduzida [13]. Liu et al. mostraram que miR-130b foi sobre-expresso em cancro de células hepáticas e pode ser um biomarcador de soro com valores clínicos para o rastreio do cancro da célula hepática [33]. Desde o efeito de miR-130b em câncer pancreático foi longe de ser definido, este estudo teve por objetivo identificar a função de miR-130b em câncer pancreático. A restauração de miR-130b foi encontrado para suprimir significativamente a proliferação de PANC-1 e células ASPC-1 por indução de apoptose e do ciclo celular na fase S de detenção. Além disso, o crescimento de tumores de xenoenxerto foi significativamente inibida, após ter sido transfectadas com VE-miR-130b. Estes resultados implicaram que o miR-130b pode actuar como um inibidor da progresso da carcinogénese do pâncreas. Além disso, estes resultados mostraram heterogeneidade da função do miR-130b que era dependente do tipo de cancro e do contexto celular.

invasão e metástase foram as principais causas de mau prognóstico em doentes com cancro pancreático. Muitos estudos têm mostrado que houve uma estreita correlação entre a invasão /metástase de câncer de pâncreas e miRNAs, como miR-20 e miR-146a [9], [34]. Portanto, desvendar o complexo papel de miRNAs no processo de metástase do câncer de pâncreas pode fornecer novos insights para algumas conseqüências terapêuticas. Os resultados clínicos mostraram que miR-130b foi significativamente diminuída em pacientes com invasão /metástase. Além disso, os pacientes com maior expressão de miR-130b foram menos frequentemente associado com a invasão /metástase. Nós ainda identificou o papel de miR-130b na capacidade de invasão de células de câncer pancreático. Após a restauração de miR-130b, a capacidade de invasão de células PANC-1 e ASPC-1 foi claramente inibida. Estes resultados intensivamente implícita que o miR-130b podem estar envolvidos na progressão de metástases do cancro do pâncreas. Portanto, abordagens para introduzir miR-130b em células cancerosas pode ser potencialmente viável para o tratamento clínico de câncer pancreático, especialmente para aqueles com menor expressão de miR-130b em tecidos tumorais.

STAT3, um membro da transdução de sinal e activação de transcrição (STAT) familiar, tem sido frequentemente sobre-expressa em uma ampla variedade de tumores humanos incluindo cancro pancreático [35] – [37]. STAT3 participa na iniciação e desenvolvimento de cancros através da promoção da proliferação das células, inibindo a apoptose de células, promoção da angiogénese, invasão e metástase [38], [39]. Neste estudo, uma associação molecular importante entre miR-130b e STAT3 foi demonstrada. A análise bioinformática indicaram que a STAT3 pode ser um dos potenciais alvos para miR-130b. Os dados da atividade de luciferase mostraram que miR-130b foi capaz de atingir diretamente o 3’UTR da STAT3. Os resultados de Western blot de qRT-PCR e mostram que a sobre-expressão de miR-130b regulada negativamente a expressão da STAT3 em células de cancro do pâncreas, tanto interferir com e degradam ARNm, enquanto que o anti-miR-130b regulada positivamente a expressão da STAT3. Finalmente, a correlação inversa entre tecidos NP miR-130b e expressão STAT3 no PC e foi confirmado que a regulação negativa miR-130b resultou na sobre-expressão da STAT3. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que miR-130b poderia inibir o crescimento celular e invasão de câncer pancreático, visando STAT3.

Em resumo, o nosso presente estudo demonstrou que a expressão desregulada de miR-130b foi associada com mau prognóstico e fenótipo agressivo de câncer de pâncreas. Este estudo também sugeriu que miR-130b desempenhou um papel importante na regulação do comportamento maligno câncer pancreático incluindo proliferação celular e invasão diretamente pela segmentação STAT3.