Abstract

O câncer de ovário continua a ser difícil de tratar, principalmente, devido à apresentação da doença em um estágio avançado. adenovírus condicionalmente replicantes (Crads) são promissores agentes anti-câncer que matam seletivamente as células tumorais. O presente estudo avaliou a eficácia de uma nova Crad (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) contendo o promotor de CXCR4 para a replicação viral selectiva em células de cancro em conjunto com TIMP2 como um transgene terapêutico, tendo como alvo as metaloproteases de matriz (MMPs) num modelo ortotópico de murídeo da forma disseminada câncer de ovário. Um modelo ortotópico de câncer de ovário foi criada em ratinhos nus atímicos por injecção intraperitoneal da linha humana ovário célula cancerosa, SKOV3-Luc, expressando luciferase. Após a confirmação da disseminação peritoneal das células por imagem não invasiva, os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de tratamento: PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, e Ad5 /3-CXCR4-TIMP2. Todos os ratos foram fotografadas semanalmente para acompanhar o crescimento do tumor e foram sacrificados após atingir qualquer um dos terminais pré-definidos, incluindo a elevada carga tumoral e perda de peso significativa, juntamente com evidência clínica de dor e angústia. A análise de sobrevida foi realizada utilizando o teste de Log-rank. A sobrevida média para a coorte PBS foi de 33 dias; para Ad-ΔE1-TIMP2, 39 dias; para Ad5 /3-CXCR4, 52,5 dias; e para Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, 63 dias. O Crad TIMP2-armado retardou o crescimento do tumor e aumentou significativamente a sobrevivência quando comparada com a Crad desarmado. Este efeito terapêutico foi confirmado ser mediado através da inibição da MMP9. Os resultados do

in vivo

estudo apoiam o potencial translacional de Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 para o tratamento de pacientes humanos com câncer ovariano avançado

Citation:. Yang SW, Chanda D, Cody JJ , Rivera AA, Wæhler R, Siegal GP, et al. (2011) condicionalmente replicante Adenovirus TIMP2 Expressando aumenta a sobrevida em um modelo de mouse Disseminada cancro do ovário. PLoS ONE 6 (10): e25131. doi: 10.1371 /journal.pone.0025131

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de maio de 2011; Aceito: 25 de agosto de 2011; Publicação: 12 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede R01CA108585, T32 CA075930, e da Universidade de Alabama em Birmingham, Departamento de Fundo de Investigação Patologia é apreciado. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

o câncer de ovário é a principal causa de morte por câncer ginecológico em os EUA [1]. A morbilidade e mortalidade em pacientes com este grupo de tumores é atribuído ao fato de que os pacientes apresentam apenas com sintomas inespecíficos nos estágios iniciais, o que impede o seu diagnóstico [2]. A maioria dos pacientes são diagnosticados em estágio III ou além, onde o câncer disseminou por toda a cavidade peritoneal, o que leva a um mau prognóstico. As terapias atuais têm limitações, como a taxa de sobrevivência de cinco anos manteve-se inalterada em 50% nos últimos quatro [3] décadas. Assim, são urgentemente necessárias novas terapias efetivamente direcionados para a doença disseminada.

condicionalmente replicante adenovírus (Crads) são uma nova classe promissora de terapias, como esses vírus têm o potencial de seletivamente e auto-replicar perpetuamente e câncer de lise células de erradicar o tumor inteira [4]. Ensaios clínicos com Crads até agora têm demonstrado a segurança de adenovírus oncolytic. No entanto, a eficácia terapêutica modesto, com Crads sugere uma maior optimização para a tradução clínica eficaz é [5] necessário. Uma estratégia de aumentar a eficácia antitumoral utiliza o Crad como uma plataforma para a entrega de um transgene terapêutico, para além do seu potencial oncolitico [6]. Para esse efeito, a hipótese de que a eficácia de um adenovírus replicar poderia ser melhorado para o tratamento do cancro do ovário por armar com um gene que actua sobre o microambiente hospedeiro, como a interacção entre as células cancerosas e o seu microambiente tem sido conhecida por modular a progressão do tumor [7], [8], [9].

as metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família diversa de proteases capazes de degradar vários componentes da matriz extracelular (ECM) [10]. Eles são um dos alvos ideais para a terapia do cancro do ovário, como a sua desregulação foi mostrado para contribuir para a promoção do crescimento do tumor, angiogénese, invasão e metástase [11]. Em particular, de MMP-2 e MMP-9 são constantemente regulada positivamente em cancro do ovário e estão associados com prognóstico pobre [12], [13]. regulador importante das MMPs são seus inibidores endógenos, o inibidor de tecido de metaloproteinases (TIMP), uma família de pequenas proteínas secretadas que actuam através da ligação directa para as MMPs activos inibindo assim a sua acção. Até à data, quatro TIMP de mamíferos foram identificadas [14]. Entre os membros da família TIMP, TIMP-2 é único na sua capacidade de inibir o crescimento tumoral e angiogénese também através de vias independentes da inibição de MMP [15], [16], [17]. Colocámos a hipótese de que a produção de TIMP2 a partir de células infectadas por vírus deve ligar e inibir o excesso de MMP extracelulares e, assim, inibir a progressão do tumor através de ambas as vias dependentes de MMP-e MMP-independentes.

Anteriormente, foi desenvolvido e determinado o potencial terapêutico de um Crad TIMP2-armado, Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, para terapia de câncer de ovário [18]. selectividade de transdução do Crad foi alcançado através da substituição geneticamente o botão de Ad5 com o botão de Ad3, que contorna o receptor de Coxsackie e adenovírus (CAR) e redirecciona a ligação ao receptor Ad3, que é mais abundantemente expresso em células do cancro do ovário [19], [ ,,,0],20]. O promotor CXCR4 foi usada para mediar a replicação selectiva do tumor do vector, uma vez que apresenta uma actividade superior em ambas as células de cancro do ovário humano estabelecidas e tecidos tumorais primários derivados de pacientes [18]. Além disso, a actividade de promotor CXCR4 é mínimo no fígado, o órgão principal conhecida por modular vectores adenovirais entregues sistemicamente [21]. O gene foi incorporado TIMP2 para inibir a progressão do tumor. Nós recentemente validado

In vitro

que Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 produzido TIMP2 funcional, como indicado pela inibição da degradação enzimática de gelatina por MMPs activos [18]. Para o Crad TIMP2-armada para ser eficaz, é importante que a expressão de TIMP2 não impedir a replicação viral ou a sua potência oncolitica. Temos demonstrado recentemente que a replicação viral e potência oncolytic não foram comprometidos em ambos os SKOV3.ip1 e 4 OV-células cancerosas humanas ovarianos armando com TIMP2 [18]. Além disso, demonstrou-se que não havia selectividade na replicação com o promotor de CXCR4, como indicado por um nível mais elevado de replicação nas células de cancro do ovário, quando comparado com o controlo fibroblastos. No sentido de traduzir esse vírus para a clínica, foram empregados ainda mais o uso de um

ex vivo

sistema modelo para examinar a replicação viral em tumores tecidos obtidos de pacientes com estágio confirmou III e câncer de ovário IV. Os resultados deste estudo indicaram uma replicação consistente alto nível com Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 [18]. Colectivamente, estes dados foram muito encorajadores, sugerindo que Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 podem ser eficazes para o tratamento de câncer de ovário avançado. No presente estudo, buscou-se determinar a eficácia terapêutica de Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 num modelo ortotópico de câncer de ovário murino disseminada. a progressão do tumor foi monitorado por meio não-invasivo

in vivo

imagem. Os resultados do presente estudo demonstrou um aumento significativo na sobrevivência após o tratamento com Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, sugerindo seu potencial para a tradução clínica.

Materiais e Métodos

Células

O ovário linha celular de adenocarcinoma que expressam a luciferase do pirilampo SKOV3-Luc foi gentilmente fornecido pelo Dr. R. Negrin (Stanford, Escola de Medicina, Stanford, CA). A linha celular de carcinoma do pulmão humano A549 foram adquiridos à American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Ambas as linhas celulares foram cultivadas numa mistura 01:01 de meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) e meio F-12 de Ham, suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) , L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /ml), a 37 ° C numa atmosfera humidificada e com 5% de CO

2. Mídia e suplementos foram adquiridos de Mediatech (Herndon, VA).

Construção e produção dos vírus

Ad-ΔE1-TIMP2 é um E1, E3-excluído replicação deficiente Ad5 vector que TIMP2 expressa sob o controlo do promotor de CMV [22]. Ad5 /3-CXCR4, é um Crad com o promotor CXCR4 inserido na posição de E1A, juntamente com uma fibra modificada com tropismo, contendo o eixo da fibra de Ad5 e cauda que teve o domínio botão substituído com a do vírus Ad3 [23]. A /3-CXCR4-TIMP2 Ad5 foi construído usando um cDNA TIMP2 humana de comprimento completo como descrito anteriormente [18]. O adenovírus deficiente em replicação, o Ad-ΔE1-TIMP2 foi propagado em células 293. Os Crads, Ad5 /3-CXCR4 e Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 foram amplificados na linha celular A549. Todos os vírus foram purificados por dois ciclos de centrifugação de densidade de cloreto de césio. Os títulos de partículas virais infecciosas e unidades foram determinadas como anteriormente descrito [24].

ortotópico modelo do cancro do ovário e o vector de tratamento

fêmea BALB /c ratinhos nu /nu de 6 até 8 semanas de idade foram obtidos a partir Cancer Institute-Frederick animal Área de Produção Nacional (Frederick, MD) e colocado em quarentena durante 2 semanas. Os ratos foram mantidos em condições livres de patógenos de acordo com a Associação Americana para Credenciamento de diretrizes Laboratory Animal Care. protocolos de animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Alabama em Birmingham.

In vivo

imagem óptica foi realizada na pequena instalação do núcleo de imagem animal do Comprehensive Cancer Center da Universidade do Alabama em Birmingham. No dia 0, os ratinhos foram injectados intraperitonealmente (i.p.) com 5 × 10

6 células SKOV3-Luc em 250 ul de PBS e fotografada para a bioluminescência para obter leituras da linha de base. Oito dias mais tarde, os ratinhos foram reimaged para garantir a implantação dos tumores e foram então divididos aleatoriamente em quatro grupos: PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, e Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, com n = 10 por grupo. Cada rato foi injectado i.p. com 2 × 10

8 UI de um determinado vírus em 200 uL de PBS ou PBS sozinho. Todos os ratinhos foram fotografadas para semanal bioluminescência após injecção das células tumorais para monitorizar o crescimento do tumor. Todos os murganhos foram seguidos diariamente para sobrevivência gravar. tempo de sobrevivência reflecte o tempo necessário para os animais para atingir ambos os seguintes parâmetros. Primeiro, a evidência clínica de dor ou angústia. Em segundo lugar, qualquer dos pontos de extremidade mensuráveis ​​pré-determinado, incluindo: perda de peso superior a 15%, ou o ganho de peso superior a 20% do peso corporal. O peso dos animais foi medido no dia 0 e medidos novamente a cada 3 dias até ao fim da experiência. dados de sobrevivência foram plotados em uma curva de Kaplan-Meier, e diferentes grupos foram comparados usando o Log-rank (Mantel-Cox) teste (v.5 GraphPad Prism Software).

imagem de bioluminescência para detectar

em in vivo

expressão de luciferase

Ratos foram fotografadas no dia 0 para o sinal de bioluminescência após a injecção de células SKOV3-Luc para obter uma leitura de base da carga do tumor. A visualização foi realizada de novo antes do tratamento inicial no dia 8 e depois semanalmente até que os ratinhos foram sacrificados. Resumidamente, 150 mg /kg de D-luciferina foi injectado i.p., e os ratinhos foram anestesiados com anestesia de gás isofluorano e colocadas numa câmara à prova de luz. A imagem de referência fotográfico (escala de cinzentos) foi obtida em 10 minutos após a injecção de D-luciferina, e a imagem bioluminescente foi recolhido imediatamente depois. As imagens foram obtidas com um CCD arrefecida a -120 ° C, utilizando o IVIS -100 Imaging System (Xenogen Corp., Alameda, CA), com o campo de visão posicionada a uma altura de 25 cm. As imagens bioluminescentes usado exposições que variam de 1 a 10 s, 1 de f /stop, 4 binning, e filtro aberto. software de aquisição de dados foi calibrado de modo que nenhuma pixels foram saturados durante a coleta de imagem. As imagens bioluminescentes e em escala de cinza foram sobrepostos usando software LivingImage. Vivendo Imagem Software (Xenogen, Alameda, CA) também foi utilizado para obter uma imagem pseudo representando a intensidade de bioluminescência (azul, menos intensa, e vermelho, mais intenso). Regiões de interesse foram desenhada em torno do i.p. tumores, e as contagens totais (fótons) foram somados para a área do tumor inteiro. As contagens totais foram normalizados para o tempo de aquisição de imagem (fotões /sec). As diferenças estatísticas de tamanho do tumor entre os grupos foram avaliadas pelo teste t de Student. A

valor p

de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados foram apresentados como valores médios ± DP.

Imunohistoquímica

Os ratos foram sacrificados em elevada carga tumoral pelos parâmetros predeterminados definidos como acima. No momento do sacrifício, necropsias foram realizados em 3 ratos de cada grupo de tratamento, a partir do qual os tumores e os órgãos principais foram colhidas e fixadas em blocos de parafina. Resumidamente, secções de parafina de tumores do ovário humano xenoenxerto foram desparafinados em xileno e hidratados através do álcool classificados. A recuperação de antígenos foi realizada em tampão de citrato (pH 6,0), sob vapor durante 20 min. As secções foram arrefecidos até à temperatura ambiente, e a peroxidase endógena foi removido utilizando 0,3% H

2O

2 em metanol durante 30 min e bloqueadas com BSA a 5% durante 30 min. As secções de tecido foram então incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. As secções foram lavadas em Solução Salina Tamponada com Fosfato-contendo 0,05% de Tween-20 (PBST) e incubada novamente à temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com biotina de cabra anti-cabra /anti-ratinho durante 2 h. Após a lavagem, as secções foram incubadas com peroxidase de rábano conjugada com estreptavidina durante 1 h à temperatura ambiente. Após outra lavagem com PBST, imunodetecção foi realizada utilizando 3,3′-diaminobenzidina-H

2O

2 (Vector Labs) e contrastadas com hematoxilina.

Resultados

Armando com TIMP2 retardou o crescimento do tumor

in vivo

ovário

Para avaliar a eficácia terapêutica de Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 em um

in vivo

modelo clinicamente relevante, geramos ortotopicamente disseminada cancro através da injecção de ratinhos nus do sexo feminino com células SKOV3-luc humanos por via intraperitoneal (ip). Uma linha celular estável expressando a luciferase foi utilizado para monitorizar a eficácia terapêutica dos tratamentos por imagem não invasiva

In vivo

. Oito dias após a administração de células de tumor, os ratinhos foram re-fotografada para garantir a implantação dos tumores e divididos em quatro grupos de tratamento, com 10 ratinhos por grupo. Os grupos de controlo receberam PBS, um vector deficiente na replicação expressando TIMP2 (Ad-ΔE1-TIMP2), ou um Crad CXCR4 promotor regulado com uma fibra quimérico de Ad5 /3 (Ad5 /3-CXCR4). O grupo recebeu uma terapêutica baseada Crad promotor CXCR4 TIMP2 armado com uma fibra quimérico de Ad5 /3 (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) (Fig. 1). Todos os ratinhos foram fotografadas após injecção i.p. injecções de D-luciferina, numa base semanal. Um painel representativo de imagens é mostrado na Fig. 2A, enquanto que a determinação quantitativa dos sinais bioluminescentes é mostrado na Fig. 2B. sinais bioluminescentes baixos de células SKOV3-luc foram detectadas tão cedo quanto 8 dias após a injecção das células tumorais, e foram relativamente consistentes entre os quatro grupos. Ao dia 22, não houve crescimento tumoral significativa no grupo de PBS e Ad-ΔE1-TIMP2 grupo tratado. Em contraste, os grupos tratados com os Crads teve uma inibição significativa no crescimento do tumor. O grupo tratado com o vírus alvo, Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, exibiram regressão do tumor no dia 22. Ao dia 30, não houve considerável carga de tumor no grupo de PBS, como ratinhos exibiram um aumento significativo na circunferência abdominal e estavam a começar a mostrar sinais de carga da doença. Em contraste, o crescimento tumoral foi inibido significativamente em todos os grupos tratados com vírus (p 0,001). Ao dia 36, ​​a maioria dos ratinhos do grupo de PBS morreram de uma carga tumoral pesada. Neste ponto de tempo, os ratos tratados com Ad-ΔE1-TIMP2, começou a exibir a carga tumoral considerável. No entanto, ambos os grupos tratados com Crads teve significativamente menos do sinal bioluminescente (p 0,001), indicando uma taxa mais lenta de desenvolvimento do tumor. Além disso, a carga de tumor no grupo de ratos tratados com Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, o Crad armado, era significativamente menor quando comparado com o peso do tumor em ratos tratados tanto com Ad5 /3-CXCR4 e o Crad desarmado (p 0,01 ; A Fig. 2B). Uma tendência semelhante na sobrevivência após o tratamento com diferentes vectores foi observado em dois estudos piloto com o número de animais por grupo inferior (dados não apresentados). Colectivamente, estes dados sugerem que tanto a replicação viral e armar com TIMP2 contribuiu para atrasar o início do crescimento tumoral.

Adwt300, é o tipo selvagem de vírus Ad5. Ad-ΔE1-TIMP2 é um vector de Ad5 deficiente na replicação E1, E3-excluído que expressa TIMP2 sob o controlo do promotor CMV em E1. Ad5 /3-CXCR4 é um Crad desarmado com um promotor de CXCR4 em E1 a limitar a replicação virai para as células cancerosas em conjunto com uma fibra modificada Ad5 /3 que contém o eixo e a cauda da fibra de Ad5 e o botão de fibra de Ad3. Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 é um Crad com o promotor CXCR4 em E1, armado com TIMP2 na região de E3B ea fibra F5 acima mencionada /3 modificado.

tumores disseminados foram estabelecidos através da injeção de 5 × 10

6 células SKOV3-luc ip em ratinhos nus atímicos fêmeas no dia 0. No dia 8, os ratos foram tratados quer com uma injecção i.p. injecção de PBS, ou 2 × 10

8 UI de Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, e Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, respectivamente. níveis bioluminescência foram medidos semanalmente. (A), representando a intensidade da imagem pseudo bioluminescência nos dias 8, 22, 30 e 36. (b), a intensidade da bioluminescência da região abdominal foi quantificado e normalizado, e a contagem média de fótons por segundo para cada grupo são apresentados para os dias dadas . Os dados relatados como a média ± DP para cada grupo de tratamento. * P . 0,05

Armando com TIMP2 aumento da sobrevida

Todos os ratos foram seguidos para a sobrevivência, como mostrado na Fig. 3A. O tempo médio de sobrevivência aumentou de 33 dias, para o grupo de PBS, aos 39 dias no grupo injectado com o vector que expressa TIMP2 nonreplicating (Ad-ΔE1-TIMP2), esta diferença era estatisticamente significativa (p 0,03). A coorte tratada com o Crad desarmado (Ad5 /3-CXCR4) teve tempo de sobrevida mediana de 52,5 dias, enquanto que a coorte tratada com o Crad TIMP2 armado (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) tiveram uma sobrevida mediana de 63 dias ( Fig 3B), com essa diferença também estatisticamente significativa (p . 0,002). Em resumo, armar com TIMP2 parece ser útil para o tratamento de cancro do ovário divulgadas, uma vez que o aumento da sobrevida

In vivo

.

Os ratinhos foram monitorizados quanto a sobrevivência. dados de sobrevivência são plotados em uma curva de Kaplan-Meier (A). O tratamento com Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 aumentou significativamente a sobrevivência quando comparada com o tratamento com Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, ou PBS (p 0,05). (B), sobrevivência média em dias para cada grupo de tratamento.

TIMP2 é expresso em tumores de vírus armadas

Para determinar se o aumento da sobrevida visto na Crad TIMP2-armada quando comparado com o Crad desarmado era devida à modulação do microambiente por TIMP2, expressão de TIMP2 foi examinado pela primeira vez em tumores excisados ​​de cada grupo de tratamento durante a autópsia. Como pode ser visto na Fig. 4, os tumores excisados ​​a partir de grupos tratados com PBS e Ad5 /3-CXCR4 foram negativos para a expressão TIMP2. O resultado da imuno indicaram que em tumores excisados ​​de coorte tratada com o Ad-ΔE1-TIMP2, TIMP2 expressão foi mínima e apareceu limitada à periferia do tumor. Isto não era inesperado, tal como Ad-ΔE1-TIMP2 é um vector não replicante e não se esperava que difundir no interior do tumor de forma eficaz. Em contraste, os tumores de ratos tratados com Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 exibiram coloração melhorada TIMP2 em todo o tumor, indicando que este vírus oncolítico foi eficaz em infectar e replicar em todo o tumor.

No momento do sacrifício de ratos devido a carga tumoral, os tumores foram coletados de grupos de tratamento indicados e analisados ​​para a expressão de TIMP2 por imuno-histoquímica.

TIMP2 armado Crad diminuiu o nível de MMPs activos

TIMP2 é um inibidor conhecido de MMP2 e de MMP9. Assim, para a coloração de MMP2 activa e MMP9 foi realizado para determinar se os níveis foram afectados. Os resultados desta análise indicaram que os tumores dos grupos tratados com PBS, Ad5 /3-CXCR4, e Ad-ΔE1-TIMP2, todos exibiram elevados níveis de MMP2 activa. Em contraste, os tumores do grupo tratado com Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 tinha níveis muito baixos de MMP2. Um padrão idêntico também foi detectada expressão em MMP9 por imuno-histoquímica. Grupos tratados com PBS, Ad5 /3-CXCR4, e Ad-ΔE1-TIMP2, todos imuno exibiu para MMP9 activa. Em contraste, os tumores do grupo tratado com Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 tinha níveis muito baixos de expressão de MMP9 activa (Fig. 5). Estes dados sugerem que TIMP2 secretado pela Crad armado também foi eficaz na inibição de actividades de MMP2 e MMP9.

Na altura do sacrifício dos ratinhos, devido à carga de tumor, os tumores foram recolhidos a partir de grupos de tratamento indicados e examinados para expressão de MMP-9 por imuno-histoquímica.

TIMP2 armado Crad inibiu a angiogênese

Finalmente, os tumores foram examinados para a expressão de CD31, um marcador de angiogênese. Coortes tratados com PBS, o Ad-ΔE1-TIMP2, e Ad5 /3-CXCR4, tinham vasos de grande diâmetro, com imunorreactividade mínima que revestem as paredes endoteliais quando comparados com coortes tratados com Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 (Fig. 6).

conglomerados tumor na região abdominal foram coletados durante o sacrifício dos animais dos grupos de tratamento indicados e fixo. Cinco mM seções de blocos de parafina de tecidos tumorais foram coradas com anticorpo CD31 humano para detectar a vasculatura sanguínea.

Discussão

A importância da interacção entre as células tumorais eo microambiente no tumor modulação progressão foi há muito reconhecida [25]. Na patogénese do cancro do ovário, MMP-2 e MMP-9 são constantemente regulada positivamente [12]. Além disso, o aumento dos níveis destes MMPs correlacionados negativamente com a sobrevivência como eles estão associados com estágio avançado, ascite de alta qualidade e nódulo positivo (metastático) linfático [13]. Estes dados sugerem que as MMPs são alvos terapêuticos válidos para o tratamento de cancro do ovário. Um regulador chave das MMPs é seus inibidores endógenos, TIMPs. Quatro TIMP de mamíferos foram identificadas até à data, entre eles TIMP2 tem sido mais extensivamente estudados devido à sua capacidade para inibir o crescimento tumoral e angiogénese por uma variedade de mecanismos independentes da MMP-inibição directa [15], [16], [17]. TIMP2 pode inibir a proliferação de células endoteliais através da indução de actividade de tirosina-fosfatase de proteína [17]. TIMP2 também inibe o crescimento tumoral e angiogese por aumento da actividade de proteína activada por mitogénio fosfatase quinase 1 [15]. Em um esforço para desenvolver um Crad sucesso voltada para o tratamento do cancro do ovário disseminada, propusemos que armar com TIMP2 iria aumentar a eficácia terapêutica do Crad por inibição da progressão tumoral através de ambas as vias dependentes de MMP-e MMP-independentes.

em nosso estudo recente, caracterizados e avaliou a eficácia da Ad5 /3-CXCR4-TIMP2

in vitro

. Confirmou-se que a expressão TIMP2 não impedir a replicação viral ou a potência oncolitica do vírus. Além disso, a replicação selectiva foi realizada com o promotor de CXCR4. Validação de Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 em amostras de tumor primário a partir de cinco pacientes com fase confirmada III ou IV do cancro do ovário, revelou um alto nível de replicação consistente quando comparado com os outros vírus de controlo. Em conjunto, esses dados sugerem o potencial de Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 para o tratamento de câncer de ovário avançado [18].

No presente estudo, buscou-se determinar a eficácia de Ad5 /3-CXCR4 TIMP2

in vivo

. imagiologia bioluminescente não invasiva fornece uma ferramenta poderosa que permite a monitorização longitudinal de crescimento tumoral em ratinhos. Além disso, nos permitiu usar um sistema modelo que é clinicamente relevante. Na maioria dos casos, o câncer de ovário é diagnosticado em um estágio avançado, onde o câncer disseminou por toda a cavidade peritoneal, assim, usando um modelo animal por via subcutânea para avaliar a eficácia do tratamento, enquanto conveniente, não reflete a evolução clínica natural do doença. tumores, portanto, estabelecendo disseminadas com i.p. injecção de células SKOV3-luc, juntamente com imagem latente nos permitiu usar um sistema modelo clinicamente válidos que pode de forma mais precisa e eficaz prever o valor de translação de Ad5 /3-CXCR4-TIMP2. Além disso, vários estudos têm mostrado sensibilidade e validade da imagem de bioluminescência em i.p. modelos de tumores [26], [27], [28].

O tratamento com um TIMP2-armada Crad significativamente a sobrevivência aumentada quando comparada com a Crad desarmado, no entanto, o aumento não foi robusta. No presente estudo, foi dada viroterapia com uma única injecção de vírus dose baixa no dia 8 após a implantação do tumor. Em contraste, muitos

in vivo

experimentos para verificar a eficácia do tratamento iniciado antes ou no mesmo dia da injeção de tumor. Além disso, as doses virais foram utilizados, pelo menos, um de dois logs maior e foram entregues através de administrações múltiplas do vírus [29], [30], [31], [32]. O principal objetivo de limitar a dose de vector no presente estudo foi o de estabelecer um índice terapêutico seguro. Uma vez que os modelos de ratinho nu utilizados na avaliação pré-clínica de terapias experimentais de cancro do ovário não tem um sistema imunitário funcional, aumentando a dose de vetor para o nível mais elevado possível de atingir um efeito terapêutico pode não ser apropriado para a extrapolação para os seres humanos como a mais alta do vetor dose resulta em activação do sistema imunitário, causando efeitos secundários graves. No entanto, a partir dos dados deste estudo, é concebível que, com uma dose mais elevada ou um regime de dosagem múltipla, a eficácia terapêutica pode ser adicionalmente aumentada. Uma desvantagem potencial com administração repetida do vírus é que a imunidade poderia se tornar um problema significativo e dificultar a eficácia terapêutica. publicação recente de

Hemmmki et al

sugerem que, mesmo na presença de imunidade significativa contra Ad5, pode-se ignorar esta imunidade simplesmente usando um sorotipo que é menos prevalente na população, tais como Ad3 e, assim, alcançar a eficácia terapêutica sem a necessidade de aumentar a dose viral. Este princípio pode ser facilmente aplicado a repetir as administrações de vírus, em que se desenvolve imunidade para o serotipo utilizado, então pode-se simplesmente modificar a espinha dorsal do vírus a um serotipo menos predominante [33]. Além disso, o aumento de eficácia viral poderia também ser conseguida por uma aproximação multi-modalidade utilizando radiação ou quimioterapia como terapias adjuvantes [34], [35], [36]. Com a plataforma de corrente do vírus segmentação através de Ad5 /3 é concebível que poderia potencialmente infectar e replicar em células do sistema imune humano, na medida em que não pode ser determinada neste modelo, como adenovírus humano não replicar em tecido de rato e atímicos nu ratos não têm células T. No entanto, este efeito secundário potencial poderia ser atenuado, alterando o tropismo viral da plataforma. Perreau

et al

mostraram diminuição da infecção de células dendríticas com canino adenovírus subtipo 2 (CAV-2) de fibra botão [37]. Assim, pela comutação do botão de fibra de Ad5 /3 para o Ad-CAV2, que pode impedir a transdução de células dendríticas. Além disso, isto permite que a reter os promotores CXCR4, uma vez que exibe uma elevada actividade em células tumorais.

A biologia do tumor, a natureza da difusão peritoneal de cancro do ovário, bem como as funções paradoxais de MMPs e TIMPs na progressão do cancro adiciona mais complexidade a um tratamento eficaz da doença. Está bem estabelecido que o aumento de MMP-2 e MMP-9 de expressão em cancro do ovário se correlaciona negativamente com o prognóstico e sobrevivência [12], [13], [38], [39], [40], [41]. No entanto, as funções específicas de MMPs na progressão do cancro do ovário não estão bem definidas. Estudos indicam que a MMP-2 é predominantemente importante na tumorigênese cedo, iniciando a metástase através do reforço da adesão de células de cancro do ovário para o peritônio [42]. Assim, as terapias para bloqueá-lo uma vez a metástase é estabelecida são ineficazes. No entanto, outros relatórios suportam o papel da MMP-9 em crescimento tumoral e angiogénese [43]. Os papéis de MMPs e TIMPs em câncer de ovário são ainda confundidos por estudos imunohistoquímicos olhando para expressão de TIMP2 em tecidos de cancro do ovário. Embora alguns grupos relataram a expressão de baixo TIMP2 em tumores ovarianos primários [38], outros têm visto a expressão aumentada TIMP2 em tecidos de cancro do ovário, o que sugere que TIMP2 contribui para a progressão do tumor, em parte, através da activação de pro-MMP2 e de inibição anti- tumorais actividades de MMP [39], [41]. Em contraste, vários estudos animais utilizando entrega viral de TIMP2 demonstraram a sua utilidade para suprimir o crescimento do tumor, a migração e metástase em vários modelos de cancro [44], [45], [46], [47], [48]. Colectivamente estes estudos indicam que talvez efeitos de TIMP2 na promoção de tumores ou supressão são dependentes do tempo e do tipo específico de tumor. Ao invés de inibição não específica de MMPs, talvez seja mais útil para inibir especificamente diferentes MMPs durante as fases de progressão do tumor.

Emergentes dados de estudos genéticos clínicos, patológicos e moleculares sugerem um novo modelo de carcinogênese ovário, onde ovário cancro é classificada em dois grupos distintos, tipo I e II [49]. Tipo I são tumores clinicamente indolente, como eles são de crescimento lento e geralmente confinadas ao ovário no momento do diagnóstico. Em contraste, os tumores do tipo II são clinicamente agressivo, presente em um estágio avançado e acredita-se surgem

de novo

, como lesões precursoras não foram identificados. Os tumores do tipo II, correspondendo a 70% do cancro do ovário, são caracterizados por mutações de TP53 em 80% dos casos. Esses novos dados sugerem que p53 poderia ser um alvo terapêutico para armar o vírus para a terapia de câncer de ovário. Crads armados com p53 demonstraram

in vitro para aumentar a oncólise

no cancro do colo do útero [50] e uma variedade de outras linhas celulares de cancro [51]. Outro alvo terapêutico potencial é CXCR4, o único receptor de quimiocinas encontrado para ser expresso em cancro do ovário [52].