Abstract
Evidências tem implicado a via de sinalização Wnt na patogênese do câncer colorretal. Foi avaliado o uso de polimorfismos de nucleotídeo único tag (tSNPs) em
polipose adenomatosa coli
(
APC
) /
β-catenina
(
CTNNB1
) genes para prever resultados em pacientes com câncer colorretal. Foram selecionadas e genotipadas 10 tSNP para prever variantes comuns em todo
APC
e
CTNNB1
genes em 282 pacientes com câncer colorretal. As associações destes tSNPs com sobrevida livre de metástases à distância e sobrevida global foram avaliados por análise de Kaplan-Meier, o modelo de regressão de Cox e análise da árvore de sobrevivência. A taxa de sobrevida global em 5 anos foi de 68,3%. Sobrevivência análise da árvore identificaram um perfil de interacção genética de ordem superior que consiste no
APC
rs565453,
CTNNB1
2.293.303, e
APC
rs1816769 que foi significativamente associada com sobrevida global. Os 5 anos de sobrevivência taxas globais foram 89,2%, 66,1% e 58,8% para a baixa, média, e os perfis genéticos de alto risco, respectivamente (log-rank
P
= 0,001). Após o ajuste para possíveis fatores de confusão, incluindo idade, sexo, níveis de antígeno carcinoembrionário, a diferenciação do tumor, estágio, invasão linfática, invasão perineural e comprometimento dos linfonodos, o perfil de interacção genética permaneceu significativo. Nenhum dos SNPs estudados foram associados individualmente com sobrevida livre de metástases à distância e sobrevida global. Nossos resultados sugerem que o perfil de interacção genética entre SNPs via Wnt poderia potencialmente aumentar o valor prognóstico na predição de resultados para o cancro colorectal
Citation:. Ting WC, Chen LM, Pao JB, Yang YP, Você BJ, Chang TY , et ai. (2013) comuns variantes genéticas em genes Wnt via de sinalização como potenciais prognóstico Biomarkers para o cancro colorectal. PLoS ONE 8 (2): e56196. doi: 10.1371 /journal.pone.0056196
editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão
Recebido: 30 de agosto de 2012; Aceito: 07 de janeiro de 2013; Publicação: 06 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Ting et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (número bolsa: NSC-98-2320-B-039-019-MY3 e NSC-100-2314-B-039-009-MY3), e da China Medical University (número de concessão : CMU98-N1-21 e CMU98-C-12). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal é uma doença comum em todo o mundo, e também é o câncer mais comum em Taiwan. As taxas de sobrevida em 5 anos é de aproximadamente 90% para pacientes com câncer colorretal estágio precoce, mas diminuindo para menos de 10% em pacientes com metástases distantes [1]. Para identificar pacientes de alto risco, há uma necessidade de encontrar novos biomarcadores para melhorar a previsão de desfechos clínicos no cancro colorectal.
As mutações no Wnt polipose coli /adenomatosa (APC) /β-catenina (CTNNB1) de sinalização membros da via têm sido encontrados em muitos carcinomas colorrectais [2]. Wnt ligandos ligam-se a receptores transmembranares frizzled e seus co-receptores, o que leva à fosforilação e sequestro do complexo composto por APC, caseína-quinase 1, glicogénio sintase quinase 3, e axina. A estabilização resultante de CTNNB1 intracelular facilita a sua translocação para o núcleo, onde interage com os factores de transcrição do factor de ligação ao factor de intensificador de células T /linfóide, activando os alvos que controlam o crescimento e diferenciação celular. Por conseguinte, a interacção com CTNNB1 tem sido considerado essencial para a actividade supressora de tumores de APC [3]. Além disso, CTNNB1 é uma proteína multifuncional de sinalização, que também se liga a E-caderina, E-caderina liga a filamentos de actina e de promoção da adesão celular e diferenciação [4].
À luz do papel crítico do Wnt /APC /CTNNB1 via de sinalização na manutenção da função celular colorrectal adequado, é possível que as variantes genéticas nesta via pode afectar a progressão do cancro colo-rectal. No entanto, não houve estudos que abordam a relação de variantes genéticas comuns em genes da via Wnt /APC /CTNNB1 para os resultados clínicos de cancro colorectal. Portanto, nós aplicamos uma abordagem abrangente para avaliar sistematicamente os polimorfismos de nucleotídeo único tag (tSNPs) em dois genes-chave na via Wnt,
APC
e
CTNNB1
, como preditores de prognóstico do câncer colorretal .
pacientes e Métodos
recrutamento de pacientes e coleta de dados
Esta coorte foi gerado a partir do banco de tecidos de tumor na China Medical University Hospital, Taiwan. Todos os pacientes atendidos em China Medical University Hospital, Taiwan com diagnóstico de cânceres foram abordados para participar. Duzentos e oitenta e dois pacientes com diagnóstico histopatológico confirmado de câncer colorretal foram identificados entre 2001 e 2007; tinha consentido em fornecer informações e tecidos; e tinham sido submetidos a coleta de sangue para fins de investigação. Os dados clínicos e os resultados foram obtidos a partir de registros clínicos dos pacientes e relatórios patológicos. Entre os pacientes que receberam a cirurgia curativa (estágio I-III, n = 233), a sobrevida livre de metástases à distância foi definida como o tempo desde a cirurgia até a data de metástases distantes ou quando censurados na última data. A sobrevida global foi definido como o tempo desde o diagnóstico (n = 282) para a data de morte por qualquer causa ou quando censurados na última data se os pacientes ainda estavam vivos. Os dados de sobrevivência foram atualizados mais recentemente em 2010. Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Administração do Hospital Médico Universitário China Análise institucional e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.
SNP Seleção e Genotipagem
selecção SNP tem sido previamente descrito [5]. Resumidamente, determinamos a estrutura genética de
APC
e
CTNNB1
usando dados de genótipos publicamente disponíveis a partir do consórcio HapMap [6]. De acordo com HapMap CHB (Han chinês em Pequim, China) dados sobre a população, um total de 78 SNPs e 36 SNPs com uma frequência menor alelo (MAF) 0,10 durou 20 kb de 5 ‘a montante e 10 kb de 3’ a jusante de
APC
e
CTNNB1
genes, respectivamente (cromossomo 5:112081483- 112219834 para
APC
, cromossoma 3:41196016- 41.266.938 para
CTNNB1
) . Usando o algoritmo Tagger [7] implementado no programa HaploView [8] e os dados de genotipagem densas da população HapMap CHB, identificamos 7 e 5 tSNPs de desequilíbrio de ligação para capturar variações genéticas não medidos com
r
2 maior que 0,8 em
APC
e
CTNNB1
, respectivamente.
o DNA genômico foi extraído de sangue periférico usando o Kit DNA QIAamp sangue Mini (Qiagen, Valencia, CA, EUA ) e armazenado a -80 ° C até o tempo de estudo. A genotipagem foi realizada como descrito anteriormente [9] usando Sequenom Iplex assistida por matriz dessorção /ionização por laser de tempo de voo (MALDI-TOF), tecnologia de espectrometria de massa no Centro Nacional de Genoma Medicina, Academia Sinica, Taiwan. A taxa média de chamada genótipo para esses SNPs foi de 98,9%. Qualquer SNP que não se conformava com Hardy-Weinberg (
P Art 0,001) foi removido (n = 2). Assim, foram incluídos um total de 10 tSNPs para mais análises estatísticas.
Análise Estatística
características clinicopatológicas dos pacientes foram resumidas como número e porcentagem de pacientes ou mediana e intervalo interquartil (IQR) de valores. A idade foi dicotomizada no valor mediano dentro do grupo. antigénio carcinoembrionário nível (CEA) foi dicotomizados a 5 ug /L por causa da sua correlação com uma fase crescente do cancro colorrectal [10]. As associações de 10 SNPs individuais e características clínicas com metástase-free distante e sobrevida global foram avaliados através da análise de Kaplan-Meier com o teste de log-rank. ordem superior interações SNP-SNP foram avaliados por meio de análise de árvore de sobrevivência por software STREE (https://c2s2.yale.edu/software/stree/), que usa o particionamento recursivo para identificar subgrupos de indivíduos com risco semelhante de morte [11]. A estrutura em árvore começa com a raiz que inclui toda a população de estudo, e usa a estatística log-rank para selecionar divisão ideal que classificam os pacientes em grupos de baixo e alto risco. O procedimento recursiva continua a produzir grupos subsequentes que são mais homogênea do que o grupo original. O modelo final é uma estrutura de árvore com muitas separações binárias, cada terminal e representa um sub-grupo de pacientes com diferentes riscos de morte com base no genótipo combinações distintas. A análise de Kaplan-Meier com o teste log-rank em seguida, foi utilizada para estimar os sobreviventes entre cada um dos subgrupos de terminais. Multivariada para determinar a interdependência dos genótipos e outros fatores prognósticos conhecidos, tais como a idade no momento do diagnóstico, sexo, níveis de CEA, a diferenciação do tumor, estágio, invasão linfática, invasão perineural e comprometimento de linfonodos, foram realizados utilizando Cox modelo de regressão de riscos proporcionais . Statistical Package for the Social Sciences versão do software 19.0.0 (IBM, Armonk, NY) foi usado para outras análises estatísticas. A
P valor
de dois lados do 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
Os dados demográficos dos pacientes com câncer colorretal são apresentados na Tabela 1. Durante a mediana. acompanhamento de 54,5 meses, 30 pacientes desenvolveram metástases à distância ea taxa de sobrevida livre de metástases à distância de 2 anos foi de 87,1%. Noventa e dois pacientes morreram após um acompanhamento médio de 50,0 meses ea taxa de sobrevida global em 5 anos foi de 68,3%. As variáveis clínicas significativamente associados com a sobrevida metástase-livre e em geral distante incluídos diferenciação do tumor, estágio, invasão linfática e comprometimento de linfonodos. Idade só foi associada com a sobrevivência distante livre de metástases, e sexo, níveis de CEA e invasão perineural só foram associados com sobrevida global.
Um total de 10 tSNPs dentro
APC Comprar e
CTNNB1
foram analisados. Foi avaliada a associação de cada SNP indivíduo com status de sobrevivência sob modelos dominantes, recessivos e aditivos usando o teste log-rank (Tabela S1). Nós não observamos associação notável de tSNPs em genes via Wnt com sobrevida livre de metástases, a sobrevida global, e as características clínicas listadas na Tabela 1 (dados não mostrados). Portanto, mais explorado ordem interações mais elevados SNP-SNP para avaliar se as interações entre esses tSNPs poderia determinar os resultados clínicos. A análise da árvore de sobrevivência identificadas interações genéticas de ordem superior entre
APC
rs565453,
CTNNB1
2.293.303, e
APC
rs1816769, e a estrutura da árvore final identificou quatro subgrupos terminais com baixa, médio e alto risco de morte de acordo com a análise de Kaplan-Meier (Figura 1A). Desde subgrupos 1 e 6 tiveram muito poucos casos (16 e 33 pacientes, respectivamente) e tinha riscos semelhantes, combinamos eles como o grupo de baixo risco. O baixo risco grupo perfil genético tiveram uma taxa de sobrevida global em 5 anos de 89,2%. Em comparação, o grupo de médio risco teve uma taxa de sobrevida global em 5 anos de 66,1% ea taxa de risco (HR) foi de 3,25 [95% de intervalo de confiança (IC): 1,40-7,54,
P = 0,006
, A Figura 1B e Tabela 2]. O grupo de alto risco tiveram uma taxa de sobrevida global em 5 anos de 58,8% e o HR foi de 4,39 (IC 95%: 1,82-10,6,
P
= 0,001). No entanto, não se observou interacção genética para a sobrevida livre de metástases à distância. Análise
(A) Árvore Survival identifica as interações entre os três polimorfismos. curvas (B) de Kaplan-Meier de sobrevida global com base na análise da árvore de sobrevivência. Os números entre parênteses indicam o número de pacientes.
Para avaliar os efeitos de previsão do perfil de interacção genética para além das características clínicas de influenciar a sobrevida global, foi realizada uma análise multivariada, o ajuste para idade, sexo, níveis de CEA, diferenciação do tumor, estágio, invasão linfática, invasão perineural e comprometimento de linfonodos. Depois de controlar esses preditores, a interação genética permaneceu significativo. Em comparação com o grupo de perfil genético de baixo risco, o grupo de risco médio apresentado um risco 3,67 vezes maior de morte (HR ajustado: CI 3,67, 95%: 1,43-9,44,
P
= 0,007, Tabela 2), e o grupo de alto risco tinham um risco aumentado 4,57 vezes maior de morte (HR ajustado: CI 4,57, 95%: 1,73-12,1,
P
= 0,002). Estes dados sugerem que o perfil de interacção genética entre SNPs via Wnt poderia ser um preditor independente resultado para o cancro colorectal.
Discussão
Este estudo avaliou o significado prognóstico de variantes genéticas comuns no Wnt /APC /genes da via CTNNB1 sobre a sobrevivência em pacientes com câncer colorretal. Um perfil de interacção genética de ordem superior que consiste no
APC
rs565453,
CTNNB1
2.293.303, e
APC rs1816769 foram associados com sobrevida global. Notavelmente, as relações entre o perfil de interacção genética e sobrevivência persistiu apesar de o controle de fatores prognósticos clínicos conhecidos.
APC é geralmente considerado um componente-chave da via de sinalização Wnt, e acredita-se que sua função primária como supressor de tumor a ser a sua capacidade para regular negativamente a via de Wnt. rs565453 está localizado em 3 ‘a jusante do
APC
gene, e está previsto para alterar um factor de transcrição putativo local para o factor de transcrição de ligação OCT1, de acordo com a previsão de SNP Função Portal [12]. OCT1 expressão é aumentada em muitos cancros humanos e tem sido sugerido para ser associado com o aparecimento ou progressão de cancro ou com a resistência de células tumorais para a radioterapia ou a quimioterapia [13]. Embora
APC
rs1816769 no intron 4 não tem nenhuma função previu, ele localiza em um elemento transponível mamíferos putativa, L1MC4a. Os elementos de transposição no genoma humano são previamente consideradas inofensivas, mas agora conhecido por ter efeitos sobre a expressão genética por meio de modificação da qualidade ou quantidade de transcrição, a interferência transcricional, ou pelo controlo de vias que afetam o ciclo de vida do ARNm [14]. CTNNB1 é não só um efectora chave nuclear de sinalização Wnt no núcleo, mas também uma componente estrutural de junções aderentes à base de caderina. Desequilíbrio nas propriedades estruturais e de sinalização de CTNNB1 muitas vezes resulta em crescimento desregulado ligado ao cancro e metástase [15].
CTNNB1
rs2293303 é um SNP de codificação sinónimo, mas o alelo de risco, T, é predito para interromper um motivo putativo exônico splicing potenciador responsivo à proteína humana SR SF2 /ASF. Portanto, é plausível que esses SNPs podem influenciar APC /CTNNB1 splicing e de expressão, alterando as sequências de consenso de emenda do local, os elementos transponíveis, e o fator de transcrição sítios de ligação. Além disso fine-mapeamento e análises funcionais são necessários para identificar os potenciais SNPs causadores e entender os papéis de APC /CTNNB1 na progressão do cancro colorectal.
Em resumo, este pode ser o primeiro estudo a avaliar sistematicamente o uso de tSNPs em
APC
e
CTNNB1
genes para prever resultados em pacientes com câncer colorretal. Descobrimos que um perfil de interacção genética de ordem superior entre os SNPs via Wnt foi associado à sobrevida global, mesmo após o ajuste para preditores clínicos de resultado. Os resultados aqui relatados são limitados pela análise do pequeno número de pacientes. Além disso, nossa homogênea população chinesa Han pode fazer os nossos resultados menos generalizáveis a outros grupos étnicos. estudos externos independentes são necessários para validar os nossos resultados. Se validados, estes biomarcadores podem ser valiosas para facilitar as decisões de tratamento individualizado.
Reconhecimentos
Agradecemos Centro Nacional de Genotipagem do Programa Nacional de Pesquisa de Medicina Genômica, Conselho Nacional de Ciência, Taiwan, por seu apoio técnico .
Informações de Apoio
Tabela S1.
genotipados polimorfismos e
valores P
de sua associação com a sobrevida livre de metástases à distância e sobrevida global.
doi: 10.1371 /journal.pone.0056196.s001
(DOC)