Abstract

Objectivo

Nas células cancerosas humanas da próstata, uma Epac agonista selectivo, 8-CPT-AMPc-2Me, regula positivamente a proliferação e sobrevivência celular através da activação de Ras-MAPK e cascatas PI- 3-cinase-Akt-mTOR sinalização. Aqui nós examinamos o papel de mediadores inflamatórios na proliferação celular induzida por Epac1 através da determinação da expressão dos marcadores de pró-inflamatórias p-cPLA2, a COX-2, e PGE

2 em células de cancro da próstata tratados com 8-CPT-2Me- cAMP.

Métodos

Nós utilizados inibidores de COX-2, mTORC1 e mTORC2 para sondar vias dependente de AMP cíclico em células cancerosas humanas da próstata. RNAi visando Epac1, Raptor, e Rictor também foi empregada nesses estudos.

Resultados

tratamento de 8-CPT-2Me-cAMP causou um aumento de 2-2,5 vezes de p-cPLA2

S505, a COX-2, e PGE

2 níveis em linhas celulares de cancro da próstata humano. O pré-tratamento de células com o inibidor de COX-2 SC-58125 ou o antagonista de EP4 AH-23848, ou com um inibidor de mTORC1 e mTORC2, Torin1, reduziu significativamente o aumento Epac1-dependente de p-cPLA2 e COX-2, P-S6 -kinase

T389, e p-AKT

S473. Além disso, Epac1 induzida por proteína e síntese de DNA foram grandemente reduzida após pré-tratamento de células com inibidores de COX-2, quer, EP4, ou mTOR. A transfecção de células cancerosas da próstata com Epac1 dsRNA, Raptor dsRNA, ou Rictor dsRNA reduzida profundamente aumentos Epac1-dependentes em p-cPLA2 e COX-2.

Conclusão

Nós mostramos que Epac1, a jusante efector de cAMP, funciona como um modulador pró-inflamatória em células de cancro da próstata e promove a proliferação celular e sobrevivência por upregulating Ras-MAPK, e sinalização de PI 3-cinase-Akt-mTOR

citação:. Misra Reino Unido, Pizzo SV (2013) Evidência para a-proliferativa Pro ciclo de feedback em Câncer de próstata: O Papel da Epac1 e COX-2 dependente Pathways. PLoS ONE 8 (4): e63150. doi: 10.1371 /journal.pone.0063150

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de janeiro de 2013; Aceito: 29 de março de 2013; Publicação: 30 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Misra, Pizzo. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório

CONFLITO dE iNTERESSES:. SVP é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de próstata é o tumor maligno mais comumente diagnosticado dos homens [1]. Vários factores de promover o crescimento e a progressão do cancro da próstata. Existe uma associação bem conhecida entre a aquisição de crescimento independente de androgénios e potencialmente um maior risco de metástase [2]. Há também uma evidência crescente de que as alterações inflamatórias em tumores da próstata pode promover o crescimento do [3] – [8]. Aproximadamente 15-20% de todas as mortes por câncer em todo o mundo estão ligados à infecção e inflamação [9]. Embora estas mortes pode ser atribuída principalmente a estes processos, patológicas, molecular, e estudos epidemiológicos suportam a hipótese de que a inflamação crónica está associada à progressão do cancro [10]. O microambiente inflamatório de tumores é caracterizada pela presença de leucócitos hospedeiras tanto no estroma do tumor e áreas de apoio [11]. Além disso, o meio de tumor contém mediadores inflamatórios tais como citoquinas, quimiocinas, espécies reactivas de oxigénio, e prostaglandinas [3] – [8]. o desenvolvimento do cancro, na presença de inflamação crónica envolve ciclo-oxigenase-2 (COX-2), e a activação de vários factores de transcrição NFkB, incluindo, STAT3, proteína-1 do activador, e hipoxia 1α indutíveis factor de [3] – [8].

prostaglandinas e os leucotrienos são importantes moduladores que medeiam a diafonia entre as células epiteliais e as suas células do estroma que rodeiam [3] – [7]. O ácido araquidónico (AA) é um dos principais ingredientes de gordura animal e os lípidos biologicamente activos derivados deste substrato tem um papel crucial na inflamação crónica e cancro. Após a estimulação celular, o AA é libertado a partir de fosfolípidos de membrana por p-cPLA2 e, em seguida, convertido em diferentes prostaglandinas (PGs) por enzimas específicas [6], [12]. A COX-2 é a isoforma indutível da enzima limitante da velocidade que converte AA em prostaglandinas pró-inflamatórias. Entre estes PGE

2 desempenha um papel predominante na promoção do crescimento do tumor. PGE

2 eleva a expressão da proteína anti-apoptótico Bcl-2 e activa a geração de cAMP [13]. PGE

2 aumenta a expressão Epac, ativação Rap1 e Akt fosforilação [14], [15]. Sob condições normais, a expressão de COX-2 é baixa ou não foi detectada na maioria dos tecidos; No entanto, a sua sobre-expressão em conjunto com a activação da PLA2 citosólica por fosforilação é uma característica de reacções inflamatórias [16]. Diversas vias de transdução de sinal de regulação da COX-2, incluindo a expressão do gene Ras-MAPK, PKA, PKC e [17] – [20]. A sobre-expressão de COX-2 ocorre no cancro da mama, pulmão, cólon, e cancros da próstata [3] – [8].

In vitro

, linhas cancerosas humanas da próstata PC-3, DU145 e LnCap expressam COX-2 [6], [12]. A inibição da COX-2 diminui a proliferação e /ou regula positivamente a apoptose em ambas as culturas de células de cancro da próstata humano de androgénio-dependentes e independentes. O tratamento de células LNCaP com a NS398 inibidor de COX-2 celecoxib ou induz apoptose e diminui a expressão de Bcl-2,

In vivo,

e inibição de Cox-2 suprime a invasão de DU-145 e PC-3 de células [12 ]. O tratamento de ratinhos PC-3 que possui o tumor com NS-398 suprime a proliferação de células tumorais e induz a regressão de tumores [21]. Um efeito adicional é que os inibidores de COX-2 suprimem supra-regulação de VEGF, que é importante para a angiogénese tumoral [3] – [7], [12]. associada à inflamação agressividade histológica em cancros da próstata está correlacionado com um aumento nos níveis de PSA [22]. Em ensaios clínicos de pacientes com câncer de próstata, inibidores COX-2 causar uma diminuição no antígeno específico da próstata níveis (PSA) e de células tumorais tempo de duplicação. Além disso, a COX-2 de activação e aumento dos níveis de PGE

2 ocorrem em pacientes com tumores [23] – [26]. PGE

2 atua através de quatro receptores de superfície celular conhecidas como EP1, EP2, EP3 e EP4 [27] – [31].

PGE

2 receptores expressos por linhas de cancro da próstata humano são da EP2 e EP4 subtipos [28]. A ligação de PGE

2 para EP2 é acoplado a proteínas G, que activam a adenilato-ciclase de levando a um aumento no AMPc intracelular. Isto activa cinases tais como PKA, EPACs, a PI 3-quinase, e GSKβ3. PGE

2 aumenta mRNA receptor EP2, aumenta os níveis de cAMP, e aumenta a proliferação celular. A expressão de receptores EP2 e EP4 é aumentada significativamente durante a progressão do cancro da próstata e a expressão ectópica de estes receptores em células LNCaP aumenta a produção de PSA [32].

O alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é um Ser /Tre quinase que integra sinais de estímulos externos [33] – [39] regula diversos processos, incluindo a proliferação celular. mTOR existe em dois complexos distintos, mTOR1 e mTORC2. Vários estudos recentes demonstram que a PGE

2 regula positivamente mTORC1 e sinalização mTORC2. Por exemplo, a sobrevivência de células endoteliais PGE

2-mediada é regulada por mTORC2 [40]. PGE

quimiotaxia 2-mediadas e libertação de quimioquinas a partir de mastócitos é regulado por activação mTORC2 e esta é reduzida pelo pré-tratamento de células com o inibidor activo local mTOR Torin1 [41]. Além disso, a inibição de COX-2 e mTOR mostrar efeitos anti-tumorais directos e indirectos em cancros, e tanto o celecoxib e rapamicina causar inibição do crescimento tumoral significativa [42]. mTORC1 além de mTOR, contém a proteína reguladora associada de mTOR (rapina), e um conjunto de outras proteínas reguladoras [33] – [39]. Raptor regula a montagem de mTORC1, recrutamento de substratos quinase e localização subcelular de mTORC1. Akt activa mTORC1 por fosforilar directamente o complexo TSC1 /TSC2 inibindo assim a sua actividade e libertação de GAP Rheb ligada a GTP para activar mTORC1 [33] – [39]. Quando ativado, mTORC1 fosforila dois principais reguladores do mRNA tradução e gênese dos ribossomas, a p70 S6-quinase (S6-quinase) e 4EBP1, estimulando assim a síntese de proteínas [33] – [39]. O complexo mTORC2, além de mTOR, contém companheiro rapina-independente de mTOR (Rictor) e outras proteínas reguladoras. mTORC1 e mTORC2 fosforilar substratos diferentes para regular funções celulares distintas. mTORC1 estimula a proliferação de células, aumentando a iniciação da tradução dependente de tampa que é mediada pelos seus dois principais alvos a jusante de quinase S6 e 4EBP. mTORC2 é insensível a tratamento agudo com rapamicina e regula vários processos, incluindo a proliferação celular e sobrevivência, por fosforilação quinases tais como Akt, SG-quinase, e PKC [33] – [39]. A perda ou inactivação de supressores de tumor tais como p53, LKB1, PTEN, e TSC1 /2, que antagonizam activação de PI 3-quinase dependente de mTORC1, pode promover a tumorigénese através da sinalização aumentada [33] – [39]. níveis e /ou fosforilação de alvos a jusante de mTORC1 aumento ocorrer em várias malignidades humanas e correlacionar com o comportamento agressivo do tumor e mau prognóstico [33] – [39]. mTORC2 actividade é necessária para o desenvolvimento de cancro da próstata causado por supressão PTEN [43].

AMPc regula uma grande variedade de processos, incluindo a proliferação e apoptose através dos efectores a jusante, incluindo a PKA. O efeito de AMPc é idiossincrática e podem inibir ou estimular a proliferação celular de um modo dependente ou PKA PKA independente [44], [45]. Nas células em que o cAMP estimula a proliferação celular de um modo independente PKA, cAMP activa Rap1 através Epac [45] – [48]. Aqui os efeitos de AMPc são mediados pela PI 3-quinase /AKT de sinalização [45] – [48]. O tratamento de células de cancro da próstata com o agonista Epac 8-CPT-2Me-AMPc regula positivamente a expressão Epac1, activação Rap1, a activação de MAPK, fosforilação de Akt no T308 e S473 em uma PI 3-cinase dependente e mTORC1 e mTORC2 activação, tal como avaliado por fosforilação de S6 -kinase no T389, 4EBP1 em T37 /36 e Akt em resíduos S473, respectivamente [47],. Silenciamento expressão Epac1 por RNAi ou pré-tratamento com PI 3-quinase ou inibidores de mTOR inibe a regulação positiva de 8-CPT-2Me induzida por cAMP de activação Epac1 de MAPK, mTORC1, e sinalização mTORC2, e ADN e síntese de proteínas, em última análise [47], [48 ]. EPAC produção casais cAMP para Rap1 e PI activação 3-quinase. Rap1, que é frequentemente elevados em linhas celulares de cancro da próstata altamente metastáticas, regula os sinais envolvidos na proliferação celular, sobrevivência, e metástase [49]. Epac1 é regulada positivamente após a inflamação e desempenha um papel crítico na activação de PGE-dependente de PKC

2 sinalização através da activação de Rap1 [50].

Como apresentado acima, a inflamação crónica promove a iniciação do tumor, proliferação e metástase de hiperregular o inibidor de COX-2-PGE

2 cascata de sinalização do AMPc. 8-CPT-AMPc-2Me, um análogo específico de cAMP, liga-se a Epac1, mas não PKA. Em células de cancro da próstata, este análogo causa regulação positiva de Epac1, Rap1GTP, a síntese de proteínas, síntese de ADN, e MAPK, e PI-quinase de sinalização 3-Akt-mTORC1-mTORC2. Como consequência, a síntese de ADN e proteína são estimulados. Estes efeitos são regulados negativamente pelo pré-tratamento de células com inibidores de MAPK, a PI 3-cinase, mTORC1, ou RNAs que alvejam Epac1, rapina, ou Rictor [47], [48]. Aqui, consideramos a hipótese de que Epac1 funciona como um mediador inflamatório no cancro da próstata através da promoção da proliferação celular e sobrevivência. Foi investigada a regulação dos marcadores pró-inflamatórias p-cPLA2, a COX-2, e PGE

2 em três linhas de células de cancro da próstata humanas tratadas com 8-CPT-AMPc-2Me. O pré-tratamento de células com inibidores da COX-2, um inibidor mTORC1 e mTORC2, ou a transfecção de células com ARNdc Epac1, rapina ARNcd, ou Rictor ARNcd regulada negativamente indução de 8-CPT-AMPc-2Me de p-cPLA2, e COX-2. proliferação de células de cancro foi também suprimida. Assim, enquanto PGE

2 regula a produção de cAMP e Epac-activação, a activação Epac também resulta em COX-2 dependente da PGE

2 de produção. O resultado líquido é um processo cíclico autócrina-como dirigir a proliferação de células do cancro da próstata através de regulação positiva de Ras-MAPK e PI sinalização de 3-quinase-Akt-mTOR.

Materiais e Métodos

Materiais

Os meios de cultura foram adquiridos a Invitrogen. 8-CPT-AMPc-2Me foi comprado de Axxora LLC (San Diego, CA). Os anticorpos contra mTOR, P-Akt

S473, Akt1, S6-quinase, p-S6-cinase

T389, P-cPLA2

Ser505 e cPLA2 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Os anticorpos contra Epac1, a COX-2, rapina, Rictor, EP2, EP4 e foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos anti-actina foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO). [

3H] timidina (actividade específica 174 Ci /mmol e [

3H] leucina (actividade específica 115,4 Ci /mmol) foram obtidos de Perkin-Elmer Life Sciences. Todos os outros materiais utilizados eram de grau analítico e foram obtidos localmente. inibidor COX-2 SC-58125 ou o antagonista de EP4 AH23848 foram adquiridos a Caymon (Ann Arbor, MI) e Torin1 foi adquirido a Tocris Biosciences (Minneapolis, MN).

linhas celulares de cancro da próstata humano

neste estudo, foram utilizados três linhas de células de cancro da próstata humano, 1-LN, DU145 e PC-3. Tal como descrito anteriormente [51], a linha celular de cancro da próstata 1-LN altamente metastático foi obtido na instituição de uma metástase das células PC-3 menos metastático em camundongos nus e foi um presente amável do Dr. Philip Walther (Duke University Medical Center, Durham, NC). Estas células estão disponíveis mediante solicitação. DU-145 e células PC-3 foram adquiridos a partir de ATCC. As plantas foram cultivadas em 6, 12, ou placas de 48 poços em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, glutamina 2 mM, 12,5 unidades /ml de penicilina, 6,5 ug /ml de estreptomicina e 10 nM de insulina (RPMI-S ) num humidificada de CO

2 incubadora a 37 ° C. Depois de atingir 90% de confluência, o meio foi aspirado e um volume fresco do meio RPMI-S adicionado e as células foram utilizadas para as experiências descritas abaixo.

qualitativo de PCR para a COX-2, EP2, EP4 e na próstata células cancerosas estimuladas com 8-CPT-AMPc-2Me

1-LN, células de cancro da próstata DU145 PC-3, e foram cultivadas como acima. Depois de atingir 90% de confluência, as células foram lavadas duas vezes com solução salina equilibrada de Hanks contendo HEPES a 10 mM, pH 7,4, 3,5 mM e NaHCO

3 (HHBSS). Um volume de meio fresco RPMI-S foi, em seguida, adicionados e as células foram incubadas durante 5 min para o equilíbrio da temperatura. As células foram expostas quer a tampão ou 8-CPT-AMPc-2Me (100 uM) durante 30 minutos e incubou-se como acima. A reacção foi terminada por aspiração do meio. O ARN total a partir das células foi extraído utilizando RNeasy Minikits (QIAGEN, Valentia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN foi quantificado por absorvância a 260 nM. O ARN total foi transcrito de forma inversa com 1 ug de ARN numa reacção de 20-ul, utilizando o vírus da leucemia murina de Moloney de transcriptase reversa (200 unidades) e o oligo (dT) como o iniciador durante 1 h a 40 ° C. O ADNc resultante (5 ug) foi utilizada como um molde, e um segmento de 225 pb do ADNc de COX-2, EP2 e EP4 foi amplificado utilizando um 20-mero os iniciadores a montante para (1) COX-2 para a frente; (5′-TGG TCT GGT GCC TGG TCT G -3 ‘) e um inibidor de COX-2-reverso (5′-AGC CTG AGT ATT CTT GTC TGG AAC-3′); (2) EP2-forward: (5’- TTC ATC CGG CAC GGG CGG ACC GC -3 ‘) e EP2-reverse (5’CCT CCT GAG AAA GAC AGT GCT-3′); e (3) EP4-forward: (5’- CCT CCT GAG AAA GAC AGT GCT-3 ‘) e EP4-reverse (5′-AAG ACA CTC TCT GAG TCCT -3’). Um segmento de 302 pb de rato β-actina (controlo interno constitutiva) de ADNc foi co-amplificada utilizando um conjunto de iniciadores fornecidos numa R D Systems kit (Minneapolis, MN). A amplificação foi realizada em um termociclador Biometra PM3 2:01 para 28 ciclos (um ciclo: 94 ° C durante 45 s, 60 ° C durante 45 s e 70 ° C durante 45 s). Os produtos de PCR foram analisados ​​num gel de agarose /brometo de ethedium 1,2%. Os géis foram fotografados e a intensidade de bandas de ARNm de p-actina de COX-2, EP2 e EP4 e mRNA foi quantificado.

Medição da cPLA2, a COX-2, Epac1, EP2, EP4 e expressão em células de cancro da próstata estimuladas com 8-CPT-AMPc-2Me por blotting

células cancerosas da próstata Western (3 × 10

6 células /poço em placas de 6 poços) foram incubadas durante a noite em meio RPMI-S e lavada duas vezes com HHBSS frio. Um volume de meio RPMI-S foi então adicionada a cada poço. Depois de se equilibrar a temperatura, as células nos respectivos poços foram expostas a tampão ou 8-CPT-AMPc-2Me (100 pM /30 min) e incubou-se como acima. As reacções foram interrompidas por aspiração do meio e um volume de tampão de lise, contendo 50 mM de Tris • HCl (pH 7,5), NaCl 120 mM, 1% de Nonidet P-40, 2,5 fluoreto de sódio mM, pirofosfato de sódio 1 mM, ortovanadato de sódio 0,1 mM , PMSF 1 mM, benzamidina 1 mM e leupeptina (20 ng /ml), sobre gelo durante 20 min. Os lisados ​​celulares foram raspadas para novos tubos de Eppendorf e centrifugado durante 5 min a 800 x g a 4 ° C e foram determinados os conteúdos de proteína de lisados. Para quantidades iguais de lisado de proteína, foi adicionado um volume de tampão de amostra 4x e as amostras foram fervidas durante 5 min. As amostras foram sujeitas a electroforese em 10% ou gel de poliacrilamida a 12,5%, transferidos para uma membrana de PDVF, e imunotransferidas para p-cPLA2S505, a COX-2, Epac1, EP2, EP4 e. As bandas de proteína foram detectadas e quantificadas por ECF e imagiologia com fósforo em uma tempestade 860 Phosphorimager. As respectivas membranas foram sondado para a proteína alvo não fosforilada ou actina. A especificidade dos anticorpos foi determinada por tratamento da célula com os anticorpos não-imunes e lisados ​​de células transformadas como acima. Sob as condições experimentais, não foi observada nenhuma reactividade destes controlos.

Medição da PGE

2 em células de cancro da próstata estimulada com 8-CPT-AMPc-2Me

células cancerosas da próstata (3 × 10

6 células /poço em placas de 6 poços) foram incubados durante a noite como acima, em meio RPMI-S e lavada duas vezes com HHBSS frio e um volume de meio RPMI-S foi então adicionada a cada poço. Depois de se equilibrar a temperatura, as células nos respectivos poços foram expostas quer tampão, ou 8-CPT-AMPc-2Me (100 pM /30 min) e incubou-se como acima. As reacções foram interrompidas por aspiração do meio e um volume de tampão de lise foi adicionada durante 20 min. Os lisados ​​celulares foram raspadas para novos tubos de Eppendorf e centrifugado durante 5 min a 800 x g a 4 ° C e determinou-se o conteúdo de proteína dos lisados. PGE

2 níveis em lisados ​​de células foram determinadas com um kit de ELISA (ENZO Life Sciences) de acordo com as instruções do fabricante.

Medição da síntese de proteínas em células de cancro estimulado com 8-CPT-AMPc-2Me

células cancerosas da próstata (300 × 10

3 células /cavidade em placas de 48 poços) foram cultivadas em meio RPMI-S numa humidificada de CO

2 (5%) da incubadora a 37 ° C. A 90% de confluência, o meio foi aspirado e um volume de meio RPMI-S foi adicionada aos poços, seguindo-se a adição de: (1) tampão; (2) 8-CPT-AMPc-2Me (100 pM /16 horas); (3) (1 uM AH23848 /3 h); (4) o AH23848 1 uM /3 h), em seguida, 8-CPT-AMPc 2Me; (5) SC58125 (1 uM /3 h); (6) SC58125 1 uM /3 h), em seguida, 8-CPT-AMPc-2Me; (7) Torin1 (250 nm /3 h); ou (8) Torin1 (250 nm /3 h), em seguida, 8-CPT-AMPc-2Me. [

3H] leucina Adicionou-se então (2 uCi /ml) e as células foram incubadas durante a noite como acima. As reacções foram terminadas por aspiração do meio e as monocamadas foram lavadas duas vezes com gelada TCA a 5% e as células foram lavadas três vezes com PBS arrefecido em gelo. As células foram lisadas num volume de NaOH 1 N (40 ° C, 2 h), concentração de proteína foi estimada e os lisados ​​foram contadas num contador de cintilação líquida de [47], [48].

medição da síntese de ADN 1 em células de LN-estimuladas com 8-CPT-AMPc-2Me

células de cancro da próstata (3 × 10

3 células /cavidade em placas de 48 poços) foram cultivadas em meio RPMI-S) numa CO humidificada

2 (5%) da incubadora a 37 ° C. A 90% de confluência, o meio foi aspirado e foi adicionado um volume de meio RPMI-S, seguindo-se a adição de compostos como descrito acima. [

3H] timidina foi então adicionado (2 uCi /ml) e as células foram incubadas durante a noite. As reacções foram terminadas por aspiração e as monocamadas de células médias foram lavadas duas vezes com gelada TCA a 5% seguido de três lavagens com PBS arrefecido em gelo. As células foram lisadas num volume de NaOH 1 N (40 ° C /2 horas), a concentração de proteína foi estimada e os lisados ​​foram contadas num contador de cintilação líquida [47], [48].

Medição da COX -2 ou efeitos inibidor de mTOR em 8-CPT-AMPc-2Me induzida por regulação positiva de p-CPLA

2, e a COX-2

células cancerosas da próstata (3 × 10

6 células /6 bem placas incubadas durante a noite) em meio RPMI-S foram lavadas duas vezes com HHBSS frio e um volume de meio RPMI-S foram adicionados a cada poço. As células nos respectivos poços foram tratados tal como descrito acima. As reacções foram interrompidas por aspiração do meio e um volume de tampão de lise foi adicionado em gelo durante 20 min. Os lisados ​​celulares foram raspadas para tubos de Eppendorf e centrifugado durante 5 min a 800 x g a 4 ° C e o conteúdo de proteína dos lisados ​​determinados. As amostras foram em seguida estudados como descrito acima.

Medição da COX-2 e inibidores de mTOR efeitos em 8-CPT-AMPc-2Me-induzida por regulação positiva de p-S6-cinase

T389 em imunoprecipitados de rapina células de cancro da próstata

a fosforilação da quinase S6-a T389 é considerado uma medida da activação mTORC1. células de cancro da próstata (3 × 10

6 células /poço em placas de 6 poços) incubadas durante a noite em meio RPMI-S foram lavadas duas vezes com HHBSS frio e um volume de meio RPMI-S foi adicionado a cada poço. As células em respectivos poços foram tratados tal como descrito acima. As reacções foram interrompidas por aspiração do meio e adição de um volume de tampão CHAPS a lise, contendo HEPES 40 mM (pH 7,5), NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, pirofosfato de sódio 10 mM, β-glicerofosfato 10, ortovanadato de sódio 0,5 mM, 0,3 % de CHAPS e cocktail de inibidores de protease Roche (1 comprimido /10 ml). As células foram lisadas em gelo durante 20 min. Os lisados ​​celulares foram raspadas para novos tubos de Eppendorf e centrifugado durante 5 min a 800 x g a 4 ° C e, em seguida, foi determinado o conteúdo de proteína dos lisados. Quantidades iguais de proteína de lisado (200-250 g) foram imunoprecipitados com anticorpos Raptor (1:50) Gato Santa Cruz não. SC 81537), seguido pela adição de 40 ul de proteína A agarose. As misturas foram incubadas durante a noite com rotação a 4 ° C. Raptor imunoprecipitados foram recuperadas por centrifugação (2000 rpm /5 min /4 ° C) e lavou-se duas vezes com tampão de lise frio de CHAPS. Um volume de 4 × tampão de amostra foram adicionados às amostras que foram então fervidas durante 5 min, centrifugou-se a electroforese (10% de gel de acrilamida), transferidos para membrana Hybond-P. As membranas foram imunotransferidas com anticorpos contra a P-S6-cinase

T389. As bandas de proteínas foram detectadas por ECF e quantificado em uma tempestade

860 Phosphorimager [47], [48].

Medição da activação mTORC2 por fosforilação de Akt

S473 em Rictor imunoprecipitados de células cancerosas estimulada com 8-CPT-AMPc-2Me

a fosforilação de Akt em S473 por Rictor é considerado uma medida da actividade mTORC2. células de cancro da próstata (3 × 10

6 células /poço em placas de 6 poços) incubadas durante a noite em meio RPMI-S foram lavadas duas vezes com HHBSS frio, e um volume de meio RPMI-S foi adicionado a cada poço. Investigou-se o efeito dos inibidores da COX-2 e o inibidor de mTOR Torin1 sobre a fosforilação de Akt

S473 rictor em imunoprecipitados de células LN-1 sob as condições descritas acima. As reacções foram terminadas por aspiração do meio e adição de um volume de tampão de lise de CHAPS (tampão B). As células foram lisadas em gelo durante 15 min. Quantidades iguais de proteína de lisado (200-250 ug) foram imunoprecipitados com anticorpos anti-rictor (1:50, Santa Cruz, CA, ca # 81538) pela adição de 40 ul de proteína A agarose de lamas. Os conteúdos foram incubados com rotação durante a noite a 4 ° C. rictor imunoprecipitados foram lavados com (1) tampão de lise B suplementado com NaCl 0,5 M; (2) tampão de lise B; e (3) Tris • HCl (pH 7,4) suplementado com 1 mM de DTT, 1 mM de PMSF, e benzamidina 1 mM, por centrifugação a 2500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Para Rictor imunoprecipita um volume de 4 × tampão de amostra foi adicionado, e as amostras fervidas durante 5 min. Após centrifugação, o sobrenadante foi sujeito a electroforese em géis de poliacrilamida a 10%, proteína transferida para uma membrana de PVDF e coradas imunologicamente com anticorpos contra a P-AKT

S473. As bandas de proteína foram visualizadas e quantificadas por ECF e imagiologia com fósforo. As respectivas membranas foram sondado para Akt como o controlo de carga [47], [48].

Os efeitos de silenciamento do gene Epac1 sobre a COX-2 de expressão em células cancerosas estimuladas com 8-CPT-AMPc-2Me

Para determinar o papel de Epac1 na activação de mTORC2 em células de cancro da próstata tratados com 8-CPT-AMPc-2Me, a expressão de Epac1 foi silenciado por RNAi [47], [48]. A síntese química de ARNcd homóloga à sequência peptídica alvo Epac1 sequência de ARNm s204VAHLSN209 5′-GGC TGT CCT CCA CAA CTC CTC-3 ‘(Swiss Prot Epac1 número de acesso primário 0953958) foi realizada por Ambion (Austin, TX). dsRNAs foram preparados por recozimento sentido 5’- UGG CCC ACC UCU CCA ACU CU-3 ‘e 5′-antisense GAG ​​UUG GAG AGG UGG GCA ACA -3’ e os fios de dsRNA recozidos foram purificados por um kit Ambion. Silenciar a expressão do gene Epac1 antes da estimulação com 8-CPT-AMPc-2Me foi conseguida por transfecção de células cancerosas com 100 nM (48 h) de Epac1 ARNcd, como descrito anteriormente [47], [48]. As células de controlo foram transfectadas com uma concentração equimolar de ARN codificado (Ambion número de catálogo 4610), como acima. A magnitude de Epac1 silenciamento em células transfectadas, tal como medido por Epac1 ARNm e os níveis de proteína Epac1, variou entre 60-65% [47], [48]. As células em placas de 6 poços foram tratadas como se segue: (1) tampão de lipofectamina +; (2) lipofectamina + 8-CPT-AMPc-2Me (100 pM /30 min); (3) Epac1 ARNdc (100 nM /48 h) + 8-CPT-AMPc-2Me (100 pM /30 min); ou (4) mexidos ARNdc (100 nM /48 h) + 8-CPT-AMPc-2Me (100 pM /30 min) e incubou-se como acima descrito. As reacções foram terminadas por aspiração do meio, foi adicionado um volume de CHAPS tampão de lise B, as células foram então lisadas em gelo durante 15 min, transferidas para tubos Eppendorf, centrifugadas (1000 rpm /5 min /4 ° C), e o os sobrenadantes transferidos para novos tubos e a concentração de proteína foi determinada. As amostras foram processadas como descrito acima.

Medição dos efeitos de silenciamento rapina ou Rictor ARNi silenciamento sobre a expressão da P-cPLA2 e COX-2 em células de cancro da próstata tratados com 8-CPT-AMPc-2Me

a transfecção de células de cancro da próstata com rapina ARNcd ou Rictor ARNcd foi efectuada tal como descrito abaixo. Para apurar ainda mais o envolvimento das mTORC1 em 8-CPT-2Me-AMPc supra-regulação induzida da S6-quinase, que silenciados a expressão do gene de rapina por RNAi, o que perturba a montagem do complexo mTORC1 e suprimir a fosforilação do seu alvo a jusante S6-cinase . O ARNi recozido de rapina foi adquirido a Sigma e consiste no sequente sentido (5′-3 ‘) UCU GCA AUU AAG UGU UGA GDT (ID # SAS1-16Hs01-00048387-AS). As células foram transfectadas com 100 nM de recozido rapina ARNcd e as células de controlo foram transfectadas com lipofectamina como descrito anteriormente [47], [48]. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células de controlo foram estimuladas com tampão, ou 8-CPT-AMPc-2Me (100 pM /30 min /37 ° C). As células para o controlo negativo foram transfectadas com ARNcd mexidos (100 nM /48 h, Ambion) e depois estimuladas com tampão ou 8-CPT-AMPc-2Me. As reacções foram terminadas por aspiração do meio e as células foram lisadas num volume de tampão B, tal como descrito acima. Para quantidades iguais de proteína de lisado, um volume de amostra de 4 × tampão adicionado, as amostras fervidas durante 5 min, centrifugadas e submetidas a electroforese em gel de poliacrilamida a 10%. As proteínas foram transferidas para membranas PVDF e coradas imunologicamente com o respectivo anti-COX-2 e anticorpos P-cPLA2. As bandas de proteína foram visualizadas e quantificadas por ECF e imagiologia com fósforo como descrito acima. As amostras foram processadas e estudados como descrito acima.

Para confirmar que a activação induzida por 2Me-AMPc-8-CPT de mTORC2 está envolvido na regulação positiva da cPLA2 e COX-2 que a expressão do gene silenciado Rictor por RNAi, que atrapalha a montagem de complexos mTORC2 e, portanto, suprimir a activação de mTORC2. A sonda siARN foi comprado de Ambion (pequeno ARN interferente ID S226002) a sequência de sentido (5′-GGG UUA GUU UAC AAU CAG -3 C ‘) e anti-sentido (5′-GCU GAU AAA UGU CUA ACC -3’). As células foram transfectadas com 100 nM de células Rictor ARNdc e de controlo recozidos foram transfectadas com lipofectamina como descrito anteriormente [47], [48]. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células de controlo foram estimuladas com tampão ou 8-CPT-AMPc-2Me (100 pM /30 min /37 ° C). As células para os controlos negativos foram transfectadas com ARNcd mexidos (100 nM /48 h, Ambion) e depois estimuladas com tampão ou 8-CPT-AMPc-2Me como acima. As reacções foram terminadas por aspiração do meio. As células foram lisadas em gelo durante 20 minutos em tampão de lise de CHAPS. Os lisados ​​foram transferidos para tubos Eppendorf, centrifugados a 800 rpm durante 5 min a 4 ° C e determinou-se o teor em proteínas dos sobrenadantes. Para quantidades iguais de proteína de lisado, um volume de tampão de amostra 4x adicionado, e as amostras foram fervidas durante 5 min, centrifugou-se, e a electroforese em gel de polyacrylalmide 10%. As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF e membranas respectivos imunotransferidas com anticorpo anti-P-cPLA2 anticorpos ou COX-2. bandas de proteínas foram visualizados e quantificados por ECF e imagiologia com fósforo.

Resultados

A sobre-regulação dos marcadores inflamatórios p-cPLA2, a COX-2, PGE

2, EP, e EP4 no cancro da próstata as células estimuladas com 8-CPT-AMPc-2Me

o primeiro analisado as condições pró-inflamatória em três linhas de cancro de próstata independente de androgénios humanos, ou seja, 1-LN, DU-145 e PC-3, pela quantificar p-cPLA2

Ser505, a COX-2, EP2, EP4, e PGE

2 nestas células estimuladas com tampão ou 8-CPT-AMPc-2Me (Figura 1). O tratamento de células de cancro da próstata com 8-CPT-AMPc-2Me causou um aumento de 2-2,5 vezes na expressão de p-cPLA2

Ser505 em comparação com os controlos (Figura 1). Um mecanismo plausível através da qual pode activar Epac1 cPLA2 é através da elevação do cálcio intracelular e a activação de MAPK. Epac1 regulação da Ca

2+ libertação a partir do retículo endoplasmático foi previamente relatada [52]. Epac1 aumenta intracelular Ca

2 + por hidrólise PLCy mediada de PIP2 geração de IP3 que eleva intracelular Ca

2 + [53]. Todas as linhas de cancro da próstata três estimuladas com tampão mostrou níveis negligenciáveis ​​ou muito baixos de ARNm de COX-2 e proteína em comparação com 8-CPT-2Me-estimulada por cAMP As células que mostraram um aumento de 2-3 vezes da COX-2 mRNA e proteína ( A Figura 1A e B). Semelhante a COX-2, o tratamento de células de cancro da próstata com 8-CPT-AMPc-2Me causou um aumento de 2-3 vezes na intracelular PGE

2 de síntese em comparação com os controlos (Figura 1C).