Abstract

Purpose

O supressor tumoral p53 é conhecido por ser inactivado com frequência em vários tipos de câncer . Além disso, os polimorfismos germinativas em

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são conhecidos por afetar a função da proteína e risco de influência do desenvolvimento de diferentes tipos de cânceres. Neste estudo, foi analisada a associação de

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polimorfismo Pro72Arg com carcinoma de células escamosas da língua oral (SCCOT) e esôfago (ESCC) na Índia.

Métodos

avaliada a distribuição de

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polimorfismo Pro72Arg em cento e quinze e oitenta e dois pacientes SCCOT CICAc e, respectivamente, com relação a cento e dez controlos saudáveis ​​da mesma população. Além disso, analisamos associação do polimorfismo com vários parâmetros clínico-patológicas e moleculares.

Resultados

alelo Pro72 foi significativamente enriquecida em pacientes SCCOT em comparação com o grupo controle saudável, mas nenhum dos alelos foi enriquecido em ESCC. Curiosamente, alelo Pro72 foi preferencialmente mutado em ESCC que foi confirmado por análise de amostras de heterozigotos para Pro72Arg.

Conclusões

O nosso estudo revelou a associação do alelo Pro72 com SCCOT sugerindo o efeito desse polimorfismo em risco SCCOT. mutação preferencial do alelo Pro72 exclusivamente na CICAc indica a necessidade de mais estudos para compreender o efeito específico do tecido do polimorfismo p53

Citation:. Adduri RSR, Katamoni R, Pandilla R, Madana SN, Paripati AK, Kotapalli V, et ai. (2014)

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Pro72 Alelo é enriquecido no câncer de língua oral e frequentemente mutado no cancro esofágico na Índia. PLoS ONE 9 (12): e114002. doi: 10.1371 /journal.pone.0114002

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 07 de agosto de 2014; Aceito: 31 de outubro de 2014; Publicação: 01 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Adduri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. MDB recebido Conselho Indiano de Pesquisa Médica (ICMR), Govt. da Índia (Grant No. 5/13/129/2009-NCD-III), do Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR), Govt. da Índia (Grant No. 27 (265) /12 /EMR-II), Departamento de Biotecnologia, Govt. da Índia (Grant No. BT /PR11873 /MED /30/173/2009) e uma subvenção do núcleo do Departamento de Biotecnologia, Govt. da Índia para Centro de Impressões Digitais de DNA e Diagnostics (CDFD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células escamosas da língua oral (SCCOT) é uma forma comum de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP) e sua incidência está aumentando consistentemente em todo o mundo [1]. O aumento da incidência tem sido observado principalmente em pacientes mais jovens [2], [3] no qual ele aparece para expor menor associação com fatores de risco comuns, tais como o álcool eo tabaco sugerindo possível susceptibilidade genética [3]. SCCOT é conhecido por ser agressivo e está associado a taxas mais elevadas de metástase oculta e nodal quando comparado a outros subtipos CECP [4]. Ela é freqüentemente associada com pior sobrevida, que não melhorou significativamente ao longo das últimas quatro décadas [5], [6]. O câncer de esôfago (CE) é o sexto e oitavo câncer mais comum em homens e mulheres, respectivamente, na Índia (https://www.icmr.nic.in/ncrp/report_pop_2001-04/cancer_p_based.htm). Escamosas (CCEE; ocorre geralmente em proximal e do esôfago médio) e adeno (EAC; ocorre principalmente no esôfago distal) carcinoma são os dois principais subtipos CE [7]. Embora CICAc foi mais comum há algumas décadas, um rápido aumento da EAC tem sido observado desde 1980 no Ocidente [8], em paralelo com um aumento da incidência da doença reflex gastrointestinal (DRGE). GERD provoca um estado patológico inflamação induzida chamado “Barrett do esôfago, o que predispõe à EAC [9]. No entanto, uma tendência semelhante no aumento da DRGE tem sido observado em países asiáticos nas últimas décadas, CICAc continua a ser o subtipo CE predominante [10], sugerindo possibilidade de papel dos fatores genéticos. Devido à sua localização mais perto do pescoço e semelhanças nas vias Tumorigênese, CICAc é por vezes classificada com CECP.

inativação Somatic de

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é um evento frequente na maioria dos cânceres enquanto aberrações da linha germinal estão associados com Li-Fraumeni [11], uma síndrome predisposição ao câncer hereditário. modos comuns de inactivação p53 são mutações pontuais, perda alélica [12] e inactivação mediada por proteínas oncoviral [13]. Além disso, numerosos polimorfismos ocorrer em

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dos quais alguns são sugeridos para perturbar a função da proteína e podem influenciar a susceptibilidade ao cancro [14]. Entre estes, o códon 72 Pro /Arg polimorfismo (rs1042522) é a mais comum e bem estudado. Os dois alelos p53 codon72 codifica prolina (Pro72) ou arginina (Arg72), localizada numa região poliprolina presente entre a transactivação e a domínios de ligação ao ADN e que podem afectar a estrutura do domínio de ligação SH3 putativa [15]. O alelo Pro72 é conhecida por estar associada com a doença da artéria coronária [16], maior susceptibilidade a endometriose [17], glaucoma de ângulo primário aberto [18], lúpus eritematoso sistémico (especialmente em asiáticos) [19] e a colite ulcerativa [20], enquanto o alelo Arg72 está associada com a progressão de nefropatia diabética [21]. Mais importante ainda, as exposições polimorfismo variados associação com o risco [22], [23], de sobrevivência [24], [25], e a resposta ao tratamento [25] em vários tipos de câncer em diferentes populações.

No estudo atual , avaliou a frequência de Pro72Arg polimorfismo em SCCOT e ESCC. Pro72 alelo parecia estar significativamente associada com SCCOT enquanto foi detectada nenhuma associação com qualquer alelo em ESCC. No entanto, em ESCC,

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DNA vinculativo mutações no domínio ocorreu com uma frequência significativamente maior no alelo Pro72.

Materiais e Métodos

As amostras dos pacientes e controle

cento e quinze e oitenta e duas amostras SCCOT e CICAc não tratados previamente e cirurgicamente ressecados, respectivamente, foram coletados durante o período de 2007 a 2013 em três hospitais em Hyderabad, na Índia, na sequência de consentimento informado. Setenta e dois e setenta e cinco pacientes SCCOT e CICAc respectivamente, foram de nossos estudos anteriores [26], [27]. detalhes clínico-patológicos de pacientes são apresentadas na Tabela S1. A idade média e rácio entre homens e mulheres eram 49 e 50; e 1,94 e 1 para SCCOT e CICAc respectivamente. sangue periférico de cento e dez indivíduos saudáveis ​​livres idade e câncer combinado de gênero pertencentes à mesma região geográfica foram recolhidos.

declaração Ética

O estudo foi aprovado pelo comitês de ética de Apollo Hospitals (14 /05/2005), MNJ Instituto de Oncologia e Centro Regional de Câncer (23/09/2006 e 20/10/2008) e Indo-American Cancer Institute e do Centro de Investigação (08/08/2007), bem como a bioética institucionais comité das Centro de Impressões Digitais de DNA e Diagnostics (CDFD) (20/12/2009), conforme declaração de Helsínquia modificado 2005. Todas as amostras foram coletadas após o consentimento informado por escrito.

a genotipagem

DNA foi isolado de histologicamente confirmou tecido normal adjacente ao tumor para cada amostra tal como detalhado no documento S1. Genotipagem de codão 72 foi realizada utilizando uma abordagem em duas vertentes incluindo PCR-RFLP (Figura 1A) [28] e PCR específica do alelo (Figura 1A) [29], como descrito anteriormente. Os resultados foram confirmados independentemente em cada vinte e quinze amostras SCCOT e CICAc respectivamente usando bidireccional sequenciação Sanger num analisador genético 3100 (ABI Inc., Foster City, CA, EUA) (Figura 1B). As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S2.

Painel A, a análise de PCR-RFLP confirmada por PCR alelo específico realizado como descrito na secção de materiais e métodos. M, escada de DNA de 50 pb; 1, Pro /Pro; 2, Pro /Arg; 3, Arg /Arg; e C, sem controle modelo. Painel B, Sanger seqüenciamento. Pro /Pro (à esquerda), Pro /Arg (meio) e Arg /Arg (direita).

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pesquisa de mutações

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rastreio de mutações foi realizada como descrito anteriormente [26]. Para identificar se a Pro72 ou o alelo Arg72 estava abrigando mutação p53 em amostras de heterozigotos para o polimorfismo Pro72Arg, um longo amplicon (~2700 pb) que mede exons 4-8 de

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(que inclui o códon 72, bem como a região que codifica o domínio de ligação ao ADN) foi amplificado (pares de iniciadores Arg

+ e o exão 8R, Tabela S2) a partir de ADN genómico e clonadas em vector TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Os plasmídeos recombinantes foram rastreados para a mutação, bem como para o polimorfismo no códon 72 usando bidirecional sequenciamento Sanger.

A análise molecular

Status de p53 estabilização nuclear,

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mutação (apenas para SCCOT), EGFR sobre a expressão, instabilidade de microssatélites, β-catenina status de localização nuclear (apenas para ESCC), infecção pelo HPV e LOH e variáveis ​​clínico-patológicas, incluindo idade, sexo, tabagismo, consumo de álcool, grau e estágio patológico foram relatados em nosso estudos anteriores [26], [27].

a análise estatística

Desvio de Hardy-Weinberg para a freqüência do genótipo para casos e controles, foi analisada utilizando χ

2 de teste. odds ratio e correspondentes intervalos de confiança de 95% para o risco de doença foram calculados. Dominante, codominante, recessiva, mais aditivos modelos herança dominante e log foram testados para determinar se o SNP foi associada com a doença. Akaike (AIC) e Bayesiana (BIC) critério de informação, além de χ

2 valores de p foram usadas para seleccionar o melhor modelo de herança. Associação entre diferentes genótipos e variáveis ​​clínico-patológicas foi avaliada usando χ

2 ou teste exato de Fisher, conforme apropriado.

Resultados

alelo TP53

Pro72 é enriquecido em SCCOT mas não em ESCC pacientes

Foi analisada a distribuição de p53 códon 72 genótipos em SCCOT e ESCC com relação a controles saudáveis ​​(Figura 1), tal como descrito na secção de materiais e métodos. 26 (23,6%), 53 (48,2%) e 31 (28,2%) amostras de controlo abrigava Pro /Pro, Pro /Arg e Arg /Arg genótipos, respectivamente, exibindo, assim, qualquer enriquecimento significativo de um alelo sobre o outro (Tabela 1) . No entanto, Pro72 alelo parecia ser significativamente enriquecidos em SCCOT comparação com os controlos (Tabela 1) ao passo que nenhum enriquecimento significativo foi observado em CICAc (Tabela 1). As distribuições de genótipos de amostras SCCOT e CICAc, bem como os controlos não foram desviar do equilíbrio de Hardy-Weinberg (Tabela 1). Co-dominante, recessivo e log-aditivo modelos genéticos foram encontrados para ser apropriado para a herança de SCCOT para este SNP (Tabela S3A). No entanto, menor valor de AIC (310,7) e BIC (317) para o modelo recessivo indica que ele seja o melhor modelo (Tabela S3A). Em contraste, CICAc não exibiram associação com qualquer modelo genético (Tabela S3B) como esperado. Nenhuma das diversas variáveis ​​molecular e clínico-patológicos apresentaram associação significativa com o códon 72 freqüência do alelo na SCCOT e ESCC (Tabela S1).

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mutações são exclusivamente observada em tumores CICAc com p53 nuclear estabilização

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estado de mutação foi relatado anteriormente para todas as amostras SCCOT analisados ​​no estudo anterior [26]; mutações estavam associados com a sobrevivência pobre doença específica [26], mas não com vários parâmetros clínico-patológicos enumerados na secção de materiais e métodos. Nós rastreados amostras CICAc de mutações somáticas em exons 5-8 de

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que codificam o domínio de ligação ao DNA e são conhecidos por abrigar maioria das mutações de câncer associado [30]. As mutações foram detectadas em vinte e nove de quarenta e cinco amostras exibindo estabilização nuclear e nenhuma das trinta e sete amostras que não, sugerindo que a ausência de estabilização nuclear pode ser um indicador confiável da ausência de ligação

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DNA mutação domínio na CICAc . Foi identificado um total de vinte e sete (missense dezenove anos, três absurdo e cinco indels) mutações (todos os heterozigotos). Duas mutações (c.610G T. (P.E204X) e c.566delC (p P190Lfs * 57)) foram detectados em duas amostras de cada um (Tabela S4). Foram identificados três novas mutações somáticas

viz.

, C.621_639del19, c.454_466dupCCGCCCGGCACCC e c.428_432delTGCAG + 440delG (Tabela S4). Descrição detalhada das novas mutações é dada no documento S2. Mutações em ESCC não foram associados a qualquer uma das variáveis ​​clínico-patológicas analisados ​​(Tabela S5). Proporção de transições e transversões (Figura S1A), bem como frameshift, missense e mutações nonsense (Figura s1b) foram semelhantes aos relatos prévios para CICAc de acordo com a Agência Internacional de Investigação do Cancro (IARC)

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banco de dados [ ,,,0],15]. Curiosamente, a proporção de exclusões foi maior do que o registrado no

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banco de dados (Figura S1B). G: C A: T transições constituído a maior

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tipo de mutação (29/09; 34,48%) em amostras CICAc neste estudo semelhante ao banco de dados [15]. No entanto, a frequência de C T transições em dinucleótidos CpG foi menor (10,34%), enquanto freqüência de deleções (5/29; 17,24%) foi maior do que o registrado no banco de dados [15]

Pro72 alelo abrigava inativação. mutações com frequência em ESCC

mutações de ligação ao DNA P53 não foram associados com o códon 72 genótipos em SCCOT (p = 0,917) (Tabela 2). Em contraste, as amostras com CICAc Pro /Pro (10/20; 50%) genótipo eram mais propensos a abrigar mutação do que as amostras com Arg /Arg genótipo (16/05; 31,3%) (p = 0,289) (Tabela 2). Portanto nós procedemos para determinar se alelo Pro72 foi mais frequentemente mutado através da análise de amostras de heterozigotos para o polimorfismo Pro72Arg. Um único produto de PCR que incluiu a mutação, bem como o polimorfismo foi gerado e clonados num vector plasmídico adequado e sequenciado para determinar se a mutação estava presente no Pro72 ou o alelo Arg72. Como mostrado na Figura 2, a mutação foi preferencialmente localizado no alelo Pro72 (p = 0,0001) (Tabela 2), suportando, assim, o resultado obtido para amostras homozigóticas para o codão 72 e permitindo-nos comparar Pro72Arg polimorfismo e estado de mutação da p53 para todos os 75 amostras CICAc que revelou que a mutação foi significativamente associada com o alelo Pro72 (p = 0,0018) (Tabela 2).

Electrophoretograms mostrando mutação (esquerda) e polimorfismo no códon 72 (à direita) para cada um dos catorze amostras são mostrados. Localização de mutações de deleção missense e são indicados por setas e as barras, respectivamente. Prolina (CCC) ou arginina (CGC) códons são indicados por um bar.

Curiosamente, mutações deverão causar truncamento p53 (um disparate e frameshift) foram exclusivamente identificadas no alelo Pro72 (8 /8, 100%) em amostras CICAc. Embora, uma supressão e uma mutação complexo (do total de seis mutações) foram identificados no alelo Arg72, ambos não eram esperados a alterar a grelha de leitura e, assim, não pode causar a proteína truncada. Apenas 16,67% de

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mutações em SCCOT [26] (em comparação com 27,59% em CICAc) eram esperados para resultar em truncamento de p53, o que sugere ainda diferenças na biologia de SCCOT e CICAc em relação à função de p53.

Discussão

Vários estudos realizados na mistura de Cabeça e Pescoço do carcinoma de células escamosas (CECP) amostras não detectou qualquer associação significativa com o

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polimorfismo no códon 72 [31] – [ ,,,0],33], talvez devido à heterogeneidade dos subtipos de tumor. Estudos sobre tumores do local HNSCC específico e /ou subtipo molecular revelou, contudo, associação com o polimorfismo em diferentes etnias [34] – [37]. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo específico de caso-controle realizado para encontrar a associação entre o

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polimorfismo Pro72Arg e SCCOT. Há relatos conflitantes sobre a associação do polimorfismo Pro72Arg com o risco ESCC com estudos relatando associação significativa com Pro72 [22], [23], [38], [39], Arg72 [40] ou não [41], [42]. Curiosamente, o efeito pode variar dentro da mesma população [22], [40]. Nossa análise revelou que o alelo Pro72 foi significativamente associada com SCCOT mas não com ESCC, talvez refletindo diferenças na biologia de SCCOT e CICAc entre os índios. De nota, um estudo recente sugere diferença significativa na função de p53 entre Arg72 e alelo Pro72. No entanto, esta diferença era tecido específico [43]. Foi também sugerido que Pro72 alelo poderia ser mais eficiente em causar a paragem do ciclo celular [44] enquanto que o alelo Arg72 foi demonstrado ser mais eficaz na indução da apoptose e localização de mitocôndria [45]. Embora tenha sido demonstrado que Arg72 alelo poderia ser mais eficiente alvo de proteína de HPV E6 [29], nós não detectar qualquer associação significativa neste estudo.

ausência Semelhante aos nossos resultados, outro estudo da Índia também relataram de

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mutações em tumores CICAc sem estabilização nuclear [46], ao contrário dos relatórios de outros países (54-55) talvez indicando uma característica exclusivamente associada a população indígena. Além disso, o ESCC

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espectro de mutação somática detectados neste estudo é semelhante às observações feitas no início da Índia [47]. Menor proporção de G: C A: transições T em dinucleótidos CpG (atribuído a desaminação espontânea da citosina) identificados em amostras CICAc neste estudo está de acordo com estudos anteriores da Índia [47]. maior frequência de G: C A: transições T em locais não-CpG pode ser atribuída a agentes em alimentos e no ambiente [48] alquilantes. De nota, nitrosaminas em bebidas alcoólicas [49] e carne processada [50] são conhecidos por aumentar o risco de câncer de esôfago e estômago, respectivamente. estudos CICAc do Irã [51], bem como o sul do Brasil [52] relatou uma associação de hábito de beber chá quente com G: C A:. T transições

Para o melhor de nosso conhecimento, este é o só estudam para avaliar o estado de

TP53

mutação no Pro heterozigotos /Arg, que é esperado para fornecer informações mais precisas sobre a extensão da associação desde ambos os alelos estão presentes no mesmo fundo genético. Observou-se que mutações no domínio de ligação de DNA p53 foram predominantemente detectado em alelo Pro72 (em comparação com alelo Arg72) em ESCC Considerando que nem alelo foi preferencialmente mutado em SCCOT. Diversos estudos sobre vários cancros relatado possível associação de ADN de p53 de ligação com o alelo de mutação domínio Arg72 [53], [54] enquanto alguns relatada outra maneira [24], [55]. Talvez, a associação pode variar de acordo com a etnia [24]. p53 mutada Arg72 é sugerido para ser mais eficaz em comparação com Pro72 p53 na ligação e inactivação de p73, um homólogo de p53 que pode transactivar alvos p53 [56]. Além disso, estudos anteriores mostraram também que mutada alelo Pro72 podem ter maior potencial para inactivar p53-se [57]. De nota, CICAc exibe inativação frequente de p73 através da perda de heterozigosidade [58], assim, o que talvez explique maior frequência de mutação no alelo Pro72 causando inativação do p53.

Curiosamente, observamos proteína truncando mutações associadas exclusivamente com o Pro72 alelo em ESCC. De nota, espera-se que mutações de truncagem para anular completamente a função de p53, enquanto as mutações missense pode-se esperar que mantenham a actividade parcial /alteradas. Além disso, ao contrário de mutação truncagem, mutação de sentido trocado no domínio de ligação ao ADN de p53 pode alterar a capacidade da p53 para se ligar a DNA e genes alvo transactivar mas pode não afectar as funções de p53 exclusivos para outros domínios de proteína [59]. Assim inactivação completa dos Pro72 pode ser mais do que tumorigênico Arg72 em ESCC.

Conclusão

Este estudo revelou efeito da

alelo TP53

Pro72 no aumento do risco de SCCOT e sugeriu que SCCOT pode ter diferença biológica com outras formas de CECP. Uma característica única deste estudo foi a determinação do estado de mutação em amostras de heterozigotos para o polimorfismo Pro72Arg p53, que nos permitiram concluir que alelo Pro72 estava realmente preferencialmente mutado em ESCC. Os resultados suportam observações anteriores que sugerem um comportamento diferente dos alelos p53 Pro72Arg em diferentes tipos e etnias câncer e sugerem função molecular distinta de Arg72 p53 e p53 Pro72 com respeito a mutação associada, em ESCC. Outros estudos sobre outros tipos de câncer devem ser realizados para analisar a associação do polimorfismo e mutação. Nossos resultados podem ser estendidos para analisar o efeito do polimorfismo e mutação na sobrevida dos pacientes e resposta a quimioterapia /radioterapias. Estudos moleculares e funcionais no p53 mutante em Pro72 e fundo Arg72 poderia elucidar a atividade diferencial da p53. Finalmente, para elucidar o efeito do polimorfismo em mutação, estudos utilizando modelos animais podem ajudar a compreender o papel desse polimorfismo na tumorigênese.

Informações de Apoio

Figura S1.

Análise comparativa da distribuição de ESCC

TP53

mutações na Índia com o IARC

banco de dados TP53

a nível de nucleotídeos (Painel A), o nível de DNA (Painel B) e nível de proteína (Painel C ). mutações não classificados e silenciosas relatados no banco de dados foram omitidos desta análise. A mutação p.V143_W146delinAV não foi incluído na análise (no Painel C), devido à complexidade do seu efeito no nível de proteína

doi:. 10.1371 /journal.pone.0114002.s001

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Tabela S1.

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Tabela S2.

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Tabela S3.

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Tabela S4.

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Tabela S5.

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Documento S1.

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Documento S2.

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Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Mukta Srinivasulu, do Instituto de Oncologia MNJ Centro Regional Cancer, Hyderabad, Dr. MohanaVamsy Chigurupati, Drs. Sujith Patnaik, Subramanyeshwar Rao e NarasimhaRaju Kalidindi do Indo-American Hospital Research Institute, Hyderabad, Drs. Swarnalata Gowrishankar e Umanath K Nayak dos Hospitais Apollo, Hyderabad, por sua ajuda na coleta de amostras. Agradecemos ao Dr. Kumarasamy Thangaraj, Centre for Cellular Biologia Molecular, Hyderabad, para a recolha de amostras de ADN de indivíduos saudáveis. RSRA e RP são registrados estudantes de doutoramento da Universidade Manipal, Karnataka, Índia e Universidade de Hyderabad, respectivamente. RSRA e RP são gratos à Universidade Grants Comissão (UGC) Govt. da Índia e do Conselho Indiano de Pesquisa Médica (ICMR), Govt. da Índia, respectivamente, para bolsas de investigação júnior e sênior.