Abstract

Fundo

O câncer colorretal (CRC) é considerada uma doença complexa, e assim a maioria da susceptibilidade genética é pensado para mentir na forma de variantes de baixa penetrância na sequência de um modelo poligênico de herança. estudos candidato-gene têm sido até agora uma das abordagens básicas tomadas para identificar essas variantes de susceptibilidade. O envolvimento consistente de algumas rotas de sinalização na carcinogênese forneceram apoio para os estudos baseados em via como uma estratégia natural para selecionar genes que poderiam abrigar novos loci de susceptibilidade.

Metodologia /Apreciação Principais

Foram selecionados dois principais vias relacionadas com a carcinogênese: Wnt e BMP, a fim de examinar os genes implicados para novas variantes de risco. Em seguida, realizaram um estudo de associação de caso-controle em 933 casos CRC e 969 controles com base na codificação e SNPs reguladoras. Incluímos também rs4444235 e rs9929218, que não preenchem os nossos critérios de selecção, mas pertenciam a dois genes na via BMP e consistentemente tinha sido associada a CRC em estudos anteriores. Nem alélicas, análises nem genotípicas ou haplotípicos mostrou quaisquer sinais de associação entre as 37 variantes selecionados e risco de CRC. Ajustes por sexo e idade, e análise estratificada entre grupos esporádicos e de controlo não deu quaisquer resultados positivos também.

Conclusões /Significado

Apesar da relevância de ambos os percursos na patogênese da doença, eo fato de que este é realmente o primeiro estudo que considera essas vias como uma abordagem de seleção do candidato-gene, o nosso estudo não apresenta qualquer evidência da presença de variantes de baixa penetrância para os marcadores selecionados em qualquer um dos genes considerados em nossa coorte .

Citation: Fernández-Rozadilla C, de Castro L, Clofent J, Brea-Fernández A, Bessa X, Abuli A, et al. (2010) Polimorfismos de Nucleotídeo Único no Wnt e BMP Pathways e cancro colorectal risco numa coorte espanhol. PLoS ONE 5 (9): e12673. doi: 10.1371 /journal.pone.0012673

editor: Chun-Ming Wong, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 20 de maio de 2010; Aceito: 06 de agosto de 2010; Publicação: 09 de setembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Fernández-Rozadilla et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Fondo de Investigación Sanitaria /FEDER (05/2031, 08/0024, 08/1276, PS09 /02368), Xunta de Galicia (PGIDIT07PXIB9101209PR, Ministerio de Ciencia e Innovacion (SAF 07-64873), Asociacion Espanola contra o cancer do el (Fundacion Cientifica y Junta de Barcelona), e Fundação de Investigación Médica Mutua Madrilena. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

interesses concorrentes:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das principais formas de câncer, sendo a segunda neoplasia mais frequente em ambos os sexos e uma das mais importantes causas de morbidade no mundo ocidental [1]. A contribuição genética para a CRC foi estimado em cerca de 35% por extensos estudos com gêmeos [2]. No entanto, as variantes altamente penetrantes, que causam síndromas de predisposição Mendelian, representam apenas uma, no máximo, 5% dos casos de doença [3]. A susceptibilidade genética restante é pensado para seguir um modelo poligênico, com uma interação de múltiplos alelos de baixa penetrância variantes aparecendo em alta freqüência na população em geral, e cada conferindo um efeito modesto no risco de doenças [4], [5].

estudos Candidate-gene têm sido uma das ferramentas mais utilizadas na triagem por novas variantes que afetam o risco CRC. seleção de genes nestes estudos baseia-se principalmente sobre as implicações funcionais de uma possível associação, e, assim, genes selecionados ou foram escolhidos por causa da presença prévia de outras alelos de risco alto /baixo [6], ou a sua participação em uma via implicada na patogénese da doença [7]. estudos candidato-gene pode ser realizada por qualquer abordagens directas, onde as variantes genotipados se presume ser a causa subjacente da doença devido à sua localização (variantes em regiões ex�icas ou regulamentares), ou por abordagens indiretas, onde tag SNPs aproveitar as propriedades de desequilíbrio de ligação do genoma humano para tentar rastrear a maior parte da variabilidade de um determinado gene.

Esta última abordagem também permitiu, juntamente com o desenvolvimento de tecnologias de alta capacidade, a implementação da nova hipótese abordagens -free (em oposição com as abordagens candidato de genes baseados em hipótese), cobrindo a maior parte do genoma (estudo de associação genômica ampla ou GWAS). Esta implementação conduziu com sucesso para a identificação de alguns dos novos loci de susceptibilidade [8] – [14], incluindo rs4444235 e rs9929218, que caem dentro do alcance de dois genes pertencentes à via de BMP. No entanto, estes têm sido encontrados para prever apenas uma pequena proporção da susceptibilidade à doença, ainda com o remanescente a ser descoberto [15].

, portanto, destinado a encontrar tais variantes de susceptibilidade através de uma abordagem candidato-gene de um rastreio seleccionado número de variantes dentro de duas vias celulares que têm sido consistentemente ligadas à CRC tumorig�ese: o Wnt eo BMP vias de sinalização [16], [17]

a via Wnt contém genes que têm sido há tempos conhecidos. ser responsável de algumas síndromes hereditárias CRC, tais como

APC

e polipose adenomatosa familiar [18]. Além disso, alterações somáticas no

APC

são encontrados em quase 80% dos cânceres colorretais esporádicos, e activação de sinalização Wnt está envolvido na melhor parte de carcinomas colorretais esporádicos [19]. Por outro lado, a via de BMP actua regulador positivo de algumas das proteínas Wnt [17], e o papel do tumor supressor desta via de sinalização na patogénese de CRC e outros cancros está bem estabelecida [20], [21]. Além disso, mutações em dois dos seus genes,

SMAD4

e

BMPR1A

, são responsáveis ​​pela síndrome de polipose juvenil, outra condição hereditária CRC [22]. Considerando todas essas informações, nós pensamos que seria interessante para a tela um pouco da variabilidade genética dentro destes caminhos para qualquer evidência de novas variantes relacionadas CRC que poderiam explicar pelo menos parte da herdabilidade em falta. A nossa abordagem foi principalmente funcional, apenas para SNPs dentro exônico ou

cis

sequências -regulatory (5 ‘e 3’ regiões unstranslated) foram seleccionados para analisar sua relação com CRC susceptibilidade.

Resultados e Discussão

a seguir o nosso método de seleção do candidato-gene baseada em caminho, realizamos nosso estudo, em um total de 45 SNPs que estavam em regiões quer ex�icas ou regulamentares, em um total de 21 genes de ambas as vias Wnt e BMP. Detalhes de recursos SNP e valores de associação para os 37 SNPs que passaram com sucesso os critérios de controle de qualidade são apresentados na Tabela 1. Nenhum dos SNPs selecionados foram significativamente associados com um risco alterado de CRC, considerando odds-ratios eo valor de p relacionados para alélicas e genotípicas testes (tendência, dominantes e recessivos). A regressão logística para a idade e sexo ajuste foi realizado, apesar de não melhorar os resultados de valor p. os resultados da análise de haplótipos foram consistentes em ambos os unphased e Haploview, e não mostrou quaisquer sinais de associações positivas, quer para qualquer um dos 8 genes para os quais foi realizada esta análise (

AXIN1

,

HDAC9

,

BMP4

,

DACT1

,

CDH3

,

CDH1

,

BTRC

, e

APC)

, (Figura S1). análise de estratificação comparando casos esporádicos e familiares também foi implementado, mas não forneceu qualquer evidência de diferenças de susceptibilidades entre os grupos que poderiam ser um sinal de quaisquer associações específicas dentro de qualquer um dos grupos (Tabela 2).

assim, a nossa estratégia não conseguiu detectar qualquer novo loci susceptibilidade para o risco de CRC.

expectativas baseadas em via têm provado ser bastante desanimador na literatura, bem como, para os percursos candidatos fortes, tais como os de reparação do ADN, surpreendentemente também falhou na identificação de novas variantes de risco [7], [23] – [24]. Em adição a isto, a maior parte das variantes genéticas que foram encontrados para ser associado com a doença estão localizados em regiões intergénicas, com potenciais funções que são ainda desconhecidos.

Ainda, tendo em conta as recentes descobertas que se seguiu-se a análise dos dados do genoma, tanto Wnt e BMP ganharam uma fama renovada. O locus de susceptibilidade encontrados em 8q24 (rs6983267) tem sido associada a uma Wnt reforçada sinalização através da sua interacção com TCF4 [25], [26], e uma meta-análise, realizada a uma série de dados GWAS conseguido associando duas variantes no

BMP4

e

CDH1

regiões do gene com a doença (rs4444235 e rs9929218, respectivamente) [8].

Mesmo que este é realmente o primeiro estudo de associação, que considera os caminhos como um todo para a seleção de genes, alguns dos genes incluídos na nossa análise (ou seja,

APC, CCND1

,

CDH1

e

TCF7

) já haviam sido selecionados para alelos de risco [ ,,,0],6], [27] – [30]. É bastante notável que tem havido um crescente debate sobre alguns desses loci, especialmente a variante p.V1822D em

APC

(rs459552). Esta mudança missense está amplamente documentado na literatura, com alguns estudos defendendo-lo como neutra (este estudo e outros) [31], e que confere alguma sua menor alelo um efeito protector [6], [28]. A falta de poder do estudo adequado, resultante do número insuficiente de amostras tem sido um grande problema em muitos destes estudos e, assim, a maioria deles não forneceram resultados muito convincentes [32].

Embora nosso estudo tiveram mais de 80% poder para detectar ou tão baixo quanto 1,21 com menores freqüências alélicas de 0,30 (57% de nossas SNPs), e 1,24 para MAFs para baixo a 0,2 (78% dos SNPs), assumindo um modelo log-aditivo e α = 0,05, estávamos incapaz de detectar quaisquer associações positivas, sugerindo a presença de quaisquer novas variantes de susceptibilidade CRC. No entanto, é notável que, embora a nossa incapacidade de replicar as associações para o

BMP4

e

CDH1

SNPs, este é o primeiro estudo que investiga qualquer um dos chamados 10 novos GWAS -discovered loci susceptibilidade em uma população sul-europeu.

Apesar de nossos resultados negativos, devemos considerar que não qualquer forma abrangente cobrir todas as possíveis variantes de baixa penetrância dentro dos genes selecionados. Isto é principalmente devido ao fato de que a nossa estratégia era puramente funcional, selecionando as variantes que foram

a priori

bons candidatos para ser diretamente associado com a doença. Este facto, pode constituir uma limitação no estudo, durante a maior parte da variação genética dentro dos loci não foi investigada. Assim, acreditamos que mais esforços devem ser feitos para examinar uma ampla variedade de loci dentro destas vias, especialmente considerando as associações positivas anteriores descritos até aqui para ambos os genes relacionados com BMP Wnt e.

Ponderando os potenciais odds ratio de as variantes descritas até agora (1.11, CI 1.08-1.15 e 0.91, CI 0.89-0.94 para rs4444235 e rs9929218, respectivamente), assumimos coortes maiores podem ser necessários para detectar esses efeitos sutis. Por outro lado, ao considerar abordagens candidato-gene, também seria útil para meta-análise de estudos anteriores e puxe a informação através deles completamente na busca de evidências de potenciais novos caminhos ligados à patogênese da doença.

Materiais e Métodos

populações de estudo

os sujeitos foram 933 pacientes com CCR e 969 controles que pertenciam ao projeto EPICOLON, um estudo prospectivo, multicêntrico, pesquisa epidemiológica de base populacional estudar a incidência e características do CRC familial e esporádica na população espanhola [33]. Os casos foram selecionados em 11 hospitais em Espanha como todos os pacientes com um

diagnóstico

confirmação histológica de-novo de adenocarcinoma colorretal e que participou de 11 hospitais comunitários em toda a Espanha entre novembro de 2006 e dezembro de 2007. Os pacientes nos quais CRC desenvolvidas no contexto da polipose adenomatosa familiar ou doença inflamatória do intestino, e os casos em que os doentes ou familiares se recusaram a participar do estudo foram excluídos. características demográficas, clínicas e relacionados ao tumor de probandos, bem como uma história familiar detalhada foram obtidas utilizando um questionário pré-estabelecido, e registrado em um único banco de dados. Destes, 592 (63%) foram 341 (37%) do sexo feminino e masculino. A idade média para os casos foi de 73 (intervalo 26-95), enquanto média foi de 71 (DP ± 10,7). controles baseados em hospitais foram recrutados em conjunto com casos e foram confirmados não ter câncer ou história prévia de neoplasia, e sem história familiar de CRC. Todos os controles foram selecionados aleatoriamente e combinados com casos para o sexo e idade (± 5 anos), em uma proporção 01:01. Ambos os casos e controles eram de ascendência europeia e da Espanha.

Ética declaração

O estudo foi aprovado pelo “Comité Ético de Investigação Clínica de Galicia”, e cada um dos conselhos de revisão institucionais de os hospitais onde as amostras foram recolhidas ( “Comitê de Ética do Hospital Clínic-Barcelona”, “Comitê de Ética do Hospital del Mar-Barcelona”, “Comissão de Ética do Trias Hospital Alemão i Pujol-Barcelona”, “Comitê de Ética do Hospital Sant Pau-Barcelona “,” Comitê de Ética do Hospital Universitário Arnau de Vilanova-Lleida “,” Comitê de Ética do Hospital Geral-Alicante “,” Comitê de Ética do Hospital de Donosti “,” Comitê de Ética do Hospital Geral de Asturias -Oviedo “,” Comitê de Ética do Hospital Clinico-Zaragoza “,” Comitê de Ética do Hospital de Calahorra-La Rioja “,” Comitê de Ética do Hospital Meixoeiro-Vigo “). Todas as amostras foram obtidas com consentimento informado por escrito revisado pelo conselho de ética do hospital correspondente

DNA extração

DNA foi obtido a partir do sangue periférico congelado.; extração foi realizada em um robô CHEMAGEN (Chemagen Biopolymer-Technologie AG, Baesweiler, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante, à galega Fundação Pública de Medicina Genômica em Santiago de Compostela. Casos e controles foram extraídos em lotes mistos para evitar qualquer tipo de preconceito.

Candidate-gene selecção

Ambos Wnt e as vias BMP foram inicialmente selecionados após as conclusões de Nishanian et al. [34], que demonstrou a interação entre esses dois caminhos. Ambos os percursos foram cuidadosamente investigados através do site Anatomy Projeto do Genoma do Câncer [35], mas que não conseguimos encontrar qualquer informação sobre a via BMP em este ou outros navegadores. Por essa razão, os genes Wnt foram selecionados pela visualização da via através Biocarta [36], enquanto genes BMP teve que ser rigorosamente selecionados a partir da literatura anterior [17], [34]. Quarenta e um genes foram finalmente selecionados para serem incluídos na análise.

selecção SNP e genotipagem

critérios de selecção SNP única considerados marcadores funcionais com freqüências alélicas menores acima de 0,05 e pelo menos dois critérios de validação independentes conforme estabelecido no dbSNP [37]. Isto incluiu todas as variantes ex�icas selecionados com Pupasuite [38] e regiões do gene-regulação no

cis

(5’or 3 ‘UTR termina), conforme definido pelo navegador web do FESD [39]. variantes 5’UTR só foram incluídos quando eles cumpriram com os critérios acima referidos e foram Presume-se que o potencial local de ligação de um factor de ligação transctiptional conhecido. 3 ‘UTR variantes foram incluídos devido à sua relação potencial com as regiões de ligação miRNA [40]. Porque alguns dos genes selecionados não tinha SNPs de tais estes tipos em qualquer um dos três navegadores no momento da selecção SNP, eles finalmente teve que ser removido para fora do estudo. Finalmente, 43 SNPs foram escolhidos no prazo de 21 genes para ser exibido como potenciais modificadores diretos do CRC susceptibilidade (Tabela 3).

rs4444235 e rs9929218 são duas variantes que encontram-se nas regiões perto e intrônicas de

BMP4

e

CDH1

, respectivamente, que foram recentemente relatado para ser associado com a doença [8]. Considerando que os SNPs que tínhamos escolhido dentro destes dois genes não eram bons pichadores para estas duas variantes (valores de r-quadrado foram de 0,6 para o SNPs em

BMP4

, e 0,02 para aqueles em

CHD1

) (Figura 1), decidimos incluí-los no nosso estudo, bem como, apesar de não cumprir os nossos critérios de selecção, fazendo com que o número total de SNPs interrogado subir para 45.

relações R-quadrado entre SNP pares:. A. rs4444235-rs17563 em

BMP4 Comprar e B. rs9929218-rs1801552 no

CDH1

a genotipagem foi realizada com o MassARRAY (Sequenom Inc., San Diego, EUA) tecnologia no nó de Santiago de Compostela da genotipagem Centro Espanhol. Chamado de genótipos foi feito com software v4.0 Sequenom Tipos usando todos os dados do estudo simultaneamente.

Análise estatística

O controle de qualidade foi realizado, em primeiro lugar através da exclusão de ambos os SNPs e amostras com sucesso genótipo taxas inferiores a 95%, com a ajuda do filtro Genotipagem de dados (GDF) [41]. distribuições genotípicas de todos os SNPs em controles foram consistentes com Hardy-Weinberg, avaliada usando um

2 de teste X (1

df). Todos os valores de p foram obtidos ≥0.05, excluindo assim a possibilidade de artefactos de genotipagem (dados não mostrados). estratificação populacional foi avaliada com v2.2 Estrutura [42]. Resumidamente, a posibilidade de diferentes cenários foi testado assumindo um número diferente de populações subjacentes (k varia de 1 a 4), permitindo um grande número de iterações (25 K na queimadura em período seguido de 500 K repetições). A probabilidade de log média foi estimada para os dados para um dado K (referido como L (K)) em cada série. Nós também realizados vários ensaios para cada valor de k calcular a média total L (K) e o seu desvio padrão. Todos os resultados parecem ser concordante com o pressuposto inicial de uma única população existente. Além disso, procedimentos adicionais para visualização variável melhor confusão foram realizadas por meio de uma Análise de Componentes Principais (PCA) com a ferramenta EIGENSOFT

smartpca

[43], embora o número de marcadores foi muito baixo. Não foram encontradas diferenças de estratificação populacional entre os casos e controles para qualquer estrutura ou os primeiros 10 componentes da análise PCA (Figura S2). Depois de controle de qualidade 1746 amostras (854 casos e 892 controles) e 37 SNPs permaneceu por análises posteriores.

testes de associação foram realizadas pelos testes qui-quadrado para cada SNP e haplótipos, sempre que possível com ambos os Haploview v4.0 [ ,,,0],44] e unphased [45]. Em suma, os padrões de LD em todo genes para os quais mais de um SNP foi genotipados foram verificadas em Haploview e testados para a associação usando unphased (para verificar em qualquer um dos haplótipos foi associado) e Haploview (para ver qual dos haplótipos foi associada). testes genotípicas associação, análise de regressão logística para o sexo e ajuste de idade, e análise estratificada entre grupos esporádicos e familiares foram estimados com v1.03 Plink [46]. intervalos de confiança OR e 95% foram calculados para cada estatística, e de abordar a questão de múltiplo-teste, testes de permutação ea correção de Bonferroni foram utilizados. poder do estudo foi estimado com software CATS [47].

Informações de Apoio

Figura S1. estrutura

haplótipos e análise para os 8 genes para os quais mais de um SNP foi genotipados. A tabela mostra os valores de associação para cada SNP gerado pelo Haploview

doi:. 10.1371 /journal.pone.0012673.s001

(3,40 MB TIF)

Figura S2.

Principal plot análise de componentes para o primeiro segundo componente vs., comparando nossas populações caso e controle

doi:. 10.1371 /journal.pone.0012673.s002

(0.96 MB TIF)

Nota S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0012673.s003

(0,03 MB DOC)

Reconhecimentos

Estamos sinceramente grato a todos os pacientes que participaram deste estudo que foram recrutados em 11 hospitais espanhóis como parte do projeto EPICOLON. Agradecemos Maria Magdalena-Castro (MMC), Olga Lortes (OL) e Eva Fernández (EF) pela sua excelente assistência técnica.