Abstract

Fundo

Survivin é expresso no cancro da próstata (PCA), e sua regulação baixa sensibiliza CaP células a agentes quimioterápicos

in vitro

e

in vivo

. vesículas ligadas à membrana pequeno chamado exossomas, segregadas a partir do compartimento da membrana endossomal, contêm ARN e proteína que eles prontamente transportar através exossomo internalização em células receptoras. O progresso recente tem mostrado que exossomas derivadas de tumor desempenham múltiplos papéis no crescimento tumoral e metástase e pode produzir estas funções através de escape imune, invasão tumoral e angiogénese. Além disso, a análise exosome pode fornecer novos biomarcadores para diagnosticar ou monitorar o tratamento CaP.

Métodos

Os exossomas foram purificados do plasma e soro de 39 pacientes APC, 20 doentes com HBP, recorrente câncer de próstata e 8 16 controles saudáveis, utilizando ultracentrifugação e suas quantidades e qualidades foram quantificados e visualizados tanto do plasma e os exossomos purificado utilizando ELISA e Western blot, respectivamente.

resultados

Survivin foi significativamente aumentada no tumor -derived amostras, em comparação com os controlos de BPH e com praticamente nenhuma diferença na quantidade de Survivina detectado em exossomas recolhidos a partir de doentes recentemente diagnosticados exibindo (nove) contagens baixas (seis) ou elevados de Gleason. níveis exossomo Survivin também foram maiores nos pacientes que recaíram sobre quimioterapia, em comparação com os controlos.

Conclusões

Estes estudos demonstram que Survivin existe em exossomos de plasma de ambos, BPH e PCA indivíduos normais. As quantidades relativas de exosomal Survivina em CaP plasma foi significativamente maior do que naqueles com pré-inflamatório BPH e controle plasma. Esta expressão diferencial de exosomal Survivin foi visto com ambos os assuntos CaP recém-diagnosticados e avançados com cânceres de alto ou de baixo grau. A análise dos níveis Survivin exosomal plasma podem oferecer uma ferramenta conveniente para diagnosticar ou monitorar APC e pode, como é elevada em baixo, bem como alta Gleason marcados amostras, ser utilizado para a detecção precoce

Citation:. Khan S, Jutzy JMS, Valenzuela MMA, Turay D, Aspe JR, Ashok A, et al. (2012) derivada de plasma Exosomal Survivin, um biomarcador plausível para detecção precoce de câncer de próstata. PLoS ONE 7 (10): e46737. doi: 10.1371 /journal.pone.0046737

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 03 de abril de 2012; Aceito: 04 de setembro de 2012; Publicado: 16 Outubro 2012 |

Direitos de autor: © Khan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte de um generoso arranque de fundo para o PI (NRW) pelo Centro de Biologia Molecular e Terapia genética, que hoje tem o nome do Centro de Saúde disparidades e Medicina Molecular e da Universidade Loma Linda. O PI também contribuiu com fundos da sua conta pessoal. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

em todo o mundo, o cancro da próstata (CaP) é o segundo cancro mais frequentemente diagnosticado e a sexta maior causa de morte por câncer em homens [1], [2]. O aumento da idade, etnia e história familiar são os únicos fatores de risco estabelecidos e não há fatores de risco evitáveis ​​conhecidos estabelecidos até à data [2]. cancros da próstata (CaP) são geralmente doenças malignas que são caracterizadas por um desequilíbrio nas taxas de divisão celular e morte celular de crescimento lento [3]. A cirurgia e a terapia de radiação são eficazes para a doença localizada, mas não existe uma estratégia eficaz para tratamento CaP recorrente ou metastático que falhou cirurgia, radiação ou terapia hormonal [4]. Um desafio importante para desenvolver tratamentos que são mais eficazes depende da nossa compreensão do mecanismo molecular (s) de progressão APC, que nos levará a identificar muitos genes alvos terapêuticos potenciais e os processos que estão envolvidos na apoptose, proliferação celular, metástase, e factor de crescimento de sinalização. antígeno específico da próstata Total (PSA) revolucionou triagem APC e resultou em uma diminuição global CaP metástase e morte [5]. Infelizmente, a aplicação do teste de PSA também levou a um excesso de detecção e tratamento excessivo como PSA não é nem cancro específico nem um substituto para o comportamento biológico de CaP [5], [6]. Os aumentos nos níveis de PSA pode reflectir uma presença do cancro, mas também podem estar presentes como resultado de infecção, inflamação crónica ou hiperplasia prostática benigna (BPH) [7], [8]. HBP tem sido demonstrado que existe em mais do que 70% dos homens com idade superior a 70 mas não é considerado como sendo um precursor de cancro da próstata que eles frequentemente coexistem [9]. Por conseguinte, é necessário continuar a triagem de biomarcadores que são específicos de cancro e que são detectáveis ​​no início do curso da doença.

Os processos tanto de sobrevivência celular e morte celular têm envolvido vias de sinalização que são altamente regulados actualmente objecto de intensa investigação. Sabe-se que a regulação da apoptose tem um papel central no desenvolvimento de cancro da próstata e a sua progressão para um estado independente de androgénios, o que é devido, em parte, para a regulação de genes anti-apoptóticos após privação de androgénios [10] – [12]. Várias linhas de evidência sugerem que um dos principais eventos associados com a progressão após insucesso terapêutico é o aumento da resistência à apoptose [13], [14], principalmente devido à regulação para cima de genes anti-apoptóticos, incluindo Bcl-2, Bcl-X

L, Mcl-1 [15], e Survivina [16]. A survivina, um membro da família de proteínas de inibidor-apoptose (IAP), está associada com o desenvolvimento de CaP, progressão, e resistência a drogas [17] – [20]. Evidências recentes indicam que a sobre-expressão de Survivin em tumores PCA é associado com mau prognóstico e aumento da recorrência do tumor [21]. Em contraste, também tem sido demonstrado que o knockdown de expressão de survivina por ARNsi aumenta a quimio-sensibilidade de células de cancro da próstata, a redução da tumorigenicidade [22].

Tradicionalmente, Survivina tem sido visto como uma proteína citoplasmática ou nuclear. Recentemente, Survivina tem sido também demonstrado que existem extracelularmente, contido em pequenas vesículas ligadas à membrana conhecidas como exossomas [23], [24]. Os exossomas estão presentes no soro e na urina e contêm uma vasta gama de proteínas e de ARN e representam seu tecido de origem tornando-os uma possível fonte ou conjunto de novos biomarcadores CaP [25]. Consistente com a associação da Survivina com os parâmetros clínico desfavoráveis, tráfico extracelular de Survivina em todo o microambiente do tumor poderia ser responsável por aumentar o estado agressiva de um tumor, enquanto proíbe ou minimizar resultados terapêuticos. Recentemente demonstramos que a proteína Survivin-bound exosome pode ser secretada por células cancerosas e ser absorvida pelas células ao redor, produzindo um efeito de campo que confere um fenótipo geral estresse sobrevivência.

O presente estudo foi desenhado para investigar a existência de exosomal Survivina no plasma de pacientes com CaP, com uma variedade de apresentações APC e para comparar os seus níveis de expressão exosomal aos encontrados em voluntários de controlo sem um diagnóstico de cancro e de doentes com diagnóstico de hiperplasia benigna da próstata ou hiperplasia prostática benigna. Nos últimos 25 anos, o sistema de graduação de Gleason foi usado para ajudar a avaliar o prognóstico de homens com câncer de próstata. Em conjunto com outros parâmetros, cancro da próstata tem sido encenado como um meio para prever a prognose e orientar a terapêutica [26]. Extracelular Survivin foi encontrado altamente expresso nas exosomes plasma de pacientes CaP expositoras escores de Gleason de 6 (baixo) e 9 (alta), e em pacientes que recaíram sobre a quimioterapia. No entanto, não houve diferenças significativas nos níveis de survivina entre indivíduos com pontuações baixas ou altas Gleason. Além disso, embora os exossomas contendo Survivina foram encontrados no soro de pacientes com um diagnóstico de hiperplasia prostática benigna, o nível global foi significativamente mais baixa do que a encontrada no plasma de pacientes com CaP. Acreditamos que, além de marcadores de diagnóstico, marcadores prognósticos, preditivos e terapêuticos são necessários para agir endpoints como substitutos na gravidade da doença previsão, tratamentos de escolha, e as respostas de monitoramento de terapias [27] – [30]. A nossa demonstração de exosomal Survivina no plasma de paciente com baixo grau recentemente diagnosticada CaP proporciona uma base racional para estudos para investigar a utilidade de exosomal survivina como um biomarcador precoce, facilmente medida para diagnóstico CaP. Exosomal Survivin também pode ser estudada como um biomarcador para monitorar o tratamento de indivíduos com CaP avançado.

Resultados

Os níveis plasmáticos de Survivina em controles saudáveis ​​e pacientes CaP

Survivin foi detectável no plasma de todos os indivíduos de controle saudáveis ​​e pacientes APC. Os resultados das medições de plasma Survivina em controlos saudáveis ​​e pacientes com CaP normal são mostrados na Figura 1A. Os níveis de survivina média de plasma foram significativamente diferentes entre os indivíduos de controle saudáveis ​​(61,5 pg /ml nos controles [n = 10]) e os grupos de pacientes com cancro diferente (Gleason 6 = 401,7 pg /ml [n = 10], Gleason 9 = 375,2 pg /ml [n = 10], e submete resistentes ao agente de quimioterapia, o Taxotere = 410 pg /ml [N = 8]; P 0,05 para cada comparação vs. controlo). Quando os níveis de survivina foram comparados entre os três grupos de pacientes CaP em comparações de duas vias, nenhum foi significativamente diferente dos outros.

A. níveis de survivina foram medidos em plasma derivado de Gleason 6 (n = 10), Gleason 9 (n = 10) e os indivíduos resistentes à Taxotere (n = 8). B. Níveis de survivina foram medidos em soro derivado de BPH (n = 20), e PCA (n = 19). Foram realizadas comparações utilizando MANOVA com controles saudáveis ​​(n = 10 e 6, respectivamente). (** P 0,05, ***, p 0,001; estatisticamente significativo).

Survivina podem ser recolhidos a partir do soro retirado de controles saudáveis, BPH e PCA Pacientes

Tal como o que foi medido acima no plasma, Survivina, também foi detectável no soro de pacientes que não tenham diagnóstico prévio de cancro, bem como em doentes com o diagnóstico de hiperplasia prostática benigna (BPH) e pessoas diagnosticadas com cancro da próstata (CaP) (Figura 1B). Os níveis de survivina séricos médios foram significativamente (P 0,001) maior nos indivíduos PCA (150 pg /ml [n = 19]) do que no soro processado a partir de controlos normais (59,7 pg /ml [n = 6]) e de BPH pacientes (55 pg /ml [n = 21]).

Plasma e soro Survivina em pacientes CaP existe em uma piscina exosomal

Nós já demonstraram que as células cultivadas CaP liberar Survivin na extracelular ambiente dentro do exossomos [23]. Estas pequenas, vesículas de membrana também são conhecidos por ocorrer no plasma, bem como soro de pacientes com cancro [31], [32]. Os exossomas foram, por conseguinte, recolhido por centrifugação diferencial, e quantificada utilizando os ensaios enzimáticos acetilcolinesterase como nós e outros já descrito anteriormente [24], [33]. Os níveis médios exossomo plasma foram significativamente diferentes entre os indivíduos saudáveis ​​de controle e os diferentes grupos de pacientes com câncer (P 0,001), enquanto que diferenças significativas na quantidade exosome não foram encontradas entre os grupos de amostras do paciente PCA (Figura 2A). Este foi também o caso quando se comparam as quantidades de exossoma encontrados em amostras BPH e APC, para que os indivíduos de controlo saudáveis ​​(Figura 2B). Curiosamente, não parece haver uma diferença mensurável em Survivina e em exossomas, dependendo da fonte de como ambos Survivina e quantidades de exossoma foram maiores quando purificada a partir de plasma, em seguida, quando purificada a partir do soro.

. níveis de exossoma foram medidos em plasma derivado de Gleason 6 (n = 10), Gleason 9 (n = 10) e os indivíduos resistentes à Taxotere (n = 8). B. níveis de exossoma foram medidos em soro derivado de BPH (n = 20), e PCA (n = 19). Foram realizadas comparações utilizando MANOVA com controles saudáveis ​​(n = 10 e 6, respectivamente). (** P 0,05, ***, p 0,001; estatisticamente significativo).

exossomos derivados do plasma contêm Survivin

Os exossomas foram caracterizados por immunoblotting para a quantidade de proteínas survivina e lisossomal associada membrana proteína 1 (LAMP1). LAMP1 é uma proteína exossomo conhecido que é normalmente utilizado para assegurar mancha Ocidental carga adequada [24], [34], [35]. Os exossomas isolados a partir de plasma de pacientes exibiram CaP reforçada cargas survivina em comparação com controlos de isolados exossomas (Figura 3). A análise Western blot mostrou que pouca exosomal Survivina foi detectável em amostras de plasma colhidas a partir de seis controlos não tendo diagnóstico prévio de cancro, em comparação com a proteína específica-exossomo LAMP1 (Figura 3A). Em contraste, os exossomas isoladas a partir de todos os vinte pré-tratamento de indivíduos com CaP continha quantidades elevadas de proteína Survivina em comparação com os níveis de proteína LAMP1 (Figura 3B). Curiosamente, não houve diferença significativa no teor de Survivina exosomal entre pacientes com CaP de Gleason 6 e aqueles com Gleason 9 CaP (Figura 3C) quando normalizado contra LAMP1 (p 0,05).

. Anticorpos para Survivin e LAMP1 foram utilizados para Western blot da proteína exosomal purificado-paciente controle. B. Ambos os anticorpos LAMP1 survivina e foram detectadas na técnica Western Blot de exossomas-derivado de Gleason 6 e 9. Gleason análise Proporção C. de Survivina densidade a densidade LAMP1 foram mostrados em ambos Gleason 6, e Gleason 9 com controlos saudáveis ​​normais (* *, p 0,05, estatisticamente significativo) sem significância gravado entre Gleason 6 e Gleason 9 exossomos derivados de plasma

a expressão diferencial de Survivin existe em BPH e PCA-derivados exosomes

Como acima, os exossomas recolhidos de BPH e PCA soros de pacientes foram caracterizados por imunotransferência de Survivina e proteína LAMP1 (Figura 4A). Exossomos isoladas de APC e BPH soros de pacientes exibiram reforçada cargas Survivin comparação com exosomes isoladas de controles (Figura 4A, 4B e figura S1). Curiosamente, apesar de Survivina foi detectado em mais elevados e, em certos doentes com HBP, o seu nível global foi significativamente menor do que a encontrada no APC e não houve diferença significativa medida entre BPH e controlar soros de pacientes (Figura 4B).

UMA. Anticorpos para Survivin e LAMP1 foram utilizados para Western blot da proteína exosomal purificado-paciente. B. análise Proporção de Survivin densidade a densidade LAMP1 foram mostrados em ambos BPH e PCA com controles saudáveis ​​normais (** p 0,05, ***, p 0,001; estatisticamente significativo) sem significância gravado entre controles normais e BPH.

pacientes APC com a progressão da doença expressam altos níveis de exosomal Survivin

por fim, avaliamos exosomes coletadas de pacientes CaP que a doença evoluiu durante o tratamento com quimioterapia. Como em nossos exossomos de pacientes Gleason, Western blot mostrou níveis de proteína survivina (Figura 5A) foram significativamente mais elevados quando comparados com indivíduos de controlo livres de câncer, o que foi confirmado para ser significativo após análise densitométrica (Figura 5B).

A . anticorpos survivina e LAMP1 foram mostrados positivo. B. A análise densitométrica da Survivin expressão /LAMP1 em um controle saudável (normal) e chemoresistance casos (CR) (** p 0,05, estatisticamente significativo)

As características clínicas e patológicas

.

os dados pré-tratamento em matéria de plasma inicial survivina e PSA níveis e escores de Gleason foram adquiridos para os pacientes estudados. Estas características patológicas estão detalhados nas Tabelas 1, 2, 3, 4. Em todos, oito casos de recorrência do câncer de próstata após o tratamento convencional, dez casos de Gleason 6, dez casos de Gleason 9, (Tabela 1); e dez casos de controle (Tabela 2) foram coletadas com plasmas analisados. PSA a partir do plasma (relatório clínico) e a partir dos exossomas Purificou-ultracentrífuga mostrou que, embora as concentrações de proteína não eram idênticas, existia uma semelhança na tendência de plasma para os valores de PSA de exossoma derivados de plasma. Importante, Survivin equivale embora significativamente menos nos exosomes eram mais consistente entre os pacientes avaliados, e dada a sensibilidade do teste ELISA, picogramas por Survivin comparação com nanogramas para a PSA, é mais preciso.

Mais estudos utilizando soros em vez de plasma foram realizadas em seis controles, vinte casos de hiperplasia prostática benigna (Tabela 3) e 19 casos de CaP adicionais (Tabela 4). Como antes, os resultados de ELISA de Survivina fornecida uma quantificação mais sensível e estável do que o ELISA para a PSA. A determinação quantitativa dos soros de doentes com HBP mostrou uma média de 52,9 pg /ml e 1,3 ng Survivina PSA /ml. Em comparação, quando avaliado a partir de pacientes com CaP, Survivina média de 149 pg /ml e PSA em média de 0,3 ng /ml (Tabelas 3 e 4). números BPH para ambos Survivina e PSA são quase três vezes mais baixa do que nos soros doente de PCA. Infelizmente, comprada amostras BPH não veio com as quantidades de ELISA PSA clínicos que nós tenhamos dos casos CaP (Tabela 3).

Correlações de Survivina com PSA

de amostras de plasma /soro do paciente avaliada para Survivina, todas as amostras (Gleason 6, Gleason 9, recidiva, ou amostras PCA) exibiram maior do que 100 pg /mL de survivina (Tabela 5). Em contraste, apenas 60% de Gleason 6, 80% de Gleason 9 plasmas e 84% dos soros de CaP tinha um PSA de maior do que 4 ng /mL. plasmas de doentes recorrentes todos tinham maior do que 4 ng /mL. Em plasmas de controlo e soros BPH, nenhuma amostra tinha uma concentração Survivin superior a 100 pg /mL e nenhuma concentração de PSA acima de 4 ng /mL (Tabela 5).

Discussão

carcinoma da próstata resistente à apoptose com expressão alterada de ambas as proteínas pró e anti-apoptóticos, ultrapassando assim os pontos de verificação de vigilância interna, a crescer em microambientes desfavoráveis, bem como a aquisição de um fenótipo invasivo [20]. Estudos recentes sugerem que a inibição da apoptose, em vez da proliferação celular aumentada, é uma característica fundamental que contribui para a carcinogénese da próstata. Entre os reguladores de apoptose CaP, recentemente o interesse centrou-se sobre a survivina, um membro multifuncional do inibidor de apoptose família (IAP) gene que neutraliza a morte celular e controla progressão mitótica. superexpressão seletiva de Survivin foi associado com maior grau do tumor, estágio avançado da doença, a progressão rápida do tumor, a sobrevida do paciente curto, e resistência à terapia em pacientes com várias doenças malignas [17] – [19].

Survivin existe em um número de locais subcelulares tais como a mitocôndria, citoplasma e núcleo. Recentemente, também foi encontrado no espaço extracelular [23], [24]. Mostrámos que existe extracelular Survivina em complexos multimolecular que incluem as proteínas de choque de calor [24]. Além disso, também têm mostrado que estes complexos residem nos ou sobre os exossomas, e o tratamento do cancro que pode aumentar a libertação de tais exossomas a partir de células cancerosas [24]. Extracelular Survivin é capaz de mediar um efeito de campo pró-sobrevivência através da sua secreção por células cancerosas e absorção pelas células normais e transformadas em torno [23]. Ligando capacidade extracelular da Survivina para aumentar a proliferação celular, sobrevivência e a invasão de células de tumor com uma modalidade tráfico membrana de protecção proporciona suporte adicional para a hipótese de que a Survivina desempenha um papel fundamental na fisiopatologia de crescimento de células cancerosas e a protecção de intervenções terapêuticas.

Vários estudos anteriores examinaram os níveis plasmáticos de survivina em doentes com cancro [36], [37]. Na leucemia de células T de adultos e os sobrenadantes de culturas in vitro de células de tumor sólido, os níveis de proteína de Survivina foi baixa em comparação com a proteína celular de Survivina e os níveis de ARNm [37]. Esta constatação resultou na conclusão de que os níveis de proteína survivina no plasma não reflectem os níveis de survivina celulares. Além disso, os níveis plasmáticos de survivina foram avaliados em relação a alfa-fetoproteína (AFP) em doentes com hepatite C crónica, infecção viral (HCV) com e sem o carcinoma hepatocelular (HCC) [36]. Embora não concluiu ser tão fiável nestes estudos como AFP, os níveis de survivina foram determinadas para ser mensurável e significativa em doentes que sofrem com HCV e mensurável mas não significativa nos doentes com HCC. Apesar de não ser totalmente clara, estes resultados podem ser explicados pela descoberta de que as células HCC infectadas com HCV tornou-se mais resistentes à morte celular e, assim, a Survivina solte comparado com o controlo ou células infectadas com HCV sozinho [36].

A próstata antígeno ensaio (PSA) específico foi controversa utilizada no rastreio do cancro da próstata, embora inicialmente foi concebido como uma ferramenta para avaliar a resposta ao tratamento [38]. Seu uso como uma ferramenta de triagem foi impulsionado tanto pela incidência do cancro da próstata dos EUA e uma necessidade de detectar a sua presença em um momento que permitiria o tratamento curativo para começar. Infelizmente, acredita-se que seu uso ter levado tanto sobre diagnóstico e tratamento excessivo e, portanto, a necessidade urgente de novos biomarcadores de ser encontrado para complementar PSA para a gestão e tratamento [39]. medições Exosomal survivina pode fornecer outro ensaio baseado em plasma para a presença de CaP. No presente estudo, foram identificados pela primeira vez que os exossomas contendo Survivina pode ser purificado a partir do plasma recolhido de doentes com um diagnóstico de CaP. Embora houve pouca diferença na quantidade exossomo, os níveis de survivina exosomal foram maiores nos exossomas purificadas a partir de pacientes com CaP do que a partir dos soros de controlos normais. Além disso, no presente estudo e que executada por outros [36], [37], os níveis de survivina survivina em amostras retiradas de pacientes sem cancro diagnóstico confirmado quantificada em plasma, também reduzida em comparação com soros doente de PCA. A fonte deste exosomal Survivina piscina, embora claro, podem ser originários de células imunes [40], tais como linfócitos [41], os monócitos [42] e células dendríticas [34], todas as células que contêm Survivin [43], que foram mostrados para libertar exossomos. expressão survivin está associado às características estabelecidas de carcinoma da próstata biologicamente agressivo, como a maior pontuação de Gleason final e metástases em linfonodos regionais [20]. Em nosso estudo descobriu que os pacientes que tinham falhado o tratamento com Taxotere tinham níveis elevados de exosomal Survivina. Além disso, e de especial interesse, descobrimos que pacientes apresentando qualquer meio (Gleason 6) ou pontuações mais altas (Gleason 9) Gleason exibiram níveis Survivin maior exosomal sem diferença significativa no conteúdo de Survivin entre eles. Nossos resultados, embora mais robustos no plasma estudamos aparecem de acordo com o que foi encontrado com a urina, exosomes tumorais e PSA [31]. Nestes estudos, urina exosome PSA é descrito como presente em 20 dos 24 espécimes CaP enquanto em nossas mãos, exosome tumor Survivin é encontrada em 47 de 47 espécimes. Quer ou não o tratamento do câncer irá afectar os níveis de survivina exossomo tumor ainda não foi avaliado.

Neste estudo, nós fornecemos evidências convincentes de que a circular Survivina pode ser um marcador diagnóstico e prognóstico útil para CaP humano. Os nossos resultados indicam que a Survivina, analisados ​​directamente a partir de soro /plasma ou soro de exossomas /derivado de plasma, foi mais baixa em pacientes com BPH e controlos saudáveis ​​do que em homens com PCA. níveis de survivina não se alterou, sendo consistentemente elevada, em relação à classificação de Gleason e pacientes com recidiva, o que sugere que os níveis de survivina pode ser utilizado para a detecção precoce e poderia talvez um dia diferenciar com mais precisão a partir de CaP HBP. Comparando pacientes com e sem tumores, mas ambos com valores elevados de PSA também será um próximo passo importante, como em nossas mãos todas as amostras de BPH que adquirimos tem relativamente valores de PSA não-cancerosas [44].

A papel de exosomal Survivina ainda é desconhecido. É possível que, a liberação celular salientou-terapia de exossomos contendo Survivin e outros antiapoptóticas proteínas, RNAs ou miRNAs é realizada como uma última tentativa de se proteger do estresse que existe dentro do microambiente do tumor. estudos maiores, com mais eventos e mais tempo de acompanhamento será necessário para desenvolver uma declaração mais definitiva sobre a associação da expressão de Survivin em exossomos ou no microambiente tumoral com a progressão do carcinoma da próstata e como importante, metástases e sobrevivência. Estes achados irá fornecer uma base racional para uma avaliação mais aprofundada da exosomal Survivin e seu papel na resistência à terapia à base de andrógeno no carcinoma da próstata e levantam a possibilidade da terapia de combinação alvo de câncer de próstata avançado.

A nossa constatação de que Survivin, um inibidor humano único de apoptose (IAP), tem o transporte intercelular e sinalização capacidades é significativo. Consistente com a associação de Survivina com os parâmetros clínico desfavoráveis, o tráfico de Survivina em todo o microambiente do tumor pode dirigir o estado agressivo do tumor, proibir ou minimizar resultados terapêuticos. No nosso trabalho de corrente que mostram que embora o número total de exossomas a ser derramado em plasma do doente não se altera significativamente durante o desenvolvimento do cancro, o nível de Survivina naqueles exossomas aumenta significativamente. Importante, progressão de médio a tarde-estágio não dirige um aumento sensível Survivin indicando que Survivin pode ser útil como um biomarcador para a detecção precoce do câncer de próstata. Na verdade, testes baseados em Survivin, realizada em tumor-exossomos, vai permitir o diagnóstico molecular com base em que com o tempo pode também auxiliar na decisão terapêutica e vigilância doença resposta levando a uma melhor gestão do câncer de próstata.

Materiais e Métodos

paciente plasma e soro

As amostras de plasma foram coletadas de dez voluntários saudáveis ​​do sexo masculino e vinte e oito pacientes APC. O plasma de vinte sujeitos ACP foi obtido a partir do banco de espécimes do consórcio SPECS que é um ensaio clínico de observação, que utiliza tecido da próstata e valores clínicos obtidos por consentimento informado para derivar assinaturas de gene preditivo do resultado no momento do diagnóstico. SPECS é dirigido pelo Dr. Dan Mercola, da Universidade da Califórnia, em Irvine. As amostras foram plasma pré-prostatectomia selecionados aleatoriamente de dez casos de baixo grau CaP (Gleason 6) e dez casos PCA-alto grau (Gleason 9). Além disso, o plasma de oito avançado de doenças pacientes CaP participaram de um ensaio de quimioterapia de segunda linha também foi coletada. Esses pacientes tinham falhado quimioterapia com Taxotere. Dezenove amostras de soro foram coletadas de pacientes APC e seis controles através do San Manuel Band of Mission Indians Biospecimen Laboratório de Loma Linda Universidades Cancer Center. Vinte amostras BPH foram adquiridos a partir de Bioserve Biotechnologies, Beltsville, MD. BioServe Biotechnologies como provedor destas amostras é coberto, tal como definido na Lei de HIPPA de 1996, como é proporcionar-lhes para nós com um conjunto limitado de dados de informações de saúde protegidas.

O sangue foi recolhido em tubos de vácuo contendo heparina sódica. Os tubos foram centrifugados a 2000 g × 7 minutos, e o plasma foi removido e, em seguida, dividido em alíquotas para armazenamento a -80 ° C. Todas as amostras foram obtidas no decurso de estudos IRB-aprovados, seguindo a documentação do consentimento informado, de acordo com a política da universidade, tanto a Loma Linda University e da Universidade da Califórnia em Irvine.

Human Survivin Immunoassay

amostras de plasma total foram sujeitas a um imunoensaio de Survivina humana disponível comercialmente (R D systems, Minneapolis, MN). utilizando as instruções do fabricante, a fim de quantificar as concentrações de survivina

exossomo Isolamento

plasma microvesículas foram isolados como descrito previamente, com modificações de menor importância [45]. Descongelados, criopreservados de plasma (2 ml) foi centrifugado durante 30 min a 500 x g, 45 min a 12.000 x g e 18 h a 110000 × g. As peletes foram ressuspensas em um grande volume de PBS, filtrado através de um filtro de 0,22 mícrons (Millipore, Billerica, MA) e centrifugado a 110.000 x g durante 1 h. microvesículas peletes foram lavadas uma vez em um grande volume de PBS, centrifugou-se a 110000 x g durante 1 h e re-suspenso em 50-200 ml de PBS. A quantidade de 110000 × g de sedimento proteínas recuperadas foi medida utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Os exossomas foram usados ​​como preparações frescas de imunotransferência ou foram conservadas a -80 ° C para uso posterior. Para as amostras de soro, o ExoQuick disponível comercialmente (SBI, Mountain View, CA) foi utilizado tal como descrito pelo fornecedor. Resumidamente, 100 mL de soro foi incubado com 100 ul de solução ExoQuick seguido de uma incubação de 2 h a 4 ° C, seguido por centrifugação a 1500 × g durante 30 minutos. Após centrifugação os exossomas aparecer como um sedimento bege ou branca na parte inferior do recipiente, que é então reconstituído com 500 uL de dH

2O.

exossomo quantificação

Para quantificar a quantidade de exossomas divulgados, avaliou-se a actividade da acetilcolinesterase, uma enzima que está associado com essas vesículas. a actividade da acetilcolinesterase foi avaliada tal como descrito por Savina et ai. [46]. Resumidamente, 40 uL da fracção exossomo foi suspenso em 110 ul de PBS. 37,5 ml desta fracção exossomo PBS-diluído foi então adicionado a poços individuais numa microplaca de 96 poços de fundo plano. acetiltiocolina 1,25 mM e 5,50 mM de 0,1-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) foram então adicionadas a fracções de exossoma num volume final de 300 ul, e a alteração da absorvância a 412 nm foi monitorado a cada 5 minutos durante 30 minutos.

PSA Immunoassay humano

exosomes isolada de plasma dos pacientes foram submetidos a próstata humana antigénio específico (PSA) usando um PSA Immunoassy (produtos American Research, Inc., Waltham, MA, EUA), seguindo o kit as instruções do fabricante, a fim de quantificar as concentrações de PSA em exossomas.

análise Western blot

para a análise de transferência de Western, as células ou preparações exosomal foram lisadas utilizando tamp de lise (Tris 50 mM (pH 7,5), 1 % de NP40, 0,25% de DOC, 150 mM de NaCl

2, PMSF 1 mM, 10 ug /ml de aprotinina /leupeptina /pepstatina, NaF 20 mM, EGTA 0,2 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0), H 2 O). Para concentrações de proteína foi utilizado o ensaio BCA (Pierce, Rockford, IL). Proteínas de exossomas (20-40 ug) foram separadas utilizando 12% de géis de poliacrilamida Bis-Tris, transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA) e sondado utilizando os seguintes anticorpos: anti-rato monoclonal LAMP1 (Abcam, Cambridge, MA ), e anticorpos policlonais de coelho anti-Survivina (Novus, Littleton, CO). anticorpos secundários (IR-Tintura conjugados) foram de cabra anti-coelho e de cabra anti-imunoglobulina de ratinho (LICOR, Lincoln, Nebraska).