Abstract

Nós macrófagos previamente definidos colhidas a partir da cavidade peritoneal de camundongos nus com tumores pancreáticos humanos subcutâneos como “educado-tumor-macrófagos” (Edu) e macrófagos colhidos de ratinhos sem tumores como “ingênuos-macrófagos “(não tratados), e demonstraram que os macrófagos de edu-promovido o crescimento de tumores e metástases. Neste estudo, Edu- e sem tratamento prévio com macrófagos foram comparados quanto à sua capacidade para melhorar a malignidade do cancro do pâncreas, ao nível celular in vitro e in vivo. Foi também determinada a eficácia inibitória de ácido zoledrónico (ZA) em metástases edu-macrófago-melhorada. células pancreáticas humanas XPA1 câncer em Gelfoam co-cultivadas com Edu-macrófagos proliferaram em maior medida em comparação com XPA1 células cultivadas com Naïve-macrófagos (

P

= 0,014). células XPA1 exposta a meio condicionado colhido a partir de cultura edu significativamente o aumento da proliferação (

P

= 0,016) e maior capacidade de estimulação de migração (

P

0,001) em comparação com as células cancerosas em cultura tratados com o meio condicionado de Naïve. O índice mitótico das células XPA1, expressando GFP no núcleo e no citoplasma de RFP, aumentou significativamente in vivo na presença de Edu- comparação com naive-macrófagos (

P

= 0,001). O ácido zoledrónico (ZA) matou tanto Edu e Naïve in vitro. Edu promoveu o crescimento tumoral e a metastase num modelo ortotópico de rato a linha celular de cancro pancreático humano XPA1. ZA reduziu o crescimento do tumor primário (

P

= 0,006) e impediu a metástase (

P

= 0,025) promovido pela Edu-macrófagos. Estes resultados indicam que ZA inibe o crescimento do tumor primário avançado e metástase de câncer pancreático humano induzida por Edu-macrófagos

Citation:. Hiroshima Y, Maawy A, Hassanein MK, Menen R, Momiyama M, Murakami T, et al . Aumento (2014) O Tumor-educado e Macrófagos de malignidade of Human Câncer de pâncreas é impedida por ácido zoledrónico. PLoS ONE 9 (8): e103382. doi: 10.1371 /journal.pone.0103382

editor: Keping Xie, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de maio de 2014; Aceito: 01 de julho de 2014; Publicação: 12 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Hiroshima et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por CA132971 concessão National Cancer Institute e Números JSPS KAKENHI Grant 26.830.081 para Y.H., 26.462.070 para I.E. e 24592009 para K.T. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Yukihiko Hiroshima, Shinji Miwa, Mako Yamamoto, Shuya Yano são afiliadas da AntiCancer Inc. Mohamed K. Hassanein, Rhiana Menen, Masashi Momiyama, Fuminari Uehara e Takashi Chishima eram ex-filiais da AntiCancer Inc. Robert M. Hoffman é uma filial não-remunerada da AntiCancer Inc. AntiCancer Inc. comercializa modelos animais de câncer. Não há outros interesses concorrentes. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

O microambiente tumoral (TME) desempenha um papel importante na determinação do comportamento do tumor. Nós mostramos anteriormente que as células do estroma são necessárias para a metástase de ocorrer [1]. Outra indicação da função do TME, influenciando o comportamento do tumor é o implante ortotópico em modelos de ratinho de tecido tumoral intacta, incluindo todo o estroma tumoral, o que resulta em uma taxa de metastático muito mais elevado em comparação com a injecção ortotópico de células cancerosas por si só, em que a metástase é rara [2], [3].

macrófagos associados a tumores têm sido mostrados para correlacionar com prognóstico pobre em vários estudos [4], [5]. Os macrófagos podem promover a progressão do tumor por uma inflamação crónica, remodelação da matriz, a promoção da invasão de células de tumor, intravasation, angiogênese e semeadura em locais distantes [6]. molécula de adesão vascular-1 (VCAM-1) promove a metástase pulmonar no cancro da mama amarrados células cancerosas do pulmão macrófagos associados a metástase [7], [8].

crescimento do tumor nosso laboratório anteriormente comparação primário e metastático após a adição de qualquer tumor-naïve-macrófagos (naïve) ou macrófagos previamente expostas ao câncer de pâncreas em um modelo de rato, que foram denominadas com formação de tumor-macrófagos (Edu) [8].

os resultados anteriores sugerem que os tumores macrófagos de influência e tumores influenciar macrófagos, e que Edu-macrófagos promover a progressão do tumor [8].

no presente estudo, Edu- e ingênuo-macrófagos foram comparados por sua capacidade de promover a malignidade no nível celular in vitro e in vivo. A eficácia do ácido zoledrónico (ZA) para inibir Edu-macrófagos reforçada malignidade foi também determinada.

Materiais e Métodos

condições

linha de células e cultura

O XPA1 pancreático humano linha de células de câncer foi utilizada neste estudo, que foi um presente amável do Dr. Anirban Maitra na Johns Hopkins University [6] – [16]. A linha celular XPA1 foi transformada para expressar estavelmente GFP no núcleo e no citoplasma RFP [9], [17], [18]. As células foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 2 mM de glutamina (Gibco-BRL, Life Technologies Inc., Grand Island, NY). Todos os meios foram suplementados com penicilina e estreptomicina (Gibco-BRL). As células foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2 [19].

Animais

NOD /SCID e camundongos atímicos (

nu /nu

), foram utilizados 4-6 semanas, (AntiCancer Inc., San Diego, CA). C57 ratinhos transgénicos nu /B6-GFP (AntiCancer, Inc., San Diego, CA). expressar a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do promotor de citomegalovírus e potenciador de frango β-actina também foram usadas [20] – [23]. Os ratos foram mantidos em uma instalação de barreira sob a filtração HEPA. Os ratinhos foram alimentados com uma dieta de roedores autoclavada de laboratório. Todos os procedimentos cirúrgicos e de imagem foram realizados com os animais anestesiados por injecção intramuscular de 0,02 ml de uma solução de 50% de cetamina, xilazina 38%, e 12% de maleato de acepromazina. Todos os estudos com animais foram realizados com uma Comissão AntiCancer Institutional Animal Care e Uso (IACUC) -protocol aprovado especificamente para este estudo e de acordo com os princípios e procedimentos descritos no Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais sob Assurance Número A3873-1.

célula de tumor subcutâneo implantação

XPA1 Humano dual-cores pancreáticas células cancerosas foram colhidas por tripsinização e lavadas duas vezes com meio isento de soro. As células (2 x 10

6 em 100 ul de soro livre de meios) foram injectados subcutaneamente, no prazo de 30 min de colheita, ao longo dos flancos de ratinhos nus transgénicos C57 /B6-GFP ou transgênicas

nu /nu

ratinhos entre 4 e 6 semanas de idade. tumores subcutâneos foram deixadas crescer durante 2-4 semanas até que grande o suficiente para mais experiências ou implante ortotópico subsequente.

imagens em tempo real das interações entre macrófagos do hospedeiro e as células cancerosas em camundongos vivos

depois de os murganhos foram anestesiados como descrito acima, uma incisão em forma de arco foi feita na pele abdominal, e, em seguida, tecido conjuntivo subcutâneo foi separada para libertar a aba de pele sem ferir a artéria epigástrica cranial e veia [24]. A pele-flap foi espalhada e fixado em um suporte plano. células XPA1-GFP-RFP (1 × 10

6 em 100 ul de meio) foram aspergidos sobre a superfície da pele de abas de ratinhos (Fig. 1A) [25]. Vinte e quatro horas mais tarde, a superfície interior da pele de abas foi directamente observado com o microscópio confocal FV1000 (Olympus, Tóquio, Japão), com excitação a partir de lasers semicondutores a 473 nm para 559 nm GFP e para a excitação RFP. As imagens de fluorescência foram obtidas usando o 20 × /1,0 XLUMPLFLN objectivo [26]. O número de células cancerosas fagocitados e mitóticas foram contados, eo número médio foi calculado a partir de cinco campos visuais em 20 × ampliação.

(A) Esquema de imagiologia as interações entre macrófagos do hospedeiro e as células cancerosas em ratos vivos. ratinhos nus GFP com tumores subcutâneos dual-cores XPA1 eram a fonte de Edu-macrófagos. ratinhos nus GFP sem tumores eram a fonte de Naïve-macrófago. Uma pele-flap foi espalhada e fixado em um suporte plano. células XPA1-GFP-RFP (1 × 10

6 em 100 ul de meio) foram aspergidos sobre a superfície da pele de ratinhos aba. Vinte e quatro horas mais tarde, a superfície interior da pele de abas foi directamente observado com o microscópio confocal FV1000 (Olympus). Barras de escala: 10 mm. macrófagos hospedeiras GFP e células cancerosas XPA1 de duas cores foram observados em ratinhos sem tratamento prévio com macrófagos (B) e os ratinhos edu-macrófagos (C). células cancerosas fagocitados (setas brancas) e células cancerosas mitóticas (pontas de seta amarelo) foram detectadas nos dois grupos. Os valores médios das células cancerosas e phagocytosized mitóticas foram calculados a partir de quatro campos com uma objectiva de 20 x de ampliação (D e E). Mitose aumentaram significativamente em células cancerosas em ratos com Edu-macrófagos em comparação com as células cancerosas em ratos com Naïve-macrófagos (

P

= 0,001). Mais fagocitose de células cancerosas tendem a ser detectada em ratos tratados previamente com-macrófagos, (

P

= 0,061). Barras de escala:. 20 um

macrófagos colheita

camundongos C57 nu Transgenic /B6-GFP com os tumores subcutâneos dual-cores XPA1-GFP-RFP foram a fonte de Edu-macrófagos . nu camundongos transgênicos C57 /B6-GFP sem tumores eram a fonte para Naïve-macrófagos. Depois de os murganhos foram anestesiados como descrito acima, 6 ml de RPMI foi injectado no espaço intraperitoneal de cada rato utilizando uma seringa de 10 ml, e os ratos foram suavemente agitada durante 5 minutos. A seringa foi então reinserido e todo o meio RPMI foi removida e colocada numa placa de Petri de plástico. Os pratos foram então incubados a 37 ° C durante 4 horas. meio RPMI foi em seguida removido e cada placa foi lavada 10-15 vezes com 10 ml de PBS, ou até que todas as células vermelhas do sangue, fibroblastos, e outros restos celulares foram removidos. As placas foram visualizados sob um microscópio de fluorescência IX71 (Olympus, Tóquio, Japão), a fim de confirmar a presença de macrófagos que expressam GFP. Os macrófagos foram raspadas da placa de Petri, utilizando uma espátula de borracha, recolhido com uma lavagem de 10 ml de PBS, e centrifugou-se a 850 rpm durante 10 minutos. PBS foi então removido e macrófagos foram novamente suspensas em RPMI.

ensaio de proliferação utilizando a cultura 3D

Naïve- ou Edu-macrófagos foram co-cultivados com células cancerosas XPA1-GFP-RFP dual-cores, mas eles foram separados um do outro por Gelfoam (Pharmacia Upjohn Company, MI, EUA) (Fig. 2A). Quarenta e oito horas mais tarde, as imagens foram obtidas a partir da superfície de 200 microns de dimensão, a cada 1