Abstract

Background

heparan sulfato proteoglicanos (HSPGs) são elementos de controle em sinalização Wnt, que se ligam a ligandos extracelular de Wnt e regular a sua capacidade de interagir com os receptores de transdução de sinal na superfície da célula. Sulf-1 e Sulf-2 são novos sulfatases extracelulares que actuam sobre a glucosamina-6-sulfato interno (6S) modificações dentro HSPGs e assim modulam interacções HSPG com várias moléculas de sinalização, incluindo ligandos Wnt. Novas evidências indicam a importância da sinalização Wnt reativado em uma série de cânceres, incluindo o adenocarcinoma do pâncreas.

principais achados

Ambas as proteínas Sulf foram regulados positivamente em tumores de adenocarcinoma do pâncreas humanos e foram amplamente expresso em pancreático humano linhas celulares de adenocarcinoma. Expressão de sulfatases humanas extracelulares Sulf-1 e Sulf-2 aumentada a sinalização de Wnt num sistema reconstituído. Três das quatro linhas celulares de adenocarcinoma do pâncreas testados exibiram sinalização Wnt autócrina, em que os ligantes extracelulares Wnt foram necessários para iniciar a sinalização de Wnt jusante. A exposição destas células adenocarcinoma pancreático de uma forma cataliticamente inactiva de Sulf-2 ou mediada por siRNA silenciamento de endógena Sulf-2 inibiu o crescimento de células e sinalização de Wnt. Sulf-2 silenciamento em duas destas linhas resultou em acentuadamente reduzida tumorigênese em ratinhos imunocomprometidos.

Conclusões /Significado

Nós identificamos o Sulfs como potenciadores da sinalização Wnt autócrina em células de câncer de pâncreas e têm demonstraram a sua contribuição para o crescimento e tumorigenicidade destas células. Uma vez que os Sulfs são enzimas extracelulares, eles seriam alvos atraentes para terapia de câncer pancreático. Nossos resultados vão contra a visão prevalecente na literatura que os Sulfs são reguladores negativos da tumorigênese

Citation:. Nawroth R, van Zante A, Cervantes S, McManus M, Hebrok M, Rosen SD (2007) Extracelular sulfatases, Elementos do Wnt via de sinalização, Positively regulam o crescimento e de tumorigenicidade de células de câncer pancreático humano. PLoS ONE 2 (4): e392. doi: 10.1371 /journal.pone.0000392

Editor do Academic: Mikhail Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 18 Março, 2007; Aceito: 28 de março de 2007; Publicação: 25 de abril de 2007

Direitos de autor: © 2007 Nawroth et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A pesquisa foi apoiado por uma mama Susan Komen Cancer Foundation Grant PDF0402844 (RN e SDR), a pesquisa alemão Foundation Grant NA439 /1-1 (RN), Ministerio de Educación, Cultura y Deporte do Governo espanhol (SC) e do Instituto Nacional de Saúde Subsídios GM57411 (SDR), CA122025 (SDR), HL075602 (SDR) e CA112537 (MH). A preparação dos lentivírus foi subsidiado pela Facilidade Sandler Lentivírus Núcleo da UCSF. Os patrocinadores não tiveram nenhum papel no projeto e realização do estudo, na coleta, análise e interpretação dos dados, bem como na elaboração, revisão ou aprovação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.

Introdução

adenocarcinoma do pâncreas é a forma mais comum de cancro do pâncreas e uma das neoplasias mais mortais com uma taxa de sobrevida de 5 anos de 3% e uma sobrevida média de menos do que 6 meses [1]. Houve recente interesse no papel de vias de sinalização embrionárias em câncer. Evidências consideráveis ​​demonstrou que estas vias permanecer funcional num número limitado de células dentro do adulto e que a desregulação destas vias contribui para a formação e a persistência de tumores [2], [3]. A este respeito, a reativação de Notch, Hedgehog e Wnt vias têm atraído o interesse recente em cancros do tracto GI, incluindo adenocarcinoma do pâncreas [2], [4], [5].

A desregulação da sinalização Wnt no adenocarcinoma do pâncreas é o foco do presente estudo. Wnts compreendem uma grande família de proteínas segregadas, que regulam o crescimento celular, apoptose, motilidade e diferenciação durante o desenvolvimento embrionário [3]. Em resumo, a activação da via Wnt canónica é iniciado pela ligação de ligandos de receptores de sinal wnt de transdução na superfície da célula, o que leva à acumulação de não-fosforilado β-catenina no citoplasma. Após a sua translocação para o núcleo, β-catenina forma um complexo com os membros da família TCF /LEF de factores de transcrição, e activa genes-alvo [3].

sinalização Wnt foi implicado no cancro primeiro através da análise de mamaria glândula tumorigénese induzida pelo vírus do tumor mamário de ratinho (MMTV) [6]. Uma alta proporção dos tumores eram devido à ativação de expressão Wnt1 através da inserção do pró-vírus MMTV no

Wnt1

gene. Tumorigénese é pensado para ser baseado em uma via de Wnt transformadora autócrino em que a expressão do ligando de Wnt por células epiteliais mamárias fornece um estímulo de crescimento para as mesmas células. Recentemente sinalização Wnt autócrina foi demonstrada em câncer de mama, câncer e as linhas de células de mieloma ovarianos, [7], [8]. Este mecanismo, no qual os ligandos de Wnt extracelulares proporcionar um estímulo essencial para a proliferação celular, é distinta da que normalmente encontrado no cancro do cólon humano e várias outras formas de cancro, em que a activação constitutiva de sinalização Wnt é uma consequência de mutações em elementos citoplasmáticos jusante tais como

APC, CTNN1

(que codificam β-catenina) ou

AXIN2

[3].

Estas mutações características em Wnt jusante moléculas de sinalização são muito raros em adenocarcinoma do pâncreas [9 ]. No entanto, a activação aberrante de sinalização Wnt é uma característica significativa do adenocarcinoma pancreático humano, como revelado pela localização nuclear de β-catenina em uma fracção significativa (30-65%) dos tumores [9], [10]. Consistente com a evidência histoquímica, análise bioquímica demonstrou uma elevação acentuada do total β-catenina e a sua localização nuclear aumentada em dois terços dos adenocarcinomas pancreáticos [9]. Além disso, em estudos mecanicistas com linhas de células de adenocarcinoma pancreático, a inibição da sinalização de Wnt resultou em proliferação celular reduzida e sobrevivência in vitro [11].

Uma área de interesse actual são os elementos reguladores extracelulares na via de sinalização Wnt. Entre estes são secretadas antagonistas de Wnt, tais como proteínas relacionadas com o Frizzled (SFRP), factor inibidor de Wnt (WIF) e a família Dickkopf (DKK) [12]. Regulação negativa de qualquer um destes antagonistas de Wnt inicia a activação e contribui para várias formas de cancro [12]. Uma classe de proteínas extracelulares que regula positivamente a actividade de Wnt são proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPGs). Glypicans, por exemplo, são necessários para a sinalização de Wnt durante o desenvolvimento em Drosophila e vertebrados [13]. HSPGs são também necessários em exemplos de formação de Wnt-dependente do tumor [14], [15]. A miríade de funções de HSPGs no crescimento e diferenciação de células [16] são mediados através da sua capacidade para se ligar a um repertório diverso de factores de crescimento e morfogénios. A ligação depende do padrão de sulfatação de glucosamina (N-, 3-O, e posições 6-O) e ido urico (2-O-posição) no interior das cadeias de sulfato de heparano em anexo. [16]. 6-O-sulfatação (6S) de glucosamina é de particular importância na ligação de vários ligandos importantes para HPSGs, incluindo o Wnts [17] – [19]. Um mecanismo recentemente apreciado pela regulação da sinalização por estes ligandos é de “editar” pós-sintética do padrão de 6S HSPGs através da acção de uma classe de sulfatases extracelulares conhecido como o Sulfs [20].

QSulf-1 , o primeiro membro da família Sulf a ser descrito, foi descoberto numa análise do desenvolvimento muscular no embrião codorniz [20]. Esta foi seguida pela descrição dos seus ortólogos em ratos [21], do rato e humano [22], e a descoberta do homólogo estreitamente relacionado, Sulf-2 [22]. Os Sulfs são neutros de pH óptimas endosulfatases que removem 6-O-sulfato de glucosamina a partir de resíduos internos em subdomínios altamente sulfatados da heparina /HSPGs [18], [19], [22], [23]. Os estudos iniciais de QSulf-1 revelou um papel positivo na regulação da sinalização Wnt durante a especificação do músculo no embrião de codorna [20]. Esta actividade depende da capacidade de QSulf-1 para reduzir a interacção dos ligandos com Wnt HSPGs. Os autores propuseram um modelo de dois estados em que as cadeias do SH formar uma alta afinidade complexo HS-Wnt, que sequestra Wnt de interagir com seus receptores de transdução de sinal. A afinidade de Wnt para o HS está enfraquecido quando QSulf-1 modifica o padrão 6S das cadeias SH, permitindo a abertura da sinalização de Wnt [19].

promoção Sulf-dependente da sinalização de Wnt também foi observada em outras eventos de desenvolvimento [24]. Em prova in vitro sugere que os Sulfs pode promover a outras vias de sinalização, incluindo a angiogénese e BMP sinalização [23], [25]. Importante,

sulf

camundongos nulos mostram redução da massa corporal [26], [27]. Este fenótipo é consistente com papéis reguladores positivos para as Sulfs durante o desenvolvimento normal.

A descoberta de que a sinalização Wnt canônica é ativado em adenocarcinoma do pâncreas (veja acima) tem focado a nossa atenção sobre o possível envolvimento do Sulfs neste câncer . No presente estudo, nós demonstramos supra-regulação de ambas as proteínas em tumores Sulf adenocarcinoma pancreático. Usando linhas celulares de cancro adenocarcinoma pancreático humano, estabelecemos um papel para Sulf-2 na promoção da sinalização Wnt autócrina, o crescimento de células in vitro e tumorigenicidade. Esta contribuição positiva de um Sulf para o crescimento de tumores Wnt-dependentes está em forte contraste com vários relatos em que a expressão forçada de Sulfs antagoniza outras vias de sinalização (por exemplo, o FGF-2, e HGF) em células tumorais e inibe o crescimento das células [28] – [34].

resultados

Sulf-1 e Sulf-2 está regulada no cancro pancreático humano

Mineração de conjuntos de dados de microarrays de ADN públicas e um estudo quantitativo PCR estabelecem que

SULF1

transcrições são regulados positivamente no cancro pancreático humano (Tabela 1). Este último estudo concluiu que o nível médio de

SULF1

ARNm foi de 22,5 vezes superior no tecido de cancro (n = 31) do que no pâncreas normal (n = 19) [31].

In situ

expressão hibridação localizada do

SULF1

para estruturas tubulares, provavelmente representando carcinoma invasivo.

Para determinar se as proteínas Sulf foram expressas por adenocarcinoma do pâncreas em espécimes cirúrgicos , que coradas secções de sete casos arquivados com Sulf-1 e Sulf 2-anticorpos e um controlo de IgG (Figura 1 A e B). ductos interlobulares benignos nas mesmas secções de tecido como o carcinoma invasivo serviu como um controlo interno. Em 7/7 dos casos, as células epiteliais malignas mostraram geralmente de moderada a forte coloração para Sulf-1 (Figura 1B). Para Sulf-2, 4/7 casos mostraram forte coloração destas células, 2/7 dos casos tinha coloração moderada e 1 caso foi negativa. A maioria das condutas benignos revelaram nenhuma coloração ou apenas vestígios de coloração para Sulf-1 (≈54%) ou Sulf-2 (≈88%). coloração focal para Sulf-1 ou 2-Sulf foi visto numa minoria das condutas benignos. Difusa fraca coloração de fibroblastos para ambos Sulfs foi observada em algumas áreas do estroma, geralmente em associação com células inflamatórias. Não houve coloração com o controle IgG

A:. Cortes seriados representativos de adenocarcinoma do pâncreas foram coradas com Sulf-1, Sulf-2 e IgG de controlo. dutos benignos foram comparadas às áreas de carcinoma invasivo na mesma secção. B: tabulação quantitativa de Sulf imunohistoquímica resultados em casos de adenocarcinoma do pâncreas (0 = não, ou coloração traço, 1 = coloração moderada, 2 = coloração forte, ND = não determinado). C: O ARN foi isolado a partir de linhas celulares de adenocarcinoma de 24, o ADNc foi preparado e submetido a PCR com iniciadores para

SULF1

e

SULF2

e β-

ACTINA

como controlo de carregamento . D: imunoblots foram realizadas em lisados ​​de células e meio (CM) condicionada utilizando anticorpos contra Sulf-1 (painel superior) e Sulf-2 (meio e o painel inferior). Apenas proteína Sulf-2 foi detectada em CM.

Em seguida, determinou-se a expressão dos Sulfs em linhas de células de adenocarcinoma pancreático humano, utilizando RT-PCR para pesquisar um painel de 24 linhas celulares. Estes foram obtidos a partir de qualquer adenocarcinomas pancreáticos primários ou metastáticos [5].

SULF1

transcritos foram detectados por RT-PCR em 12/24 e

SULF2

transcritos em 21/24 dessas linhas (Figura 1C). Para examinar a expressão ao nível da proteína, nós investigamos quatro destas linhas celulares, três dos quais foram positivos para ambos

Sulf

transcritos (CFPAC-1, Hs766T, L3.6sl) e 1, que foi positivo apenas para

SULF2

(BxPC-3). Foi realizada em imunoblots de lisados ​​de detergente e meio condicionado (CM) derivadas a partir destas células (Figura 1D). Sulf-1 de proteína foi detectada em apenas uma linha de células (células Hs766T), ao passo que a proteína Sulf-2 estava presente em todos 4. Em lisados ​​de detergente, o peso molecular das espécies principais era de 130 kDa, o que corresponde a uma forma não processada para ambos proteínas [22]. proteína Sulf-2 foi lançado em CM por todas as linhas de células 4. Em contraste, Sulf-1 não foi detectado em Hs766T CM. Tal como observado anteriormente para várias linhas de células de carcinoma da mama [25], proteína Sulf-2 foi detectada em CM como um componente de 75 kDa processada.

Sulf-1 e 2-Sulf promover a sinalização Wnt

QSulf-1 tem sido mostrado para promover a activação de vias de sinalização Wnt em resposta a ligandos Wnt exógenos [20]. Nós escolhemos estudar os efeitos da Sulfs humana sobre a sinalização de Wnt num sistema reconstituído semelhante [20]. Nós overexpressed o Sulfs em HEK 293T e co-cultivadas estas células com fibroblastos que expressam quer Wnt1 ou Wnt4. actividade de sinalização Wnt foi medida pelo sistema de TCF-luciferase repórter (TOPflash /FOPflash), um método padrão para a medição da activação da transcrição dependente de β-catenina [20]. A expressão de cada Sulf aumentada a sinalização de Wnt na resposta a qualquer ligando de Wnt, enquanto que as células HEK 293T transfectadas por simulação não responder (figura complementar, Fig. S1). Assim, tanto HSulfs, como QSulf-1 [20], pode promover a sinalização de Wnt.

A expressão de SFRP-2 inibe a sinalização Wnt em linhas celulares de adenocarcinoma do pâncreas

trabalhos anteriores estabeleceu sinalização Wnt ativa dentro de uma série de linhas celulares de adenocarcinoma do pâncreas, incluindo as 4 linhas acima [M. Pasca di Magliano e M. Hebrok, observações não publicadas]. Para determinar se a sinalização de Wnt nestas linhas 4 foi autócrino na natureza, foi empregado frizzled segregada relacionada com a proteína-2 (SFRP-2) como um antagonista de Wnt extracelular [35], [36]. Nós transfectadas transitoriamente as linhas de células com um ADNc para SFRP-2 ou com o vector vazio (Ctrl) e actividade de Wnt medido pelo ensaio de repórter de luciferase-TCF. SFRP-2 expressão diminuída sinalização Wnt ≈60% em 3 das linhas, mas não teve nenhum efeito sobre células CFPAC-1 (Figura 2). Estes resultados estabelecem que a BxPC-3, células Hs766T e L3.6sl possuir uma via de sinalização Wnt autócrino.

As linhas de células de adenocarcinoma pancreático indicados foram transfectadas com ADNc SFRP-2 (SFRP-2) ou controlo de vector ( ctrl) e do sistema repórter TOP /FOPflash. atividade de Wnt foi determinada pela actividade da luciferase. Os valores mostrados são as médias ± DP para 3 determinações independentes. As diferenças entre SFRP e controle foram significativas no teste t de Student, com valores de p . 0.002 para BxPC-3, Hs766T e L3.6sl

proteína sulfatase humana cataliticamente inactivo inibe o crescimento de sinalização e célula Wnt

a seguir, perguntou se os Sulfs endógenas nestas linhas celulares estavam diretamente envolvidos na sinalização Wnt. Quando a sobre-expresso Sulfs, não houve qualquer efeito sobre a sinalização de Wnt (dados não mostrados). Uma vez que todas estas células expressaram níveis significativos da Sulfs, nós próxima pergunta se pode haver efeitos inibitórios se expressa formas cataliticamente inactivos destas proteínas. Nós mostramos anteriormente que a mutação de duas cisteínas no domínio da sulfatase de cada Sulf eliminou a actividade de sulfatase [22]. Nós transfectadas um ADNc que codifica inactivo Sulf-1 (S1ΔCC), Sulf-2 (S2ΔCC) ou vector vazio (Ctrl) em cada uma das linhas celulares e a actividade de Wnt 4 novamente medido. Como mostrado na Figura 3A, a expressão de ambos os Sulf inactivo inibiu a actividade de Wnt ≈50% em todos, mas células CFPAC-1. As linhas 3 responderam foram os mesmos que exibiu autócrina via de sinalização Wnt (Figura 2). O facto de ambos os inactivos Sulf exerceu efeitos equivalentes nestas linhas celulares de cancro pancreático sugere redundância funcional das duas enzimas

A:. Quatro linhas de células de adenocarcinoma pancreático, tal como indicado foram transientemente transfectadas com ADNc que codificam para qualquer uma forma cataliticamente inactiva de Sulf-1 ( “S1ΔCC”) ou uma forma cataliticamente inactiva de Sulf-2 ( “S2ΔCC”) ou com o vector vazio ( “controlo”). Os mutantes foram feitos por substituição de dois resíduos cisteína adjacentes com alaninas. sinalização Wnt foi determinado utilizando o sistema repórter para cima /FOPflash. Os valores apresentados são os meios ± SD de para 4 determinações e as diferenças entre células mutantes e controle independentes foram estatisticamente significativa com valores de p 0,02 para BxPC-3, células Hs766T e L3.6sl (teste t de Student). B: As linhas de células de adenocarcinoma pancreático foram cultivadas com meio condicionado derivado a partir de cada um dos seguintes: as células HEK-293 parentais ( “controlo”), culas 293T HEK expressando de modo estável do tipo-selvagem Sulf-2 (denotado “Sulf-2”), ou expressando uma forma cataliticamente inactiva de Sulf-2 ( “S2ΔCC”). Tipo selvagem Sulf-2 de proteínas e o mutante estava presente no meio condicionado de células que produzem os dois a níveis sensivelmente equivalentes. sinalização Wnt foi determinada como antes, com o ensaio de repórter de luciferase-TCF. Os valores mostrados são as médias ± DP para 3 determinações independentes e as diferenças entre Sulf-2 mutante e de controlo foram estatisticamente significativas para BxPC-3 (p = 0,002), Hs766T (p = 0,01) e L3.6sl (p = 9 × 10

-6) (teste t de Student). C: As linhas de células de adenocarcinoma pancreático foram cultivadas em um sistema Transwell sobre camadas alimentadoras que consistem em: meio sozinho ( “meio”); células HEK 293T parentais ( “HEK 293T”); células HEK 293T que produzem de forma estável de tipo selvagem Sulf-2 ( “Sulf-2”); ou uma forma cataliticamente inactiva de Sulf-2 ( “S2ΔCC”). O crescimento das células foi monitorizada por contagem de hemacitómetro durante 4 dias. Os valores apresentados são as médias ± DP para 3 determinações independentes.

A seguir, perguntou se a adição exógena de proteína Sulf cataliticamente inativa também iria interferir com a sinalização de Wnt. Como fonte de proteína Sulf-2, utilizou-se células HEK 293T que foram estavelmente transfectadas quer com o tipo selvagem humana Sulf-2 (S2) ou cataliticamente inactivado Sulf-2 (S2ΔCC) [25]. Nós também utilizamos as células HEK 293T parentais (293T), como controles. Os transfectantes estáveis ​​secretado os Sulfs activos e inactivos em níveis comparáveis ​​(dados não mostrados). Incubámos as células de adenocarcinoma do pâncreas para 16 horas com CM a partir dessas células ou com meio de controlo e de sinalização de Wnt comparação. A exposição à proteína inactiva Sulf-2 (S2ΔCC) inibiu a sinalização de Wnt nas mesmas 3 linhas de células que respondiam a transfecção com o cDNA S2ΔCC (Figura 3B), enquanto que as células CFPAC não mostrou um efeito. A adição do meio, condicionado, ativa a proteína Sulf-2, não promoveu Wnt sinalização em relação ao nível basal.

Em seguida, criar um sistema de co-cultura para examinar os efeitos da proteína recombinante Sulf sobre o crescimento celular das mesmas linhas celulares. As células de cancro pancreático foram semeadas a baixa densidade em filtros Transwell acima camadas alimentadoras, que consistia de células HEK 293T HEK 293T parentais ou expressando activo ou inactivo Sulf-2. As contagens de células foram monitorados durante os próximos dias. Os resultados paralelo o efeito supressor observou-se sobre a sinalização de Wnt. Assim, em comparação com o meio de controlo, S2ΔCC CM inibiu o crescimento de BxPC-3, Hs766T e células L3.6sl (Figura 3C), mas não tiveram efeito em células CFPAC-1. Em contraste, activa Sulf-2 não promover ou inibir o crescimento de células de qualquer uma das linhas.

Lentivirus shRNA silenciamento de Sulf-2 em células de adenocarcinoma pancreático reduz a sinalização de Wnt, a proliferação celular e sobrevivência celular

para investigar ainda mais o papel da Sulf-2 na via de sinalização Wnt e crescimento celular, utilizou-se metodologia shRNA para silenciar a expressão de Sulf-2 nestas células. Nós empregamos três shRNA constrói: duas construções independentes visando Sulf-2 (1413 e 1143) e um controle (ctrl). Estas construções foram usadas em diferentes origens vector em que a presença ou ausência de GFP permitiu-nos para monitorar a expressão de shRNAs (ver Materiais e Métodos). As células transduzidas foram classificadas para expressão da GFP e subsequentemente analisadas para a expressão Sulf-2. As construções de 1143 e 1413 (VPE-1143, VLP-1413) produziu 80% e 90% de reduções de proteína Sulf-2, respectivamente, em células L3.6sl, em relação ao controlo shRNA (PLV-ctrl) (Figura 4A). Não houve redução da proteína nas células tratadas PLV-ctrl em relação a células não tratadas (dados não mostrados). A construção PLV-1413 produziu uma redução semelhante nas células BxPC3 em duas diferentes origens vetoriais (PLV e Psico).

Inactivação de Wnt sinalização resulta em diminuição dos níveis de activado β-catenina (N-terminal não fosforilada) no núcleo [3]. Estamos, portanto, isolado a fração nuclear de Sulf-2 células silenciadas e controle (BxPC-3 e L3.6sl) e analisados ​​os níveis de activado β-catenina. Houve uma diminuição ≈80% de β-catenina em células de Sulf-2 silenciados BxPC-3, e uma redução ≈30% em células L3.6sl (Figura 4B). Nós também quantificada actividade Wnt usando o sistema repórter de luciferase-TCF. Consistente com o resultado β-catenina, este ensaio confirma que a sinalização de Wnt foi substancialmente inibida nas células Sulf-2 silenciados em relação a células de controlo tratado tanto para células L3.6sl (Figura 4C) BxPC-3 e. Mais uma vez, as células BxPC-3 mostraram inibição mais forte (52% com VLP-1413) do que as células L3.6sl (inibição de 35% com o PLV-1413 ou PLV-1143)

A:. As células foram transduzidas com o condicional (psico) ou não condicional lentivírus (pLVTHM) codificação quer Sulf-2 específico (1413, 1143) ou Control (Ctrl) shRNAs. As células foram lisadas e quantidades iguais de proteínas foram submetidas a SDS-PAGE. No caso de o Psico, as células foram lisadas 10 dias após a transfecção CRE. Sulf-2 Os níveis de proteína foram determinadas por realização de imunoblots e os mesmos lisados ​​foram sondadas com anticorpo anti actina como um controlo de carga. B: 100 ug de proteína total da fracção nuclear das células foram aplicadas a SDS-PAGE e quantidades de beta-catenina activa foram detectadas utilizando um anticorpo contra o não-beta-catenina fosforilada. Como controlo de carga, os mesmos lisados ​​foram analisados ​​com um anticorpo anti histona. C: células transduzidas Parental, PLV-ctrl, PLV-1413 e PLV-1143 foram transfectadas com o sistema repórter FOP /TOPflash ea atividade luciferase foi detectado 48 horas mais tarde. Os valores apresentados são as médias ± DP para 3 determinações e diferenças entre ctrl e Sulf-2 células silenciadas independentes foram estatisticamente significativas (BxPC-3, p = 0,002 (L3.6sl, p = 0,013 e 0,017 para os dois vetores de silenciamento) .

determinou-se os efeitos de silenciamento Sulf-2 sobre a proliferação celular através da medição da incorporação de 5-bromodesoxiuridina (BrdU) para dentro das células. Houve uma redução de 25-30% de células que sofrem S- fase em L3.6sl, BxPC3, e células Hs766T, e somente uma redução de 5% em células CFPAC-1 (Figura 5A). Além disso, foi realizada ensaios de apoptose, medindo a coloração de anexina V. Os Sulf-2 silenciados células BxPC-3 mostrou um aumento da apoptose de 33%, ao passo que as células L3.6sl mostraram aumentos de 65% e 79% com dois shRNAs independente (Figura 5B)

a:. as células indicadas foram transduzidas com o controlo (Ctrl-PLV ) ou Sulf-2 shRNA (VPE-1413, PLV-1143). As células foram então incubadas com BrdU durante uma hora e a incorporação de BrdU foi detectado por análise de citometria de fluxo. Os valores apresentados são para 2 experimentos independentes a média +/- SD. As diferenças na absorção de BrdU entre Ctrl e células Sulf-2 silenciados foram estatisticamente significativas para BxPC-3 (p 0,005), L3.6sl (p 0,007) e Hs766T (p 0,001). B: células pancreáticas BxPC-3 e L3.6sl foram transduzidas com o controlo (Ctrl-PLV) ou Sulf-2 shRNA (VPE-1413, PLV-1143) foram colhidas e incubadas com anexina V conjugada com PE Subsequentemente as células foram submetidas a A análise de citometria de fluxo. As diferenças entre entre ctrl e células Sulf-2 silenciados foram estatisticamente significativas com valores de p de 0,0001 para BxPC-3 e p 0,004 para L3.6sl. C e D: células L3.6sl foram transduzidas com qualquer PLV-1413, PLV-1143 ou PLV-ctrl e mistos populações de siRNA e células que expressam não-siRNA foram co-cultivados. Coeficientes de transduzidas para células não transduzidas foram medidas ao longo do tempo por expressão da GFP. células BxPC-3 foram transduzidas com qualquer Psico-ctrl ou Psico-1413 e transitoriamente transfectadas com cre-recombinase para activar a expressão do shRNA. As populações mistas de células resultantes com activado (GFP) e (GFP +) inactivado expressão shRNA foram co-cultivadas. Coeficientes de GFP + células de GFP, utilizando citometria de fluxo foram analisados ​​como uma função do tempo. A expressão de GFP não tem qualquer efeito sobre o crescimento de células na população de controlo.

Para examinar o crescimento de células ao longo do tempo em células Sulf-2 silenciados, comparamos o crescimento de células em que Sulf-2 foi silenciada com não-transduzidas células parentais em uma cultura mista. Em co-culturas paralelas, foi comparado o crescimento das células de controlo transduzidas de shRNA com células não transduzidas parentais. Para ambos os Sulf-2 shRNAs específicos, as células não-L3.6sl silenciados parentais ultrapassou as células progressivamente silenciados com o tempo em cultura. Foram observados resultados semelhantes com as células BxPC-3 (Figura 5D). Em contraste, não houve alteração na proporção das células transduzidas de controlo para células parentais ao longo do tempo (Figura 5C).

silenciamento de Sulf-2 inibe o crescimento do tumor in vivo

Para determinar os efeitos de silenciamento Sulf-2 sobre a tumorigenicidade de células L3.6sl e BxPC-3

in vivo

, comparou-se o crescimento de tumores que se formaram em ratinhos imunocomprometidos, com ou sem o silenciamento de Sulf-2. ratos pelados (CD-1) foram injectados por via subcutânea com células transduzidas quer PLV-ctrl ou PLV-1413 de 1 semana após a transdução. O tamanho do tumor foi seguido com o tempo por palpação externa. No final da experiência, os animais foram sacrificados e os pesos dos tumores foram medidos. Como mostrado na Figura 6, os tumores derivados de células de 2-Sulf silenciados (ou L3.6sl BxPC-3) cresceram a uma taxa significativamente mais lenta do que os derivados a partir das células de controlo (Figura 6B). Os tumores colhidos de células silenciadas foram correspondentemente reduzida no peso sem sobreposição dos dois grupos para qualquer uma das linhas de células (Figura 6C).

L3.6sl e BxPC-3 células foram transduzidas com qualquer PLV-1413 ou PLV -ctrl e injectada subcutaneamente em ratinhos nus a 5 × 10

6 por site. A: L3.6sl tumores derivados colhidas a partir de ratinhos depois de 17 dias de crescimento B: O tamanho do tumor foi monitorizado ao longo do tempo e os valores representam a média (+/- SEM) de 4 ratinhos por células L3.6sl e 6 (PLV-ctrl) ou 5 (PLV-1413) ratos para células BxPC-3. C: Os animais foram sacrificados e o peso de tumor foi examinado. A diferença de pesos de tumor entre os dois grupos foi significativa para as células L3.6sl com um valor p de 0,01 e para BxPC de 3 células com um valor de p 0,029 (teste t de Student).

Discussão

a visão prevalecente na literatura tem sido que os Sulfs são reguladores negativos do crescimento de células tumorais. Um certo número de relatórios demonstrou que a sobre-expressão de Sulf-1 [28] – [34] ou de Sulf-2 do factor de crescimento [32] no tumor linhas celulares inibidas sinalização em resposta a vários factores, incluindo FGF-2, HB-EGF, e HGF. Além disso, a tumorigenicidade de células em ratinhos imunocomprometidos Sulf que sobre-expressam foi diminuída [31], [32], [34]. Os efeitos negativos da Sulfs de FGF-2 de sinalização são consistentes com o requisito para 6S conhecido na HSPGs no FGF-2 sinalização complexo [37]. Estes achados linha celular levaram à sugestão de que a sub-regulação de Sulfs poderia fornecer células tumorais com uma vantagem de crescimento em certas configurações. Este modelo pode ter validade para o subconjunto significativo (dois terços) dos casos de cancro do ovário [28] e o subconjunto menor (29%) dos casos de carcinoma hepatocelular [30] em que

SULF1

expressão é regulada negativamente em relação ao que no tecido normal. No entanto, o modelo é problemático para os subconjuntos consideráveis ​​de vários tipos de câncer que mostram aumentos no

expressão SULF

. Assim, por exemplo,

SULF1

é regulada positivamente em subgrupos importantes de cancro da mama [38], o cancro pancreático [31], [39] (Tabela 1) adenocarcinoma pulmonar [40] e o carcinoma hepatocelular [30], enquanto

SULF2

é regulada no mieloma múltiplo [32], câncer de mama e câncer do SNC [41].

Para entender o significado da expressão SULF

upregulated

em um câncer, nós escolheu para se concentrar em adenocarcinomas pancreáticos por causa da clara evidência associando esse tipo de câncer com a sinalização Wnt canônica, uma via de sinalização conhecido por ser regulada positivamente pelos Sulfs durante o desenvolvimento (ver acima). Consistente com os dados de expressão de transcrição (Tabela 1), observou-se que ambos os Sulfs foram fortemente expressa ao nível da proteína por células epiteliais malignas no adenocarcinoma do pâncreas. Para facilitar a investigação destas enzimas em câncer pancreático, examinamos

expressão SULF

em um grande painel de linhas celulares de adenocarcinoma do pâncreas e encontrou expressão generalizada, especialmente de

SULF2

. Nós escolhemos 4 linhas para o estudo, todos os quais proteína expressa Sulf-2 e um dos quais expressas tanto Sulfs. Estudos anteriores mostraram que a proliferação e a sobrevivência de 3 destes (BxPC-3, Hs766T e L3.6sl) dependem de Wnt sinalização activada [M. Pasca di Magliano e M. Hebrok, observações não publicadas]. Mostrámos que a sinalização de Wnt foi marcadamente inibida por sobre-expressam SFRP-2 recombinante nestas linhas celulares. Além disso, a sobre-expressão de cataliticamente inactivo Sulf-2 nas mesmas linhas resultou numa inibição acentuada da actividade de Wnt, e a exposição das células a inactiva proteína Sulf-2 durante a cultura inibida tanto a sinalização Wnt e crescimento. Estes resultados são consistentes com Wnt-ligando crescimento dependente destas células ( “sinalização de Wnt autócrino”), que é modulada pela Sulfs extracelular. É plausível que a linha de células CFPAC-1, que foi refractário a todos estes tratamentos, transporta uma mutação activadora em elementos a jusante da via de sinalização Wnt que iria contornar a necessidade de ligandos extracelulares e Wnt o Sulfs. Deve notar-se que os Sulfs representam um exemplo adicional de um factor extracelular, que modula a sinalização de Wnt.