Abstract

Para compreender os efeitos da interação entre Mycoplasma e células na acolher a função celular, é importante para elucidar as influências da infecção de células por Mycoplasma em enzimas nucleares, tais como o DNA topoisomerase de tipo I (Topo I). Topo humana I participa de processos de transação de DNA e é alvo de drogas anti-câncer, as camptotecinas (CPT). Aqui investigámos o mecanismo pelo qual a infecção de células tumorais humanas com

Mycoplasma fermentans

afectam a actividade e a expressão do Topo celular I, e a eficácia anti-cancro da CPT. células cancerosas humanas foram infectadas ou tratadas com ultra-sons ao vivo ou

M. fermentans.Tais

e a atividade e expressão de Topo I foi determinada.

M. fermentans

significativamente reduzido (em 80%) a actividade Topo I nas células de tumor infectadas /tratados sem afectar o nível de proteína Topo I. Nós demonstramos que esta redução na actividade da enzima resultou a partir de ADP-ribosilação da proteína Topo I por polimerase poli-ADP-ribose (PARP-1). Além disso, a vantagem foi activado como um resultado da indução da via de transdução de sinal MAPK por

m. fermentans.Tais

. Uma vez que a PARP-1 foi mostrado para ser activado por Perk, concluiu-se que

m. fermentans

modificadas a actividade de I Topo celular por activação de PARP-I através da indução da via de transdução de sinal MAPK. Além disso, a infecção de células tumorais com

m. fermentans

diminuiu o efeito inibidor da CPT. Os resultados deste estudo sugerem que a modificação da actividade Topo I

m. fermentans

podem alterar a expressão do gene celular e a resposta das células tumorais para inibidores de topo I, influenciar a capacidade anti-cancro de antagonistas de topo I

citação:. Afriat R, S Horowitz, Priel E (2013)

Mycoplasma fermentans.Tais

inibe a atividade de Cellular DNA topoisomerase I pela ativação de PARP1 e altera a eficácia do seu Anti-Cancro do inibidor. PLoS ONE 8 (8): e72377. doi: 10.1371 /journal.pone.0072377

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de abril de 2013; Aceito: 09 de julho de 2013; Publicação: 27 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Afriat et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecida pelo fundo de pesquisa de sementes, da Universidade Ben-Gurion. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Micoplasmas, que pertencem à classe Mollicutes, são menores as eubactérias auto-replicantes, desprovidas de uma parede celular e rodeado por uma única membrana plasmática. O seu genoma de tamanho pequeno (variando 580-1380 kpb) resulta em capacidades metabólicas limitados e parasitismo [1], [2]. Os micoplasmas pode ser encontrado como parasitas em uma ampla gama de hospedeiros, incluindo os seres humanos, animais, insectos, plantas e células crescidas em cultura de tecidos.

Nos seres humanos, algumas espécies de micoplasmas são encontrados como comensais habitantes, enquanto que a outra foi mostrado para ser associada com doenças infecciosas e de patologias pós-infecção [3], [4].

a maioria das espécies de Mycoplasma conhecidos são encontrados como parasitas da superfície da membrana, e, recentemente, alguns foram mostrados para entrar nas células e tornou residentes intracelulares [5].

Mycoplasma pode causar infecções crónicas devido a mecanismos sofisticados para a evasão da vigilância imunológica (ou seja, mimetismo molecular, um único tipo de variação antigênica), up-regulação ou down-regulação da secreção de citocina, expressão de moléculas de adesão, fatores de transcrição expressão, MAP quinases atividade, vias apoptóticas, e mais [2], [3].

recentemente, muitos relatórios têm apoiado fortemente a capacidade de Mycoplasma de provocar ou promover a transformação oncogénica [6 ] -. [9] e a busca pela ligação entre Mycoplasma e câncer está actualmente a ser exploradas [10]

as lipoproteínas (LPMf) de

Mycoplasma fermentans.Tais

, um patógeno humano, foi exaustivamente investigado durante a última década. LPMf foi mostrado para alterar as funções das células do sistema imunitário através da indução de expressão de oncogenes [1], que afectam diversos factores que participam em proteínas de transdução de sinal [11] – [13], a transcrição [14], e o processo apoptótico [11], [15], [16].

M. fermentans

foi mostrado para inibir o processo de apoptose induzida pelo factor de necrose tumoral α (TNFa) [17], [18]. Todos estes levou à hipótese de que a infecção de células tumorais por Mycoplasma podem afectar a actividade e a expressão de enzimas nucleares essenciais, tais como as topoisomerases, que são os alvos de várias drogas anti-cancerosas e, portanto, interferir com a eficácia anti-cancro destas drogas. As topoisomerases de ADN são uma família de enzimas nucleares essenciais que são responsáveis ​​por controlar o estado topológico das moléculas de ADN. Eles participam na maioria das operações de ADN, tais como replicação, transcrição, recombinação e remodelação da cromatina [19] – [21]. topoisomerases de ADN são classificados como tipo I (cliva uma cadeia de ADN) ou tipo II (cliva duas fitas de DNA). Ambos os tipos de enzimas são ainda classificados em subgrupos de acordo com as características estruturais e funcionais. Os membros de cada família de enzimas são distintos, em sequência, estrutura e funções [22].

A actividade catalítica das topoisomerases de ADN envolve a formação de pontes covalentes transitórias de complexos de DNA-enzima. Um grupo tirosil no sítio activo da enzima ataca uma ligação fosfodiéster no esqueleto do ADN e permanece ligado de forma covalente a um dos lados da ruptura, deixando um grupo hidroxilo livre oposta (OH) final que permite que o passo de re-ligação, após a topologia do ADN é resolvido, por um segundo ataque nucleofílico da ligação fosfotirosina-enzima ADN covalente, libertando a enzima para o próximo ciclo catalítico. O envolvimento destas enzimas nos processos celulares essenciais etiquetado topoisomerases como alvos importantes para tratamentos anti-cancro e para o desenvolvimento de potentes mais eficazes, as drogas anti-cancro, [22], [23]. A citotoxicidade dos inibidores de topoisomerases, tais como camptotecina (CPT) e os seus derivados TPT e CPT-11 (que são aprovados para utilização clínica), provém da sua capacidade para estabilizar o complexo clivável de Topo-DNA, que introduz quebras dos filamentos simples e duplos em o ADN [21], [24], [25]. a actividade da topoisomerase é influenciada por várias modificações pós-tradução, entre eles fosforilação, poli-ADP-ribosilação, e ubiquitinação. Um trabalho recente feito no nosso laboratório mostraram que o O-GlcNAcylation do Topo IB, o que afecta a sua actividade [26].

A fosforilação da topoisomerase I de ADN por caseína-quinase II (CK II) e proteína cinase C (PKC) sobre-regular a actividade de relaxamento do ADN da enzima, enquanto que a desfosforilação pela fosfatase alcalina inibiu esta actividade. Além disso, de ribosilação de poli ADP-ribose-polimerase de poli-ADP (PARP-1) da proteína enzima foi encontrada para regular negativamente a sua actividade [20], [27]. A PARP-1 é conhecida por ser activada por quebras no ADN; No entanto, recentemente, foi relatado que a PARP-1 pode ser activado por ERK2 fosforilado na ausência de condições de stress ou dano de ADN [28]. Em estudos recentes de Mycoplasma foi demonstrado ser capaz de activar vários MAPK, tais como SAPK /JNK, p38, NF-kB, AP-1 e ERK 1/2 em resposta às lipoproteínas de membrana derivada de Mycoplasma [11], [29] – [31]. Assim, é importante investigar a possibilidade de que o celular Topo I e a eficácia da CPT como agentes anti-câncer pode ser afetada pela infecção por Mycoplasma.

Materiais e Métodos

Células

linhas celulares de cancro da mama humano -MCF7 (American Type Culture Collection, HTB-22) e glioblastoma humano U251 cells- (HTB-17) gentilmente recebidos de Porgador A, Universidade Ben-Gurion. As células foram cultivadas como monocamadas em meio DMEM e meio RPMI 1640 (Biological Industries, Beith Haemek, Israel), respectivamente, suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 50 IU de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina e L-glutamina (0,29 μγ /ml ). As linhas de células foram cultivadas numa incubadora humidificada suplementada com 5% de CO

2 a 37 ° C.

enzimas, anticorpos, e compostos

As soluções de reserva de camptotecina (Sigma, Israel) 20 mM (dissolvido em DMSO a 100%) foram armazenadas em alíquotas a -70 ° C e diluído em DMSO, antes de serem adicionados à mistura de reacção ou para o meio de cultura celular. DNA de plasmídeo super-enrolado pUC19 foi adquirido à MBI Fermentas (Hanover, MD, EUA). PD98059 e 3-aminobenzamida (3AB) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel)

O anti-soro primário foi o seguinte:. Monoclonal de murganho anti-actina-β anticorpo (MP Biomedicals, LLC); policlonal de cabra IgG (C-15) anti-topo I, IgG monoclonal de ratinho antiphospho-ERK (E-4), e anticorpo policlonal de coelho anti-IgG de ERK (C-16) (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, EUA); anticorpos monoclonais de rato anti-poli-ADP ribose, (Serotec, Oxford, Reino Unido); e de cabra anti-ratinho e anti-coelho IgG (segundos anticorpos Biolabs Inc., Ipswich, MA, EUA). Para os ensaios de imunoprecipitação, foi utilizado anti-Topo I anticorpo derivado de soro esclerodermia paciente (TopoGene, Florida, EUA).

reagentes de quimioluminescência aumentada (ECL) foram adquiridos de Biological Industries (Beit Haemek, Israel).

Crescimento Mycoplasma

M. fermentans estirpe

K7 foi cultivada em caldo SP4 a 37 ° C e 5% de CO

2 até fase log. Alíquotas de um ml contendo 2 × 10

8 unidades formadoras de colónias (UFC) foram mantidas congeladas a -70 ° C até serem usadas. Para cada experiência, uma alíquota foi descongelado, cultivada em caldo SP4 a uma diluição de 1/10, durante 24 h (37 ° C, 5% de CO

2), seguido de uma diluição adicional de 1/50 até uma fase log foi observado (após aprox. 24 horas). A quantidade exata de

M. fermentans.Tais

foi determinado pela contagem de UFC, como descrito anteriormente [32], [33].

Protein Mycoplasmal Extrato Preparação

M. fermentans.Tais

foi cultivada como acima; a cultura de 500 ml foi sedimentado (13.000 x g, 30 min a 4 ° C) e lavou-se duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). O sedimento foi, em seguida, re-suspensas em PBS. foi determinada CFU /ml, e o sedimento ressuspenso foi armazenado a -70 ° C para outras experiências. pelotas congelados de

M. fermentans

foram descongeladas e sonicada a 4 ° C durante 4 x 30 segundos a um poder de 80% (50% de ciclo de trabalho; Heat Systems Ultrasonics, Inc.), na presença do inibidor de protease fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF; 0,001 M). Estas condições de ultra-sons resultou numa preparação de micoplasma não-vivo (nenhum crescimento foi observado em procedimentos de cultura utilizadas). A concentração de proteína do sonicado

m. fermentans

foi determinada pelo kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Richmond, CA); 1 × 10

8 UFC correspondeu a 10 mg mycoplasmal proteína.

Tratamento de linhas de células malignas com o Live

M.

fermentans.Tais

ou

M. fermentans

total

Proteína células

MCF7 e U251, pré-lavado uma vez com PBS (1200 rpm, 5 min a 4 ° C) e re-suspensas num novo meio de cultura a uma concentração de 2 x 10

5 células /ml, foram cultivadas em placas de 96 poços estéreis (Corning Inc., Corning, NY, EUA) a uma concentração final de 4 × 10

4/200 ul /poço. Vive

M. fermentans

em fase log, pré-lavada uma vez em PBS (13000 x g, 30 min a 4 ° C), e re-suspensos em meio RPMI 1640 contendo 10% de FCS inactivado, 1% de penicilina e 1% de glutamina, foram adicionados para as culturas de células a MOI 1000:1 (4 × 10

7 UFC /poço). As co-culturas foram incubadas durante cinco horas a 37 ° C, 5% de CO

2. Para experiências com

M. fermentans

proteína total, uma concentração de 20 ug /ml (correspondendo a 2 × 10

8 CFU) foi adicionado às células de tumor examinados (2 × 10

5 células /ml) durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO

2.

DNA Amplification de

M. fermentans

por transcrição reversa-PCR (RT-PCR), utilizando uma sequência de nucleótidos dentro da Inserção Sequência elemento semelhante a

O ARN total foi extraído das células infectadas MCF7 e U251 utilizando Reagente TRI (T9424; Sigma- Aldrich, Rehovot, Israel), seguida de transcrição reversa utilizando 1 ug de ARN total a partir das células examinadas com oligo-dT iniciador, utilizando RevertAid Kit (K1621; Fermentas, Vilnius). Vários cDNA isolado a partir de

M. fermentans.Tais

células infectados para intervalos diferentes (1,5, 3, 6, 12 e 24 horas) foram amplificados usando REDTaq Ready Mix (R2523; Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel). Sequências do par iniciador oligonucleotídico sintético (RWO04 e RWO05) utilizados para amplificação de DNA específico de

M. fermentans.Tais Comprar e suas posições na inserção Sequence-Like Elemento (IS-como elemento) foram previamente descritos [34]. As sequências dos iniciadores e tamanhos dos produtos PCR foram as seguintes: RW004 Primer (24 nt): 5’GGA CTA TTG TCT AAA CAA TTT CCC e RW005 Primer (24 nt): 5’GGT TAT TCG TCA TCT AAA TCG CCT. O tamanho da banda de DNA de diagnóstico é de 206 pb. O perfil de ciclos térmicos de amplificação constituído por 40 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos (240 segundos no primeiro ciclo), 62 ° C durante 60 segundos, e 72 ° C durante 60 segundos (um aumento de 10 minutos para o ciclo final). Os produtos de PCR foram visualizados num gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio.

Preparação Proteína nuclear Extractos

Nuclear extrai para ensaios de topoisomerase e análise de mancha de Western das células de MCF7 e U251 foram preparados como descrito anteriormente [27], [35] – [40] e uma mistura de inibidores de protease (concentrações finais: 2 ug /ml de aprotinina, 2? g /ml de leupeptina, 1 ug /mL de pepstatina a, 2 ug /mL de antipaina, 100 ug /mL de PMSF) foi adicionado aos tampões de extracção. A concentração total de proteína foi determinada utilizando o kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Lab, CA, EUA).

Determinação do Nível de Topo I proteína por análise por Western blot

Quantidades iguais de proteínas nucleares derivados de Mycoplasma tratadas ou células MCF7 e U251 não tratadas, foram analisados ​​por análise de Western blot utilizando um anti Topo-I anticorpo (Santa Cruz Biotechnology Inc.) ou anti-actina β anticorpos (MP Biomedicals, LLC) como previamente descrito [36], [39], [41]. Os imunocomplexos foram detectados por quimioluminescência aumentada (ECL).

Topo I Ensaio

Topo I ensaio foi realizado como descrito anteriormente [26], [37]. O aumento das concentrações de proteínas nucleares foram adicionados a uma mistura de reacção Topo I contendo, num volume final de 25 ul: Tris-HCl 20 (pH 8,1), ditiotreitol a 1 mM, KCl 20 mM, MγCl 10 mM

2, 1 ácido mM etilenodiaminotetra-acético (EDTA), 30 ug /mL de albumina de soro de bovino, e 250 ng de pUC19 DNA do plasmídeo super-enrolado (MBI; Fermentas, Hanover, MD). Após a incubação a 37 ° C durante 30 min, a reacção foi terminada por adição de 5 uL de tampão de paragem (concentração final: 1% de sulfato de dodecilo e sódio, 15% de glicerol, 0,5% de azul de bromofenol, e EDTA 50 mM, pH 8). Os produtos da reacção foram analisados ​​por electroforese num gel de agarose a 1% utilizando /borato de tampão Tris /EDTA (Tris-HCl a 89, ácido bórico 89 mM, e EDTA 62 mM) a 1 V /cm, coradas por brometo de etídio (1 ug /mL) e fotografada utilizando uma lâmpada de UV de comprimento de onda curto (5500 equipamento ChemiImager ™, alfa Inotech Corporation, San Leandro, CA). A análise densitométrica dos resultados foi realizada com o software EZ-Quant-Gel análise (EZ-Quant, Rehovot, Israel), e a percentagem de actividade Topo I foi calculada usando a seguinte equação: (1 – (amostra /controlo)) × 100 [37].

A imunoprecipitação Ensaio

ribose monoclonal de rato anti-poli-ADP (PAR) anticorpo (MCA 1480) foi adquirido a partir de Serotec (Oxford, Reino Unido). Quantidades iguais de proteínas nucleares (200 ug), que foram pré-fervido durante 5 min, foram sujeitos a imunoprecipitação com Topo anti-humana eu anticorpos (SC) a um volume final de 100 uL de tampão nuclear (Tris-HCl a 10, pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl 1,5 mM

2, e inibidores da protease: 2 ug /ml de aprotinina, 2? g /ml de leupeptina, 1 ug /mL de pepstatina A, 2 ug /mL de antipaina, 100 ug /mL de PMSF) . A mistura foi rodada a 4 ° C durante a noite. Proteína A-Sepharose ‘(0,1 g /mL) em tampão TE (Tris-HCl a 10, pH 8, EDTA 1 mM) foi adicionada durante mais 1 h. As amostras foram centrifugadas a 10000 × g durante 2 minutos e as esferas foram lavadas três vezes com tampão TE. O sedimento foi ressuspenso em 25 ul de tampão de amostra (concentração final: 7,5% de glicerol, 1% de SDS, Tris-HCl a 50, pH 6,8, 2,5% β-mercaptoetanol e 0,025% de azul de bromofenol), fervidas durante 5 min, e centrifugado. As amostras foram carregadas em 7,5% SDS-PAGE e análise Western blot foi efectuada utilizando anticorpos policlonais IgG de cabra (C-15) anti-TOPO I ou ribose anti-poli-ADP (PAR) anticorpos.

decapagem de os anticorpos da membrana de nitrocelulose

a membrana foi imersa num tampão de extracção (mM de 2-mercaptoetanol β-100, 2% de SDS, e Tris-HCl a 62,5, pH 6,7) seguido de incubação a 50 ° C durante 30 min com agitação ocasional. A membrana foi lavada duas vezes com TPBS (Na 31,25 mM de

2HPO4, Na 12,5 mM de

2HPO

4, 13,7 mM de NaCl, 0,1% de Tween) durante 10 min à temperatura ambiente.

celular Ensaio de citotoxicidade

As células (5000 /poço, em triplicado) foram infectados com

M. fermentans

em 2 × 10

1-2 × 10

3 MOI durante 6 horas, seguido de tratamento com CPT 30 uM ou 0,01% de DMSO durante um adicional de 12, 24 ou 36 horas. A sobrevivência celular foi examinada utilizando o ensaio de vermelho neutro [42].

Análise estatística

Student

t

-test foi utilizado para determinar a significância entre as amostras experimentais e controlos.

P

valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos (*);

valores P Restaurant 0,01 (**) e 0,005 (***) foram considerados altamente significativo

Resultados de

1.. Vive

M. fermentans.Tais

inibe o relaxamento Atividade DNA de Topo I

O efeito directo de

M. fermentans

sobre a actividade da topoisomerase I celular foi analisada em dois tipos de linhas de células: cancro da mama humano (MCF7) e glioblastoma (U251). As células foram infectadas com o Live

M. fermentans.Tais Restaurant at MOI de 10

3CFU /celular, por vários intervalos (1,5, 3, 6, 12 e 24 horas). Os extractos nucleares foram preparados a partir de células infectadas e não infectadas e a actividade Topo I foi medido. quantidades equivalentes de proteínas de extracto nuclear foram adicionados a uma mistura de ensaio de relaxamento Topo I de ADN contendo ADN de plasmídeo super-enrolado como o substrato para o enzima; os produtos de reacção foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose. actividade Topo I é medida pela conversão de plasmídeo super-enrolado com as suas formas parcial ou completamente relaxado [19]. Ambos os tipos de células infectadas pelo

M. fermentans

demonstrou uma redução significativa, até 80%, na actividade de ADN relaxamento da enzima, em comparação com células não infectadas. A diminuição gradual da actividade Topo I foi observada a partir de 1,5 horas após a infecção com

M. fermentans

, e o pico da redução da actividade da enzima (80%) foi detectado em 6 horas após a infecção. redução significativa na atividade DNA relaxamento da Topo I também foi detectado 12 e 24 horas pós-infecção (30-50% para MCF7, 25-40% de U-251, respectivamente) (Figura 1A-D). No entanto, o grau de redução da actividade Topo I diminuiu com o tempo, o que sugere que a eficácia do sinal mediada por Mycoplasma é enfraquecida, como foi anteriormente demonstrada para vias mediadas por Mycoplasma de transdução de sinal [31], [43]. Para confirmar que as células foram infectadas e, na verdade, o efeito observado é devido à presença de

m. fermentans

, que ensaiada a presença de ADN de Mycoplasma nas células infectadas por reacção em cadeia de polimerase de transcriptase inversa de ensaio (RT-PCR), utilizando

H

.

fermentans-

primers específicos. Os resultados confirmaram que as linhas de células tumorais examinados foram de fato infectado com

M. fermentans.Tais

(Figura 2A).

MCF7 (A, B) e U251 (C, D) células cancerosas foram infectadas com o Live

M. fermentans.Tais

(

M.f

) para vários intervalos em MOI de 10

3CFU /célula. proteína nuclear total (12,5 ng) foi adicionado a uma mistura de reacção específicas para os produtos de reacção do Topo I. foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose. (A, C) uma imagem representativa (n = 4-5) de Topo I atividade DNA-relaxamento. (B, D) Quantificação da análise de actividade Topo I. Símbolos: R e S são a forma relaxada e super-enrolado do ADN de pUC19, respectivamente; Topo- nenhuma proteína adicionada à mistura de reacção.

t

-test:. *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, ***

p Art 0,005

Amostras do MCF7 e U251 células infectadas (descrito na Figura 1) foram analisados ​​para a detecção de ADN por PCR micoplasma (a, B). Os extractos nucleares derivados de células MCF7 e U-251 de células infectadas foram testadas para o nível de proteína Topo I usando análise de transferência de Western com anti-TOPO I ou anticorpos anti-p-actina, e quantificados por análise de densitometria utilizando o software EZquant (C-F).

Para verificar se a diminuição da atividade Topo I em células tumorais infectadas é uma consequência de uma redução do nível de proteína Topo I, extractos nucleares derivados de ambas as células infectadas e não infectadas foram analisados ​​por Western blot com o anticorpos I-Topo anti apropriadas. Como representado na Figura 2C-F, o nível de proteína Topo I em células infectadas foi semelhante ao encontrado em células não infectadas. Os resultados sugerem que a diminuição da actividade Topo I não foi devido a uma diminuição na quantidade de proteína enzima.

2. A inibição da actividade de DNA Relaxamento de Topo I por ultra-sons

M. fermentans

Para determinar se o efeito sobre Mycoplasma Topo I é exercida pelos materiais segregadas a partir de Mycoplasma vivo ou por proteínas estruturais desta bactéria, examinámos a actividade Topo I nas células tumorais tratadas com não-vivo, sonicada ,

M. fermentans.Tais

. As células MCF7 (e U251) foram tratadas durante 24 horas com o aumento da concentração de proteína (5, 10, e 20 ug /ml), derivados de sonicada

m. fermentans.Tais

. extracto nuclear foi preparado a partir das células tratadas e não tratadas e actividade Topo I de ADN de relaxamento foi medido. Como mostrado na Figura 3A, D, uma redução significativa na actividade Topo I foi observada, de um modo dependente da dose, em células tratadas com

m. fermentans.Tais

proteínas (sonicate). Quantificação da actividade Topo I [37] a partir de várias experiências (n = 4) foi realizada. Uma redução de 40-80% (

P

0,05) na actividade Topo I é observado em células tratadas com 5-20 ug /ml de sonicada

m. fermentans

proteínas durante 24 horas (Figura 3B, E). Embora tenha sido observada redução de actividade Topo I, em células tratadas com ultra-sons por Mycoplasma, o nível de proteína Topo I não foi afectada (Fig. 3C, F).

MCF7 (A-C) e U251 (D-F células cancerosas) foram tratadas por 24 horas com várias concentrações de

m. fermentans.Tais

proteínas. Total de proteínas nucleares (12,5 ng) foram adicionados a uma mistura de reacção específicas para os produtos de reacção do Topo I. foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose. (A, D) uma imagem representativa (n = 4-5) da actividade de relaxamento Topo I de ADN. (B, E) análise Quantificação da actividade Topo I. nível de proteína (C, F) Topo I examinado por análise de Western blot. Símbolos: R e S são a forma relaxada e super-enrolado do ADN de pUC19, respectivamente, topo- nenhuma proteína adicionada à mistura de reacção.

t

-test:. *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, ***

p Art 0,005

Este resultado indica que ao vivo ou não-vivo (ultra-sons)

M. fermentans.Tais

exercidas efeitos semelhantes no Topo celular I enzima.

3.

M. fermentans.Tais

diminuiu a CPT Inibição efeito sobre a actividade de ADN Relaxamento de Topo I

Era de interesse para examinar o efeito da infecção por Mycoplasma sobre a capacidade inibitória de antagonistas conhecidos topo I, tais como CPT. Inicialmente, foi conduzida uma série de experiências em que as células foram tratadas com várias concentrações de CPT, a fim de seleccionar a dose de CPT que causa uma inibição quase total da actividade da enzima dentro de um curto período de tempo (não mostrado). Nós selecionamos uma dose CPT de 30 mM, que inibiram a atividade de Topo I por 90-95% no intervalo de 1,5 h (Figura 4A, B, comparar pista 4 a pista 2). As células foram infectadas com o Live

M. fermentans

durante 6 horas a uma MOI de 10

3 CFU /células, seguindo-se 30 uM de CPT tratamentos durante um período adicional de 1,5 horas. Uma diminuição significativa no efeito inibidor da CPT (a partir de uma inibição de 95% para aproximadamente 60%) foi observada em células MCF-7 expostas à combinação de

m. fermentans.Tais

infecção e tratamento CPT (Figura 4A, B, comparar pista 6 a pista 4,

p Art 0,005). Resultados semelhantes foram obtidos com células U251 (Figura S1 A-B). O tratamento de células com CPT é conhecido por reduzir a quantidade de proteína I Topo livre presente no nucleoplasma devido à estabilização dos complexos de DNA-enzima susceptível ao corte por CPT. De facto, o tratamento de células tumorais com CPT reduziu o nível de proteína Topo I livre (Figura 4C pista 3). A combinação de infecção por Mycoplasma e CPT tratamento não afectou o nível de proteína livre Topo I quando examinado em relação à quantidade de proteína β-actina (Figura 4C).

células MCF7 foram infectados com

m. fermentans.Tais

(

M.f

) por 6 horas seguidas de CPT (30 M) tratamentos para mais 1,5 horas. proteína nuclear total (12,5 ng) foi adicionado a uma mistura de reacção específicas para os produtos de reacção do Topo I. foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose. (A) uma imagem representativa n = 5, actividade de ADN-Topo I relaxamento. (B) Análise de Quantificação da actividade Topo I. nível (C) Topo I de proteína examinados por análise de mancha de Western. Símbolos: R e S são a forma relaxada e super-enrolado do ADN de pUC19, respectivamente, topo- nenhuma proteína adicionada à mistura reaccional

t

-test: *

P

0,05, * *

p Art 0,01, ***

p

. 0,005

4. Poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) Antagonistas impediu a induzida por Mycoplasma Efeito Inibidor de Topo I Atividade

Os resultados acima mencionados sugerem que a redução na atividade Topo I em células tumorais exercidas pelo

M. fermentans

pode ser devido a modificações pós-traducionais das proteínas enzimáticas. Topo I sofre várias modificações pós-tradução, as quais afectam a sua actividade: A fosforilação de topo I por caseína-quinase II ou por PKC aumenta a sua actividade, enquanto que ribosilação de poli-ADP por PARP-1 diminui a sua actividade. Além disso, ubiquitinação de Topo I conduz à sua proteólise [44], [45]. Para determinar a via pela qual

m. fermentans

afecta a topoisomerase I, investigou o efeito de primeiro poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) inibidor -3-aminobenzamida (3AB) sobre a actividade Topo I, por si só e como um pré-tratamento com

m. fermentans.Tais

infecção. As células MCF7 foram pré-incubadas com 3AB em diferentes concentrações (1-3 mM) durante 1,5 horas seguida por

m. fermentans

infecção (MOI de 10

3CFU /célula) e a incubação durante mais 6 horas. extracto nuclear foi preparado e analisado quanto à actividade Topo I tal como descrito acima. Os resultados apresentados na Figura 5A-B mostram que o tratamento prévio com 3AB impediu o

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redução induzida na actividade Topo I. O tratamento de células não infectadas com 3AB durante o tempo indicado não influenciou a actividade Topo I celular (Figura 5A, B). Resultados semelhantes foram obtidos com as células U-251 (Figura S2 A-B).

células MCF7 foram pré-incubadas com 3-aminobenzamida (3AB) durante 1 h a várias concentrações, seguido por

m. fermentans

infecção (MOI de 10

3 CFU /célula) durante um adicional de 6 horas. proteína nuclear total (12,5 ng) foi adicionado a uma mistura de reacção específicas para os produtos de reacção do Topo I. foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose (A) e quantificação de actividade Topo I foi realizada (B). Símbolos: R e S são a forma relaxada e super-enrolado do ADN de pUC19, respectivamente, topo- nenhuma proteína adicionada à mistura reaccional

t

-test: *

P

0,05, * *

p Art 0,01, ***

p

. 0,005

5. MEK Inhibitor impediu a Redução induzida por Mycoplasma no Topo I Atividade e ERK 1/2 fosforilação

Relatórios recentes demonstraram que a PARP-1 é fosforilada por ERK [28]. O efeito directo de

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no MAPKs em geral, não foi exaustivamente estudado. A maioria dos estudos sobre

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e MAPKs foram realizadas utilizando produtos micoplasma ou inativado pelo calor Mycoplasma (HIM). No entanto, alguns estudos mostraram que a infecção de células com vários Mycoplasma pode levar a ERK-fosforilação [11], [17], [30]. Neste estudo examinou o efeito do inibidor MEK PD-98059 sobre a actividade Topo I, sozinhos ou antes da infecção com

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. células MCF-7 e U-251 foram pré-incubadas com PD, durante 1,5 h, a uma concentração de 25 uM, seguido por

m. fermentans

infecção (MOI de 10

3CFU /célula) e a incubação durante mais 6 horas. extracto nuclear foi preparado e analisado quanto à actividade Topo I e fosforilação de ERK usando análise de transferência de Western com anticorpo anti-P ERK 1/2 específica. Os resultados demonstraram que a adição do inibidor de MEK para a reacção Topo I não afectou a actividade Topo I (Figura 6A, B), e em contraste, o tratamento de células com o inibidor (PD) impediu o

m. fermentans-

redução induzida no Topo I atividade (Figura 3A, B para células U-251). Além disso, verificou-se que a quantidade de P-ERK1 /2 aumentou nas células infectadas (Figura 6C para células MCF7 e Figura S3 C para U-251), enquanto que o pré-tratamento com PD impediu este aumento. O nível de ERK total não foi afectada pelas diferentes tratamentos (Figura 6c). Estes resultados sugerem que a redução na atividade Topo I em

M. fermentans-

células é mediada por uma sinalização MAPK infectado.

células MCF7 foram pré-incubadas com inibidores de MEK (PD) durante 1 hora a uma concentração de 25 uM, seguido por

m. fermentans

infecção (MOI de 10

3CFU /célula) durante um adicional de 6 horas. proteína nuclear total (12,5 ng) foi adicionado a uma mistura de reacção específicas para os produtos de reacção do Topo I. foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose (A) e actividade Topo I foi quantificada (B). ERK fosforilada nível 1/2 proteína de MCF7-extracto foi examinado por análise de Western blot (C). Símbolos: R e S são a forma relaxada e super-enrolado do ADN de pUC19, respectivamente, topo- nenhuma proteína adicionada à mistura reaccional

t

-test: ***

P

0,005 .

6.

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infecção aumentou Poly-ADP-ribosilação de Topo I derivadas de células MCF-7

PARP-1 regula a atividade Topo I pela ADP-ribosilação da proteína enzima [46]. Para examinar a infecção se com

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induzida Topo I modificação por PARP, proteína Topo I foi imunoprecipitada por anticorpos anti-topo I derivados a partir de escleroderma (SC) soro de um paciente [47] e analisados ​​por transferência de Western utilizando anticorpo monoclonal anti-poli-ADP-ribose (figura 7A).