Abstract

A maioria dos cancros do endométrio podem ser classificados histologicamente como endometrioid, serosa, ou de células claras. cancros não endometrióides endometriais (NEECs; células serosa e clara) são os mais clinicamente agressivo dos três principais histotipos e são caracterizados por aneuploidia, uma característica de instabilidade cromossômica. As alterações genéticas que fundamentam a instabilidade cromossômica no câncer de endométrio são mal compreendidos. No presente estudo, foi utilizado seqüenciamento Sanger para procurar variantes de nucleotídeos nos exons codificantes e junções de união de genes de instabilidade cromossomo 21 candidatos, incluindo 19 genes implicados em cromátides irmãs de coesão, a partir de 24 NEECs primárias, microssatélites-estável. Mutações somáticas foram verificados por sequenciação de ADN combinado normais. Nós posteriormente resequenced genes mutantes de 41 NEECs adicionais, bem como 42 ECs endometrióides (EECS). Descobrimos mutações somáticas nonsynonymous em

ESCO1

,

CHTF18,

e

MRE11A

em, respectivamente, 3,7% (4 de 107), 1,9% (2 de 107), e 1,9% (2 de 107) dos tumores do endométrio. No geral, 7,7% (5 em 65) de NEECs e 2,4% (1 de 42) de EECS tinha somaticamente mutados um ou mais dos três genes. Um subconjunto de mutações estão previstos para influenciar a função da proteína. A co-ocorrência de mutações somáticas no

ESCO1

e

CHTF18

foi estatisticamente significativa (

P

= 0,0011, bicaudal teste exato de Fisher). Este é o primeiro relato de mutações somáticas dentro

ESCO1

e

CHTF18

em tumores do endométrio e de

mutações MRE11A

em tumores do endométrio microssatélites-estável. Nossos resultados justificam estudos futuros para determinar se estas mutações são eventos excitador que contribuem para a patogénese do cancro endometrial

Citation: Preço. JC, Pollock LM, Rudd ML, Fogoros SK, Mohamed H, Hanigan CL, et al . (2013) sequenciamento dos genes de Instabilidade Candidato cromossômicas em câncer de endométrio revela Somatic Mutações no

ESCO1

,

CHTF18

, e

MRE11A

. PLoS ONE 8 (6): e63313. doi: 10.1371 /journal.pone.0063313

editor: Todd W. Miller, Dartmouth, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de dezembro de 2012; Aceito: 01 de abril de 2013; Publicação: 03 de junho de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi financiado, em parte, pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano no NIH (DWB, JCM); CA016519 concessão NIH (PH); Canadian Institutes of Health Research (CIHR) concessão MOP-38096 (PH); Conselho Manitoba Health Research (MHRC) concessão (KJM); prêmio CIHR /MHRC RPP New Investigator (KJM); U01 CA113916 e R01 CA140323 (AKG); NIH RO1-1CA112021-01 (DCS); O esporo NCI no cancro da mama no Massachusetts General Hospital (DCS); e da Fundação Avon (DCS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de útero é a neoplasia maligna ginecológica mais comumente diagnosticado nos Estados Unidos e é a oitava causa de morte por câncer entre as mulheres americanas [1]. câncer de endométrio (ECs) conta para a grande maioria dos cancros uterinos. Endometrioid, serosa e carcinomas de células claras representam as três principais subtipos histológicos do CE. Cada subtipo surge de lesões precursoras distintas, tem comportamentos clínicas distintas e etiologias moleculares distintos [2], [3].

endometrioid ECs (EECS) são tumores dependentes de estrogénio associadas a um prognóstico favorável geral evidenciado por um 5 taxa de sobrevivência relativa year de ~ 90% [4]. Em contraste, células serosa e clara ECs (não-endometrioid ECs (NEECs)) são tumores agressivos, independente de estrógeno com 5 anos as taxas de sobrevivência relativa de apenas 44% e 65%, respectivamente clinicamente [4]. NEECs contribuem de forma desproporcionada para a mortalidade por CE. Em um estudo de base populacional de endometrioid, serosa e ECs de células claras dentro da Vigilância Epidemiologia Estados Unidos e Resultados Finais (SEER) programa (1988-2001), NEECs responsável por 47% das mortes apesar de constituírem apenas 13% dos diagnósticos [5].

EECS e NEECs exibem modos distintos de instabilidade genômica. EECS tendem a ser diplóide ou quase diplóide, mas frequentemente apresentam instabilidade de microssatélites (MSI) [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Em contraste, NEECs são frequentemente aneuploidia, ou cromossomicamente instáveis, mas exibir MSI só raramente [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

MSI reflete uma fenótipo mutante resultante de reparo incompatível com defeito (revisto em [18]). Nos cancros endometriais esporádicos, a maioria dos casos de MSI são explicados por hipermetilação do promotor de MLH1, MSH2 perda de expressão ou mutações somáticas no

MSH6

(revisto em [19]). Aneuploidia foi recentemente sugerido que resultam de um processo passo a passo, resultante de uma tolerância adquirida para um genoma diplóide não, através de inactivação da via de p53, assim como cromossoma aberrante segregação [20]. Apesar de inativação de mutações no

TP53 Comprar e estabilização da proteína p53 são freqüentes em NEECs, ocorrendo em até 90% dos tumores serosos (revisto em [19]), a base genética da segregação errada cromossomo em NEECs permanece mal compreendido.

em leveduras, cromossomo segregação errada pode surgir de mutações em genes que regulam a coesão de cromátide irmã [21], [22]. Mitótico coesão de cromátides irmãs refere-se à ligação física de cromatídeos irmãos replicados pelo complexo de proteínas cohesin até anaphase, para garantir a segregação fiel de cromatídeos irmãos em células-filhas. Em

S. cerevisiae

, o complexo coesina consiste na SMC1, SMC3, SCC1, e subunidades SCC3 e é carregado em cromatina no final de G1 por um processo que requer o CAA2-Scc4 complexo de [23], [24], [25 ]. estabelecimento de coesão subsequente depende da acetilação de SMC3 pelo acetiltransferase ECO1 [26], [27], [28], bem como as actividades de CHL1 e o factor de replicação alternativa C (RFC) complexo Ctf18-Ctf8-DCC-Rfc [ ,,,0],21], [29]. estabelecimento de Coesão é antagonizada pelas atividades da Wpl1-pDS5 complexo e o complexo Elg1-Rfc [30], [31].

As proteínas que regulam a irmã chromatid coesão são altamente conservadas ao longo da evolução. Em células de mamíferos, o complexo coesina mitótica é formado por SMC1A (hSmc1), SMC3 (hSmc3), RAD21 (hScc1), e SA1 /SA2 (hScc3). Cohesin carregamento depende NIPBL (hScc2) e MAU2 (hScc4) (revisto em [32]). estabelecimento de Coesão exige acetilação em SMC3 pelos acetiltransferases ESCO1 e ESCO2 [33] e também é regulada pelo complexo CHTF18-RFC [34] e por DDX11 (hChl1) [35], [36].

Há um crescente corpo de evidências implicando o rompimento mutacional dos genes de coesão cromatídeos irmãos no câncer humano. eliminações somáticas e mutações de vários genes que regulam a irmã chromatid coesão foram recentemente descobertos em câncer colorretal, sarcoma, glioblastoma, melanoma, leucemia mielóide aguda e doenças mielóides de Ewing [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Nós previamente descrito mutações somáticas perda de função de

ATAD5

em cancros do endométrio [44]. ATAD5 é o orthologue humana da

S. cerevisiae

Elg1, que forma um complexo Rfc-like que participa de cromátides irmãs de coesão [45], [46].

No presente estudo, buscou-se determinar se os genes de coesão cromatídicas irmã adicionais estão somaticamente mutado em tumores endometriais. Nós resequenced os ortólogos humanos de 19 genes implicados na regulação da coesão de cromátides irmãs, bem como dois adicionais de instabilidade cromossômica candidato genes (NIC), a partir de 24 NEECs primários. genes mutados foram subsequentemente sequenciados a partir de 83 tumores do endométrio adicionais. Nosso estudo descobriu mutações somáticas nonsynonymous em

ESCO1

,

CHTF18

, e

MRE11A

em um subconjunto de tumores do endométrio humano.

Materiais e Métodos

Ética declaração

o Escritório NIH dos Seres humanos Research determinou que esta investigação não foi “pesquisa seres humanos” por a regra comum (45 CFR 46), e, portanto, que qualquer revisão IRB foi necessário para sequenciação das amostras anónimos neste estudo.

espécimes clínicos

anónimos, tecidos tumorais endometriais primários (45 serosa, 20 células claras, e 42 endometrióides) e combinados tecidos histologicamente normais foram obtidos a partir da Cooperativa Rede de tecido humano, ou a partir do Repositório bioamostra no Fox Chase Cancer Center, Filadélfia PA. Seis casos de tumor combinados e DNAs normais foram adquiridos a partir de Oncomatrix. Todos os tecidos de tumor foram recolhidos antes do tratamento. Um hematoxilina e eosina (H E). Seção manchada de cada amostra de tumor foi avaliada por um patologista para verificar a histologia e para delinear as regiões de tecido com alto teor de células tumorais (≥70%)

Nucleic isolamento de ácido e identidade testes

o ADN genómico foi isolado a partir de tecido macrodissected utilizando o kit Puregene (Qiagen). Emparelhados, os ADN do tumor-normal foram genotipados utilizando o kit Coriell Mapeamento de Identidade (Coriell) de acordo com as instruções do fabricante. fragmentos de genotipagem foram tamanho separados em um ABI-3730

xl

analisador de DNA (Applied Biosystems) e os alelos foram registados com GeneMapper (Applied Biosystems).

Identificação de genes ortólogos

A lista consolidada de ortólogos humanos conhecidos e candidatos de genes de estabilidade levedura cromossomo (com papéis demonstradas em cromátides irmãs de coesão) foi identificado por meio de abordagens inter-espécies convencionais. Resumidamente, InParanoid 7 e bancos de dados HomoloGene foram consultados para identificar ortólogos conhecidos, enquanto BLASTp foi empregada para identificar os candidatos top-hits (baseado em E-value) das sequências de proteínas não redundantes dentro do

Homo sapiens

banco de dados .

reverso de PCR de transcriptase (RT-PCR)

O ARN total foi extraído a partir de 5 endometrióide e 2 linhas de células de cancro do endométrio serosas usando Trizol Reagente (Ambion). A mistura total de humano disponível comercialmente controlo RNA (Applied Biosystems) foi utilizado como um controlo positivo. a síntese de cDNA foi realizada em 1 ug de ARN total com o kit de arquivo de cDNA de alta capacidade utilizando hexâmeros aleatórios (Applied Biosystems). ADNc (0.2μl) foram amplificados por PCR utilizando os pares de iniciadores indicados no quadro S1. A amplificação consistiu de 40 ciclos utilizando os seguintes parâmetros: 94 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s, com uma etapa de extens final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram separados num gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio em 0,5 × tampão TAE e visualizadas sob iluminação ultravioleta.

linhas celulares e análise de Western blot

linhas celulares de cancro do endométrio (serosos ARK1 e ark2) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Alessandro Santin (Yale School of Medicine). linhas celulares de cancro do endométrio endometrioid (RL-95-2, HEC1A, HEC1B, ANC3A) e uma linha celular derivada de um adenocarcinoma do endométrio pouco diferenciado (KLE) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection, ou o repositório linha celular NCI Developmental Therapeutics Program . As células foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato seguido por lise em tampão RIPA arrefecido em gelo (Thermo Scientific) contendo 1 mM ortovanadato de Na, NaF 10 mM, e 1X cocktail inibidor de protease (Roche). Os lisados ​​foram centrifugados e a quantidades iguais de ligado clarificado foram desnaturadas a 95 ° C em 2 x tampão de amostra de SDS (Sigma) antes de SDS-PAGE e transferência para membranas de PVDF (Bio-Rad). Os anticorpos primários e secundários conjugados com HRP foram: αMRE-11 (Cell Signaling), αCHTF18 (Novus Biológica), αESCO1 (Novus Biológica), α-α /β-tubulina (Cell Signaling), HRP de cabra anti-murganho (Cell Signaling) , e de cabra anti-coelho HRP (Cell Signaling). proteínas imunorreactivas foram visualizadas com quimioluminescência aumentada (Pierce).

projeto Primer e amplificação PCR

Os pares de iniciadores foram concebidos, utilizando métodos publicados [47], para atingir 97,4% (458 de 470) de todos os exões dos 21 genes na tela de descoberta mutação (Tabela S2), e todos os exões dos três genes na tela de prevalência mutação (Tabela S3). As condições de PCR estão disponíveis mediante pedido.

O seqüenciamento

Os produtos de PCR foram submetidos a bidirecional seqüenciamento Sanger utilizando iniciadores M13 e o Big Dye Terminator Versão 3.1 Ciclo kit de sequenciação (Applied Biosystems). As reacções de sequenciação foram executados em ABI 3730

xl

Analisadores de ADN (Applied Biosystems). qualidade trace sequência foi avaliada com o programa chamando-base, Phred [48], [49]. Todos os vestígios foram incluídos na análise subsequente, uma vez que os polimorfismos supressão-inserção pode imitar dados de baixa qualidade a partir de uma medida de qualidade de Phred, mas pode conter dados de sequências válidas. Todas as sequências para um dado par de iniciadores foram montados utilizando Consed [50]; amplímeros sobrepostas foram montados separadamente para permitir a validação cruzada independente de chamadas em regiões sobrepostas. Variantes de sequência, incluindo as diferenças de nucleotídeo simples e curtos ( 100 pares de bases) inserções e deleções, foram identificados utilizando PolyPhred v6.11 [51] e um algoritmo (DIPDetector) in-house optimizado para melhorar a sensibilidade de encontrar inserções e deleções de dados de rastreamento alinhados. DIPDetector analisa vestígios de sequenciamento Sanger e prevê inserções e deleções começando por analisar os alinhamentos ler para variantes homozigotos. Em seguida, ele procura por assinaturas de inserções e deleções heterozigotos na saída do Phred basecaller executado com a opção – poli [49]. Depois de formar dois vectores contendo as bases com maiores áreas de pico em cada posição da leitura (ou atribuir a maior área de pico para ambos os vectores, quando o segundo maior pico tem uma área inferior a 10% do tamanho do maior pico), tentativas DIPDetector a fase esses vetores através da inserção de potenciais alterações de todos os tamanhos possíveis em todas as posições possíveis da leitura, e contagens essas mudanças de acordo com o quão bem o resultante deslocado vetores coincidir com as bases observadas dentro do traço. hg18 montagem do genoma humano (NCBI construir 36,1) foi utilizada como sequência de referência. posições variantes foram cruzados com dbSNP (Build 129) entradas para identificar polimorfismos conhecidos. Para determinar se as novas variantes eram mutações somáticas ou polimorfismos da linha germinativa, do ADN do tumor adequada e ADN normais combinados foram re-amplificado num PCR independente seguido por análise da sequência da variante posição. O impacto previsto de mutações somáticas sobre a função da proteína foi avaliada

in silico

usando liberar Mutation Assessor 2 (https://mutationassessor.org/), SIFT (https://sift.jcvi.org/) e Polyphen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml).

Cálculo da tela descoberta poder

a potência estimada para detectar uma mutação genética em um conjunto de 24 tumores é 1- (1-X)? 24, onde X é a fracção real de tumores com uma mutação no gene que.

resultados e Discussão

em uma tela descoberta mutação , foram analisados ​​24 NEECs primários para a presença de variantes de nucleótidos nos exões codificantes e as junções de união de genes candidatos instabilidade cromossoma 21, que são expressas em níveis variáveis, em linhas celulares de cancro do endométrio (Figura S1). Dezenove destes genes estão implicados na regulação da coesão de cromátide irmã, com base na sua homologia de sequência com genes de coesão no

S. cerevisiae

(Tabela 1). Os 24 NEECs consistiu de 17 ECs serosa e 7 claras de células ECs; cinco dos tumores serosos (T33, T45, T65, T69, T70) foram recentemente sujeitos a sequenciação exome toda [52]. Foram incluídos tumores apenas MSI-estáveis ​​na tela de descoberta; os dados MSI foram relatados em outros lugares [52].

Foram obtidos dados de sequência de alta qualidade para 87,6% (5,64 Mb) de bases (6,44 Mb) alvejados. Após a exclusão de variantes que foram anotados como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no prazo de dbSNP (Build 129), havia 109 variantes de nucleotídeos únicos que representavam mutações somáticas potenciais. Para determinar se essas variantes eram mutações somáticas ou variantes da linha germinativa, nós novamente amplificados e sequenciados as posições variantes do DNA do tumor apropriado e DNA normais correspondido. Três variantes foram

osso fide mutações somáticas

, presentes no ADN do tumor, mas ausentes do DNA normais correspondido. Os genes mutados somaticamente foram

ESCO1

(criação de coesão 1 homólogo 1 (

S. Cerevisiae

)),

CHTF18 (

cromossomo transmissão fidelidade fator 18 homólogo (

S. cerevisiae

)), e

MRE11A

(meiotic recombinação 11 homólogo A (

S cerevisiae

).); cada gene foi mutado em 4% (1 de 24) de NEECs em tela de descoberta. Embora não tenhamos encontrado nenhuma evidência de mutações somáticas nos restantes 18 candidatos genes CIN, é importante reconhecer que nossa tela de descoberta tem poder suficiente para detectar todas as mutações somáticas presentes em NEECs. Estima-se que em uma tela de 24 NEECs, o poder de detectar genes que estão somaticamente mutados em 5%, 10% ou 15% de todos os NEECs é de 71%, 92%, e 98%, respectivamente.

próxima procurou determinar mais precisamente a frequência e espectro de mutações somáticas no

ESCO1, CHTF18,

e

MRE11A

no câncer de endométrio. Para isso, foi realizada uma tela de prevalência em que resequenced os exons codificantes e locais de junção dos três genes a partir de um 28 tumores adicionais serosa, 13 tumores de células claras, e 42 tumores endometrióides, não selecionados para o estado MSI.

nas telas de descoberta e prevalência combinados, nós descobrimos mutações somáticas nonsynonymous dentro

ESCO1

,

CHTF18

, e

MRE11A

em, respectivamente, 3,7% (4 de 107) , 1,9% (2 de 107), e 1,9% (2 de 107) de tumores do endométrio (Tabela 2 e Figura S2). No geral, 7,7% (5 em 65) de NEECs e 2,4% (1 de 42) de EECS tinham mutações somáticas em um ou mais dos três genes. Em comparação com os genes do câncer de consenso conhecidos com papéis estabelecidos no cancro endometrial, e transformado significativamente genes do cancro,

ESCO1

,

CHTF18

, e

MRE11A

foram raramente mutado (Figura S3 , Figura S4, Figura S5) [44], [52], [53], [54], o que sugere que esses três genes são ou raros genes motorista patogênicos para o câncer endometrial ou que são genes não-patogênicos que tenham adquirido mutações de passageiros . Imunotransferência confirmaram a expressão da MRE11A e CHTF18 no painel de linhas celulares de cancro do endométrio (Figura S6); ESCO1 foi variavelmente expressa entre essas mesmas linhas celulares.

ESCO1,

que codifica uma acetiltransferase lisina, que é essencial para o estabelecimento da coesão de cromátides irmãs em células de mamíferos, foi somaticamente mutado em 2,2% (1 de 45) dos ECs serosa, 10% (2 de 20) de células claras ECs, e 2,4% (1 de 42) de endometrioid ECs. Dois dos

ESCO1

mutações são previstos para impactar a função da proteína. O ESCO1

mutante R786C missense, dentro do domínio de acetiltransferase, é predito para impactar a função da proteína, tanto o SIFT e algoritmos Polyphen (Tabela 2). Nós especulamos que o ESCO1

E338X absurdo mutante, que nós descobrimos em uma serosa-CE, pode ser uma perda de função mutante desde uma proteína produzida por esse alelo seria prematuramente truncado e deixar de incluir o domínio acetiltransferase. Alternativamente, decadência mediado por mutações nonsense do

ESCO1

E338X

transcrição pode levar a haploinsuficiência.

CHTF18

foi somaticamente mutado em 2,2% (1 de 45) ECs serosa e 2,4% (1 de 42) de endometrioid ECs. Em células humanas, o complexo CHTF18-RFC regula a acetilação do SMC3 coesão da subunidade por ESCO1 e ESCO2 acetiltransferases [34], contribuindo assim para o estabelecimento da coesão de cromátides irmãs. O complexo CHTF18-RFC também foi implicada na estimulação da actividade de DNA polimerase η, e no recrutamento de polimerase de ADN ε para os locais de sintese de reparação de preenchimento de lacunas [55], [56]. Ambos os mutantes CHTF18 nós descoberto em cancro do endométrio se localizam no carboxi-terminal da proteína (Figura 1), dentro de uma região (resíduos 576-876) que medeia a ligação a RFC2-5 [57]. O CHTF18

R854W mutante está previsto para possivelmente afetar a função da proteína pela mutação Assessor e peneirar algoritmos (Tabela 2). Curiosamente, a maioria dos

CHTF18

mutações observadas em outros cancros também localizar a extremidade C-terminal da proteína codificada [58]. Estas observações levantam a possibilidade de que as mutações missense somáticas no C-terminal de CHTF18, encontrados aqui e em outros tipos de câncer, pode afectar a interacção CHTF18-RFC.

mutações somáticas individuais são indicados por quadrados (mutações nonsense) ou diamantes (mutações missense). posições de domínio são derivados a partir de [65], [66], [61], [59], [67]. GAR: Glycine-Arginina-Rich motivo; RBD: RAD50 domínio de ligação; caixa de RFC:. caixa de replicação Fator C

MRE11A

foi somaticamente mutado em 4,4% (2 de 45) dos ECs serosa. Não

MRE11A

mutações foram observadas entre as células claras ou tumores endometrióides. MRE11A possui tanto actividade de endonuclease e 3′-5 actividade de exonuclease “e, como um componente do MRE11A-RAD50-NBS1 (NRM) complexa, que desempenha um papel essencial na resposta celular de quebras de cadeia dupla (revisto em [59]). Em células de mamíferos, o complexo MRN também é necessária para a fosforilação mediada por ATR da subunidade SMC1 de coesina [60], e a depleção de siRNA

MRE11A

em células humanas resulta em defeitos de coesão [37]. O MRE11A

D131N mutante somática, que nós descobrimos numa CE serosa, ocorre num resíduo altamente conservado evolutivamente no terceiro motivo phosphoesterase dentro do domínio de nuclease [61] e está previsto para impactar a função da proteína (Figura 1 e Tabela 2 ). O MRE11A

mutante D692Y, no domínio de ligação de ADN, também se prevê que seja funcionalmente significativa (Tabela 2). Embora mutações somáticas intrônica em

MRE11A

foram relatados em microssatélites instável câncer de endométrio [62], [63], [64], a nosso conhecimento, o presente estudo é o primeiro relato de mutações somáticas de

MRE11A

microssatélites em tumores endometriais estáveis ​​(Tabela 2). De nota, o MRE11A

variante D131N, que foi somática em nosso estudo, também foi observado como uma variante rara população (TMP_ESP_11_94212851) na exome projeto de sequenciamento NHLBI (URL: https://evs.gs.washington.edu /EVS /), com uma frequência de alelos menor de 0,0233% na população EuropeanAmerican.

a exclusividade mútua ou co-ocorrência de mutações somáticas em dois ou mais genes pode indicar redundância funcional ou sinergia funcional, respectivamente. Para determinar o padrão de mutações somáticas dentro de genes de coesão no cancro endometrial, combinamos os resultados do presente estudo com a nossa análise anterior do

ATAD5 (hELG1)

gene nesta mesma coorte de ECs [44]. Embora o número de casos mutados é pequena, observamos que mutações somáticas no

ESCO1

e

ATAD5

tendiam a co-ocorrer no câncer de endométrio (

P

= 0,0102, dois -tailed teste exato de Fisher), assim como mutações somáticas no

ESCO1

e

CHTF18

(

P

= 0,0011) (Figura 2 e Tabela 3). Estas observações levantam a possibilidade de que possa haver sinergia funcional entre

ESCO1

e

ATAD5

mutantes e entre

ESCO1

e

CHTF18

mutantes, em endometrial Câncer. A este respeito, é de salientar que mutações somáticas no

ESCO1

e

ATAD5

também tendem a co-ocorrem em tumores colorretais (

P

= 0,000001) (Figura S7) , com base na análise dos dados de mutação publicamente disponíveis gerado pelo Cancer Genome Atlas [https://cbio.mskcc.org/cancergenomics/]. Uma alternativa, mas não se excluem mutuamente, possibilidade é que as mutações co-ocorrência de genes de coesão no cancro endometrial pode refletir um fenótipo hipermutável subjacente. Nós já avaliamos a coorte de 107 tumores no estudo de instabilidade de microssatélites e

MSH6

mutações [44], [52], ambos os quais podem dar origem a hipermutabilidade devido ao reparo incompatível com defeito (MMR). Embora três dos tumores com mutações genéticas coesão neste estudo eram ou MSI-instável ou

-mutated MSH6

(Figura 2), não se observou associação estatisticamente significativa entre mutações em genes de coesão cromatídeos irmãos e defeitos de reparo incompatível (Tabela S4 e S5 Tabela).

tumores individuais (T) são indicados por barras cinzentas verticais. Tumores consistem em NEECs (T3, T51, T62, T68, T77, T79, T113) e uma CEE (T88). Genes (esquerda) e mutações somáticas nonsynonymous (caixas de laranja) são indicados.

ESCO1

,

CHTF18

, e

MRE11A

foram analisados ​​neste estudo; *

ATAD5

mutações,

MSH6

mutações e instabilidade de microssatélites (MSI) foram anteriormente descritos em outro lugar [44], [52].

em resumo, nós identificamos, nonsynonymous, mutações somáticas raras no

ESCO1

,

CHTF18

, e

MRE11A

em um subconjunto de tumores do endométrio primários. Futuros estudos serão necessários para determinar se estas mutações são eventos excitador que contribuem para a patogénese do cancro endometrial.

Informações de Apoio

Figura S1. análise

RT-PCR dos genes instabilidade cromossômica humana 21 candidatos em 7 linhas celulares de cancro do endométrio humano. A electroforese em gel de produtos de RT-PCR confirma a expressão dos genes candidatos instabilidade cromossoma 21 em linhas celulares de cancro do endométrio e serosas endometrióides. controles (água) de PCR positivos e negativos são mostrados. .

ACTB

e

GAPDH

servido genes como controle positivo

doi: 10.1371 /journal.pone.0063313.s001

(TIF)

Figura S2.

Sequence cromatogramas apresentando mutações somáticas no

ESCO1

,

CHTF18

, e

MRE11A

em DNAs de tumores do endométrio, em comparação com os DNAs normais pareados

doi.: 10.1371 /journal.pone.0063313.s002

(TIF)

Figura S3.

Oncoprints exibindo a distribuição de mutações somáticas nos tumores endometriais serosos como relatado neste estudo (*) e em outros lugares [44], [52], [53], [54]. Cada barra azul representa um tumor individual (T). e mutações somáticas nonsynonymous MSI + são indicados pelas barras vermelhas. Para

MSH6

, as variantes da linha germinativa de significado funcional desconhecido são exibidos por barras de laranja. A frequência observada (%) dos casos mutados, para cada gene, é mostrado à direita

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s003

(TIF)

Figura S4.

Oncoprints exibindo a distribuição de mutações somáticas nos tumores endometriais de células claras como relatado neste estudo (*) e em outros lugares [44], [52], [53], [54]. Cada barra azul representa um tumor individual (T). e mutações somáticas nonsynonymous MSI + são indicados pelas barras vermelhas. Para

MSH6

, uma variante da linha germinativa de significado funcional desconhecido é exibido pela barra laranja. A frequência observada (%) dos casos mutados, para cada gene, é mostrado à direita

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s004

(TIF)

Figura S5.

Oncoprints exibindo a distribuição de mutações somáticas nos tumores endometriais endometrióides como relatado neste estudo (*) e em outros lugares [44], [52], [53], [54]. Cada barra azul representa um tumor individual (T). e mutações somáticas nonsynonymous MSI + são indicados pelas barras vermelhas. Para

MSH6

, as variantes da linha germinativa de significado funcional desconhecido são exibidos por barras de laranja. A frequência observada (%) dos casos mutados, para cada gene, é mostrado à direita

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s005

(TIF)

Figura S6.

imuno mostrando os níveis de expressão do MRE11A, CHTF18 e ESCO1 proteínas entre um painel de 7 linhas celulares de cancro do endométrio humano. Tubulin foi usado como um controle para carga de proteína

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s006

(TIF)

Figura S7.

Oncoprint exibir padrões de mutações somáticas no

ESCO1

,

CHTF18

,

MRE11A

, e

ATAD5

no cancro colorectal, conforme relatado pelo The Cancer Genome Atlas (TCGA). (Painel superior) tumores colorrectais individuais são indicados por barras cinzentas verticais. Genes (esquerda) e mutações somáticas nonsynonymous (bares laranja) são indicados. (Painel inferior) em câncer colorretal, mutações no

ATAD5

e

ESCO1

mostrou uma forte tendência para a co-ocorrência; mutações no

MRE11A

e

ESCO1

, e

ATAD5

e

MRE11A

mostrou uma tendência para a co-ocorrência. Os dados foram obtidos a partir de 224 amostras sequenciadas; os dados foram acessados ​​TCGA, ea exclusividade mútua calculado através da Cancer Genomics Portal CBio (https://www.cbioportal.org/public-portal/).

doi:10.1371/journal.pone.0063313.s007

(TIF)

Table S1.

iniciadores de RT-PCR utilizado para avaliar a expressão de genes instabilidade cromossómica humana 21 candidatos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s008

(XLSX)

Tabela S2. primers

PCR usado para amplificar 21 candidatos genes instabilidade cromossômica humana dentro tela de descoberta

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s009

(DOC)

Tabela S3. primers

PCR usado para amplificar e sequência

CHTF18, ESCO1,

e

MRE11A

na tela a validação

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s010

(DOC)

Tabela S4.

Estado de instabilidade de microssatélites,

MSH6

,

ESCO1

,

CHTF18

,

MRE11A

, e

ATAD5

para o 107 tumores do endométrio neste estudo

doi: 10.1371. /journal.pone.0063313.s011

(XLSX)

Tabela S5.

frequência de mutações somáticas no

ESCO1

,

CHTF18

,

MRE11A

, e

ATAD5

genes de coesão em 105 tumores do endométrio, de acordo com instabilidade de microssatélites e

Status MSH6

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s012

(XLSX)

Reconhecimentos

Agradecemos aos nossos colegas para leitura cuidadosa do manuscrito e discussão pensativa.