Abstract
O oncogene FOXM1 tem sido implicado em todos os principais tipos de câncer humano. Recentemente, mostrou que a expressão aberrante provoca FOXM1 expansão do compartimento de células estaminais resultando na iniciação da hiperplasia. Nós temos mostrado previamente que FOXM1 regula
INFERNOS
, um SNF2 /helicase envolvido na metilação do DNA, implicando
FOXM1
na regulação epigenética. Aqui, nós demonstramos usando queratinócitos primários humanos normais orais (NOK) que a regulação alta de
FOXM1
suprimido o gene supressor de tumor
p16
INK4A
(
CDKN2A
) através hipermetilação do promotor. Knockdown de
INFERNOS
usando siRNA reactivou a expressão de mRNA de
p16
INK4A Comprar e downregulation concomitante de dois metiltransferases de DNA
DNMT1
e
DNMT3B
. A regulação positiva dependente da dose do endógena
FOXM1
(isoforma B) expressão durante a progressão do tumor através de um painel de estirpes normais NOK primário (n = 8), displasias (n = 5) e cabeça e pescoço de células escamosas carcinoma ( CECP) linhas de células (n = 11) foi positivamente correlacionada com expressões endógenas de
INFERNOS
,
BMI1
,
DNMT1
e
DNMT3B
e negativamente com
p16
INK4A Comprar e involucrina. modificação bissulfito e análise promotor específico de metilação usando absoluta de PCR quantitativa (qPCR-MS) mostrou que a regulação positiva de
FOXM1
induzida significativamente
p16
INK4A
hipermetilação do promotor (10 vezes, P 0,05) em células primárias de coroas norueguesas. Usando um promotor metilação método microarray análise ao nível do genoma não-viés, revelou que aberrante
expressão FOXM1
em NOK principal induziu um padrão de hipometilação global, semelhante ao encontrado em um HNSCC linha de células (SCC15). Na sequência de experimentos de validação usando absoluta qPCR, identificamos um conjunto de genes diferencialmente metilados, encontrou a ser inversamente correlacionada com
in vivo
níveis de amostras de biópsia do tumor CECP clínica de expressão de mRNA. Este estudo forneceu a primeira evidência, usando primário células humanas e tecidos tumorais normal, que a regulação alta aberrante de
FOXM1
orquestrado uma assinatura de metilação do DNA que imita a paisagem methylome câncer, a partir do qual nós identificamos um único
FOXM1
induzida por assinatura epigenética que pode ter potencial translacional clínicos como biomarcadores para o rastreio do cancro precoce, diagnóstico e /ou intervenções terapêuticas
Citation:. Teh MT, Gemenetzidis e, Patel D, Tariq R, Nadir A, Bahta AW, et ai. (2012) FOXM1 induz uma assinatura global de metilação que imita o Epigenome Câncer de Cabeça e Pescoço carcinoma espinocelular. PLoS ONE 7 (3): e34329. doi: 10.1371 /journal.pone.0034329
editor: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América
Recebido: 28 de novembro de 2011; Aceito: 26 de fevereiro de 2012; Publicado: 26 Março 2012 |
Direitos de autor: © 2012 Teh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi co-financiado pelo Wellcome Trust (MTT, EG), a Cirurgia Facial Research Foundation – Saving Faces (MTT, AW) e do Instituto de Odontologia (DP, RT, AN), Barts e da London School of Medicina e Odontologia, queen Mary University of London. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Compreender o mecanismo epigenético regulação determinação destino de células-tronco fornece insights fundamentais para a fisiologia da regeneração de tecidos e patogênese do câncer. O mecanismo epigenético melhor estudada perturbado durante o início e progressão do cancro é a metilação do DNA, que quimicamente adiciona grupos metil para citosinas em suas “posições 5, predominantemente no dinucleótidos CpG no ADN genómico de mamíferos [1]. metilação do DNA envolve três metiltransferases de ADN-chave: DNMT1, DNMT3A e DNMT3B. DNMT1 tem sido classicamente implicados na manutenção de DNA metilado existente, que, DNMT3A e DNTM3B em
de novo
de metilação do DNA [1]. A natureza hereditária da metilação do DNA permite que as células para determinar a potência da célula /destino sem alterar a sequência primária de ADN genómico. A reversibilidade da programação de metilação do DNA torna especificação de destino celular altamente plástico e reversível. reprogramação epigenética envolvendo alterações na metilação do DNA tem sido implicado em todas as fases de evolução do cancro [2], [3]. Também tem sido mostrado que a reprogramação epigenética precede a iniciação de células estaminais /progenitoras-cancerosas como a [4]. É agora bem aceite que as células cancerosas explorar as propriedades reversíveis e hereditárias de metilação do DNA para perturbar o equilíbrio entre a renovação das células estaminais /progenitoras e diferenciação promovendo assim a iniciação e progressão do cancro [2], [3], [4].
FOXM1 (isoforma B) foi encontrado pela primeira vez para ser um alvo a jusante de uma via de sinalização oncogénica de sonic Hedgehog através de um fator de transcrição dedo de zinco família glioma 1 (Gli1) em carcinomas basocelulares [5]. Estudos subsequentes revelaram que FOXM1 foi ubiquamente regulada positivamente na maioria dos cancros humanos [6], [7], que incluem cérebro, do fígado, da mama, do pulmão, estômago, pâncreas, cólon, rim, bexiga, próstata, testículos, ovário, útero, cérvix , sangue (leucemia mielóide aguda), melanoma cutâneo, cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas [8], [9].
na busca de compreender o mecanismo oncogênico de FOXM1, temos demonstrado recentemente que FOXM1 induz o câncer iniciação, promovendo adulto renovação epitelial humana de células tronco /progenitoras e antagonizando diferenciação [10]. Outros demonstraram que FOXM1 desempenha um papel fundamental na manutenção da renovação das células tronco /progenitoras através de genes de pluripotência incluindo
Oct4
,
Nanog
,
Sox2
e
Bmi1
[11], [12]. Nosso trabalho anterior identifica um alvo a jusante FOXM1
INFERNOS
[8], um fator de células-tronco embrionárias /específicas do linfóide SNF2 /helicase humano envolvido na remodelação da cromatina e metilação do DNA [13], [14], implicando FOXM1 em regulação epigenética durante a renovação /células progenitoras do fuso [8], [10]. No entanto, não ficou claro se FOXM1 tem um papel na regulação epigenética. Neste estudo, usando queratinócitos primários humanos normais orais e linhas de células tumorais (CECP) de cabeça e de carcinoma de células escamosas do pescoço e tecidos de biópsia do tumor, nós investigamos o papel de FOXM1 na regulação do gene promotor metilação, tanto único gene e os níveis do genoma . Isto levou à primeira evidência em células primárias humanas normais orais epiteliais que FOXM1 induz uma paisagem metilação semelhante a uma epigenoma câncer encontrada em tecidos tumorais HNSCC.
Métodos
Tecidos clínicos
o uso de tecidos humanos neste estudo foi aprovado pelos nossos instituições de acolhimento (Barts o London NHS Trust e da Escola de Medicina Odontologia, queen Mary University of London) e do Comité de Ética da UK National Research. Todas as amostras clínicas, que eram excedente para o diagnóstico, foram recolhidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética local e escrito consentimento do paciente informado foi obtido de todos os participantes. Pares de biópsias de tecidos de margem e tumor HNSCC núcleo normais foram histopatológica pré-validado por nossos patologistas colaboradoras antes da utilização para este estudo. amostras de tecido de biópsias frescas foram preservados em RNA
Mais tarde
(Cat # AM7022, Ambion, Applied Biosystems, Warrington, UK) e armazenadas a curto prazo em cada 4 ° C (1-2 dias) ou -20 ° C (até 1 semana) antes do transporte e subsequente armazenamento a longo prazo a -80 ° C até à sua utilização.
cultura celular
Todos os queratinócitos humanos normais primárias orais (OK355, HOKG, OK113, NOK, NOK1, NOK3, NOK16 e NOK376) foram extraídas de tecidos mucosa oral normal doados por indivíduos saudáveis livres da doença submetidos a extração do dente do siso e cultivadas como descrito anteriormente [8], [15]. linhas de células displásicas pr�cancro Oral (OKF6 /T [16], POE9n [17], DOK [18], D19 [19], D20 [19]) e linhas de células CEC oral (SCC4 [20], SCC9 [20], SCC15 [20], SCC25 [20], SqCC /Y1 [21], UK1 [22], VB6 [22], CaLH2 [22], CaDec12 [22], 5PT [22], H357 [22]), SVpgC2a [23 ] e SVFN1-8 [8] foram todos bem estabelecido linhas celulares cultivadas como descrito anteriormente [8], [10], [15].
imunotransferência
extracção de proteínas e separação por SDS géis -Página e imunotransferência foi realizada como previamente descrito (5). Um anticorpo monoclonal de ratinho para p16
INK4A (diluição 1:2000; Cat # 551154, BD Biosciences) e um anticorpo policlonal de coelho anti-GAPDH (diluição 1:20,000; Cat # 9485, Abcam) foram usadas para imunotransferência
.
RNA de interferência
siHELLS pré-validado específico do gene (ON-TARGETplus SmartPool iNFERNOS, Cat # L-017444-09,10,11,12), controlar siCTRL (ON-TARGETplus não-alvo Piscina , Cat # D-001810-10-05) e o reagente de transfecção siRNA (DharmaFECT 1, Cat # T-2001-02) foram adquiridos da Dharmacon, Thermo Fisher Scientific. Uma experiência de dose-resposta inicial foi realizada de acordo com as instruções do fabricante para determinar a eficácia óptima de transfecção. siRNA a 10 nM (48 horas de incubação) verificou-se ser a concentração final óptima que foi, portanto, utilizada em todas as experiências subsequentes. O efeito do silenciamento do gene foi validado pela quantificação da expressão de mRNA do gene alvo (
INFERNOS
) por transcrição reversa absoluta qPCR.
transdução retroviral
retrovirais sobrenadante e transdução procedimentos foram realizada utilizando nossos protocolos estabelecidos [8], [10], [15]. níveis iguais de
EGFP
e
FOXM1
(isoforma B) expressão foram obtidos por meio de experiências de titulação sobrenadante retroviral de série e, posteriormente,
EGFP
plasmídeo número confirmado por qPCR utilizando DNA genômico copiar extraída a partir de células transduzidas de acordo com o nosso método previamente estabelecida [15]. Os níveis de ectópica
expressão FOXM1
nos queratinócitos primários foram titulados para replicar níveis encontrados em células cancerígenas conforme relatado anteriormente [8], [10], [15] (ver Figura 1C). transduzidas células foram cultivadas por 3-5 dias para permitir a expressão do transgene antes de experimentar.
(A) FOXM1 suprime significativamente
p16
INK4A
mRNA e expressão de proteínas (figura inserção) no ensino primário queratinócitos humanos normais. GAPDH foi usada como um controlo para a carga de proteína. As células de controlo (mock-transduzidas com partículas retrovirais vazias ou transduzidas-EGFP) não mostraram significativa supressão de p16
expressão INK4A. (B) Knockdown de um gene FOXM1-alvo
INFERNOS
, que regula a metilação do genoma [14], induzida
p16
INK4A
e simultaneamente suprimida
DNMT1
e
DNMT3B
, mas não
DNMT3A
expressão de mRNA em uma linha de células malignas transformou-FOXM1 (SVFN5) expressando níveis constitutivos de endógena
INFERNOS
[8]. Cada barra representa a média ± SEM de transfecção em triplicado (48 h) ou com siCTRL ou siHELLS. * P 0,05, ** P 0,01 e *** P 0,001 indicar o nível de significância estatística em comparação com os controlos. (C) endógena
FOXM1
(isoforma B) níveis de expressão de mRNA em 8 cepas de queratinócitos orais normais humanas primárias, 5 displásicos e 11 linhas de células de carcinoma epidermóide. Total
FoxM1
níveis de expressão de mRNA foram medidos no EGFP e traduzidas-FOXM1 NOK (NOKG e NOKF), respectivamente. (D-J) análises de regressão polinomial de terceira ordem foram realizadas para obter o R
2 valores de coeficiente de determinação que indicam a importância da co-expressão entre cada gene com
FOXM1
através das linhagens de células 24 /linhas indicadas no painel C.
Preparações Ácidos nucleicos de tecidos e células
Todas as biópsias de tecido foram digeridos por proteinase K (Cat # 03115887001, Roche Diagnostics Ltd., Inglaterra, Reino Unido) antes da extração simultânea mRNA (kit Dynabeads mRNA direta, Cat # 610,12, Invitrogen) e DNA genômico (gDNA) extracção (pelo método phenol:chloroform padrão em lystates mRNA-esgotados). mRNA foi imediatamente transcrição reversa para (kit transcriptor cDNA Synthesis, Cat # 04897030001, Roche Diagnostics) cDNA. ADNg foram fragmentadas por
MseI
digestão (37 ° C, 16 h) antes de enriquecimento para ADN CpG-metilado utilizando um sistema baseado em esférulas magnéticas MBD2b /MBD3L1-conjugado de acordo com o protocolo do fabricante (kit de ultra MethylCollector, gato # 55005, o Active Motif Europa, Bélgica).
Genome-wide metilação do promotor Profiling
de acordo com o protocolo e as exigências do fabricante, a entrada
MseI
-digested gDNA e metilação enriquecido DNA de cada amostra de células (NOKG, NOKF e SCC15) foram amplificados para gerar 6 ug de ADN utilizando WGA2 GenomePlex (Sigma) antes das experiências microarray realizadas pelo serviço de microarray Roche NimbleGen usando DNA humano metilação 3x720K CpG Ilha Além disso RefSeq Promotor array (Cat # 05 924 600 001; NimbleGen Sistema, Reykjavik, Islândia) com base no genoma construído HG18, com o promotor a montante lavoura /jusante da -2.44 /+ 0,61 kb, abrangendo um total de 27,728 ilhas CpG em todo o genoma inteiro (GEO Plataforma: GPL14361). dados de microarranjos gerados neste estudo é Miame compatível e foi depositado em um banco de dados compatível Miame em Gene Expression Omnibus repositório (GEO Series número de acesso: GSE31767)
em tempo real absoluta PCR quantitativo
. padrão em tempo real baseada em curva absoluta de PCR quantitativa foram realizados utilizando SYBR Green I Mestre (Cat # 04887352001, Roche Diagnostics Ltd., Inglaterra, Reino Unido) na poços 384 LightCycler 480 sistema de qPCR (Roche) de acordo com os nossos protocolos estabelecidos [8] [9], [15], que são MIQE compatível [24]. Foram realizadas as condições de PCR específica à metilação, tal como descrito anteriormente [25], [26]. Todos os iniciadores utilizados neste estudo estão listados na Figura S1. Anteriormente iniciadores FOXM1 de isoformas específicas validadas-B foram utilizadas para quantificar especificamente FOXM1 (isoforma B) a expressão de ARNm neste estudo [8]. Todos os genes alvo foram normalizados para dois genes de referência estáveis (YAP1 e POLR2A) previamente validados para estar entre os genes de referência mais estáveis através de uma ampla variedade de células, displásicas e células de carcinoma epidermóide linhas orais primários humanos [8].
resultados e Discussão
Dada a nossa conclusão anterior de que FOXM1 (isoforma B) promoveu a renovação /células progenitoras-tronco através de perturbar a via de diferenciação [10], que inicialmente questionou o envolvimento de um gene supressor de tumor
p16
INK4A
(
CDKN2A
) dado que tem sido mostrado para regular a diferenciação de células estaminais /progenitoras epiteliais [27] e é o gene mais vulgarmente inactivado em cancro [28]. Aqui, mostramos que ectópica
FOXM1
expressão suprimida tanto mRNA e expressão de proteína p16
INK4A em queratinócitos humanos primários orais (Figura 1A). Infelizmente, conforme relatado anteriormente silenciar endógena
FOXM1
expressão provoca a parada do ciclo celular [29], que impediu a continuação experimentos usando RNAi nos queratinócitos humanos primários notoriamente sensíveis orais [8], [10]. No entanto, o nosso
FoxM1
experimentos superexpressão mostram conclusivamente que
FOXM1
upregulation suprimida
p16
INK4A
expressão gênica nos queratinócitos orais humanas primárias. Isto está de acordo com as conclusões anteriores de que
FOXM1
suprime a via senescência mediada pela
p16
INK4A
em células de câncer [30].
Inactivação de
p16
INK4A
expressão do gene pode ser um resultado de um certo número de mecanismos, incluindo a deleção do gene e a hipermetilação do promotor. Dado que os objectivos FoxM1
INFERNOS
que regula de metilação do DNA [13], [14], que a hipótese de que FOXM1 podem suprimir
p16
INK4a
expressão através de hipermetilação do promotor via
INFERNOS
. Para testar isso, nós knockeddown
INFERNOS
por siRNA em uma linha de células de CECP SVFN5, um vestibular oral, linha de queratinócitos SVpgC2a transformado induzida por FOXM1 [8], que expressa níveis elevados de endógena
INFERNOS Comprar e baixos níveis de
p16
INK4A
. Isso faz com que re-activação da expressão de mRNA de
p16
INK4A
(Figura 1B) e downregulation concomitante de dois metiltransferases de DNA
DNMT1
e
DNMT3B
mas nenhum efeito sobre a expressão
DNMT3A
. O fato de que
p16
INK4A
inibição poderia ser reativado argumenta contra deleção do gene como um mecanismo para
p16
INK4A
inativação. Os nossos resultados são consistentes com descobertas anteriores de que
INFERNOS
interage com
DNMT1
e
DNMT3B
[31] para suprimir
p16
INK4A
expressão gênica [32] através de modificações epigenéticas.
Para validar ainda mais que a expressão de
FOXM1
,
INFERNOS
e
p16
INK4A
genes correlacionados com progressão do câncer e se existem quaisquer associações com genes envolvidos na metilação do DNA, foram medidos os níveis de
FOXM1
,
p16
INK4A
,
INFERNOS
endógena de expressão de mRNA ,
BMI1
, involucrina (
IVL
, um marcador de diferenciação foi mostrado para ser regulada negativamente pela
FOXM1
[10]) e 3 metiltransferases chave de DNA (
DNMT1
,
DNMT3A
,
DNMT3B
) em um painel de 24 celulares estirpes /linhas de produção de 8 cepas de queratinócitos humanos normais orais primários (a partir de tecidos mucosa oral normal), 5 displasia e 11 linhas de células de carcinoma epidermóide.
de acordo com os achados anteriores [8], [10],
FOXM1
mostrou regulação positiva dependente da dose durante a progressão do tumor de displasia para CECP (Figura 1C). Do outro lado do painel de 24 celulares estirpes /linhas, descobrimos que a expressão de mRNA endógeno da
FOXM1
correlação inversa com
p16
INK4A
mas a eficiência correlação foi fraca (R
2 = 0,23, Figura 1D). A regulação negativa da
p16
INK4A
expressão foi encontrado para ser mais pronunciado em displásicos em comparação com linhas de células de carcinoma epidermóide. Tal
p16 padrão
INK4A
expressão é inteiramente de acordo com
em p16 vivo
INK4A
padrão de expressão de proteínas encontradas na displasia oral e tecidos SCC [33]. Consistentemente,
BMI1
, um grupo oncogene Polycomb que é um regulador a montante do
p16
INK4A
gene [34] e também um alvo a jusante de FOXM1 [12], [30], mostrou co-expressão positiva com
FOXM1
(R
2 = 0,64, Figura 1E), mas correlação inversa fraca com
p16
INK4A
(R
2 = 0,42, dados não mostrados) suporta a evidência de que
p16
INK4A
expressão é regulada de forma independente pela
BMI1
durante a carcinogênese oral [35]. Os níveis de expressão discordante entre
FOXM1
e
p16
INK4A
no câncer de células pode ser devido ao fato de que
p16
INK4A
pode ser desregulamentado por meio de um número de diferentes mecanismos, tais como a mutação de inactivação (pode resultar na supra-regulação devido ao mecanismo de feedback), a deleção do gene, amplificação de genes (gene funcional de sinalização a jusante, mas com defeito), a hipermetilação do promotor, etc. Isto pode resultar em diferentes
p16
INK4A
expressão independente do
FoxM1
níveis nas linhas celulares “câncer”. Assim, enquanto
FOXM1
pode induzir a hipermetilação do promotor de
p16
INK4A
em células “normais”, tal efeito pode ser perturbada em células “câncer”.
Expression de
DNMT1
(R
2 = 0,84; Figura 1H) e
DNMT3B
(R
2 = 0,89; Figura 1J), mas não
DNMT3A
(R
2 = 0,13; Figura 1I), mostrou co-expressão positiva significativa com a
FOXM1
que estão de acordo com as nossas conclusões anteriores (Figura 1B) que silenciar a
FOXM1 viajantes – alvo a jusante
INFERNOS
levou a regulação baixa concomitante de
DNMT1
e
DNMT3B
mas nenhum efeito sobre a expressão
DNMT3A
. Não está claro porque
DNMT3A
não foi afetada. literatura publicada indica que, embora ambos
DNMT3A
e
DNMT3B
estão envolvidos em
de novo
atividade metiltransferase, eles servem papéis não-sobrepostos [1]. No entanto, o envolvimento de ambos
DNMT1
e
DNMT3B
implica um papel para
FOXM1
e
INFERNOS
no desencadeamento tanto manutenção e
de novo
atividades de metilação do DNA [1]. Expectedly,
INFERNOS
foram positivamente (R
2 = 0,76, Figura 1F) e
IVL
foram negativamente (R
2 = 0,52, Figura 1G) correlacionada com a
FOXM1
como mostrado anteriormente [8], [9], [10]. Colectivamente, estes resultados fornecem a primeira evidência em células humanas que
FOXM1
pode estar agindo através de
INFERNOS
,
DNMT1
e
DNMT3B
para suprimir
p16
INK4A
expressão do gene. Dado que
INFERNOS
,
DNMT1
e
DNMT3B
tenham sido previamente mostrado modular
p16
INK4A
metilação do promotor [31], [32 ], que a hipótese de que
FOXM1
pode estar desencadeando
p16
INK4A
silenciamento de genes através de hipermetilação do promotor.
Para investigar promotor CpG metilação do DNA, nós quantificamos o nível de
p16
INK4A
promotor metilação usando modificação bissulfito e PCR quantitativo específico da metilação (MS-qPCR; Figura 2A e Figura S1). Superexpressão de
FOXM1
, mas não
EGFP
, foi encontrado para induzir
p16
INK4A
hipermetilação do promotor (P 0,05), que foi significativamente revertida (P 0,001 ) por um agente de desmetilação de ADN 5-aza-2′-desoxicitidina (5Aza) em queratinócitos humanos primários orais (Figura 2B). Estes resultados confirmam o papel de
FOXM1
na supressão
p16
INK4A
expressão através hipermetilação do promotor. Em apoio a
FOXM1
em iniciar oncogênese através da inibição da
p16
INK4A
, tem sido mostrado que o silenciamento epigenético de
p16
INK4A
induz celular imortalização em fibroblastos de rato embrionários [36]. Além disso, a nossa verificação anterior de que
FOXM1
expressão co-expresso com uma epiteliais ΔNp63α marcador de células estaminais no caule proliferando /progenitoras de queratinócitos subpopulação oral [10], e que ΔNp63α foi mostrado para segmentar
HELLS
para induzir a formação de carcinoma de células escamosas em ratos [37], em conjunto sugerem um papel possível para
FOXM1
(via
INFERNOS
) no desencadeamento oncogênese através silenciar
p16
INK4A
. O mecanismo exato oncogênico está além do escopo deste estudo. No entanto, nossos dados atuais fornecem a primeira evidência de que
FOXM1
é capaz de induzir a hipermetilação do promotor em um nível único gene oferece um vislumbre da possibilidade de que a regulação positiva aberrante de
FOXM1
pode perturbar a regulação epigenética da metilação do DNA, a nível de todo o genoma.
(a) modificação Bissulfito e metilação específica absoluta qPCR para a quantificação do
p16
INK4A
estado de metilação do promotor. O ADN genómico foi primeiro tratada com bissulfito de sódio antes da PCR pré-amplificação da região promotora de
p16
INK4A
(PCR
BS, 273 pb). A metilação específica (p16M-R /F) e-metilação independente (p16U-F /r) sequências iniciadoras foram então usadas para quantificar os níveis relativos de produtos metilados e não metilados no PCR
amostra BS usando padrão da curva baseada método qPCR absoluta para cada produto, respectivamente. A análise de fusão foi realizada para validar a especificidade de qPCR em detectar os dois produtos M e U. (B) a conversão bissulfito e de metilação específico qPCR foram realizados para medir os níveis relativos de não metilado (U, que funde temperatura a 85,8 ° C) e metilado (M, 91,2 ° C) ou em ambos os EGFP- NOK primária transduzidas-FOXM1 tratados quer com veículo (DMSO) ou 5Aza (1 uM, incubação de 3 dias com reposição de droga fresco diariamente). Um total de N = 11 réplicas de pelo menos 4 expericias independentes foram executadas. Estatísticos notações de significância t-teste * P 0,05 e *** P . 0.001
Nós e outros previamente estabelecido um papel central para
FOXM1
na manutenção da estabilidade do genoma pelo qual aberrante
FOXM1
expressão provoca instabilidade genômica mundial [8], [15], [38]. Além disso, as conclusões de que
FOXM1
visa uma epigenética /haste modulador celular
INFERNOS
durante o início do câncer [8], [14] e
FOXM1
induz diretamente
p16
INK4A
hipermetilação do promotor (Figura 2) nos levou a hipótese de que a regulação positiva aberrante de
FOXM1
perturba o methylome. Para testar esta hipótese, foi realizada uma não-preconceito de todo o genoma perfis promotor metilação microarray em queratinócitos humanos normais orais primários (NOK) quer superexpressão de um gene de controle
EGFP
(NOKG) ou
FOXM1
(NOKF) (ver Figura 1C para
FoxM1
níveis de expressão de genes de células NOKG e NOKF), e também em uma linha de células de CECP (SCC15). SCC15 foi escolhido neste estudo como um controlo positivo, porque o promotor de
p16
INK4A
gene (CDKN2A) foi previamente mostrado para ser hipermetilado e pode ser reativado por 5Aza [39], portanto, o que nos permite validar os dados da matriz de metilação.
FOXM1
foi encontrada para induzir um padrão global de hipometilação semelhante ao encontrado na linha de células de carcinoma epidermóide, em comparação com células de controlo que expressam NOK
EGFP (Figura 3A). Comparando-se os padrões de metilação por correlação análises de regressão entre os três tipos de células (NOKG, NOKF e SCC15), única NOKF vs SCC15 deu um padrão de correlação positiva, enquanto NOKF ou SCC15 cada produziu uma correlação inversa com a NOKG controle (Figura 3B). Isto indica que a sobre-expressão de
FOXM1
, mas não
EGFP
, induz uma paisagem metilação semelhante ao encontrado em SCC15. Ambos hipometilação global e focal hipermetilação (afectando os genes individuais) são padrões de metilação típicas encontradas no cancro [2], [3]. O fato de que a regulação positiva de FOXM1 induz estes padrões de metilação em células “normais” indica que a expressão aberrante de FOXM1 está mudando o cenário de metilação para com aqueles de câncer. A consequência de hipometilação global tem sido demonstrado causar instabilidade genómica [2], [3], isto pode proporcionar um mecanismo para as nossas descobertas anteriores de que a expressão aberrante provoca FOXM1 instabilidade genómica nos queratinócitos humanos normais primárias [8], [15]. Embora hipometilação mundial parecia ser o efeito dominante, foi demonstrado que a hipermetilação focal silenciamento de genes-chave supressores de tumor (por exemplo.
p16
INK4A
) também desempenha um papel importante na oncogénese [2], [3] .
(A) Genome-wide análise promotor microarray de queratinócitos orais normais primárias humanas que expressam tanto
EGFP
(NOKG, pontos pretos) ou
FOXM1
(NOKF, pontos amarelos ) e uma linha de células de carcinoma de células escamosas estabelecida (SCC15, pontos vermelhos). Cada ponto representa um único gene. (B) Um não-linear de 2
ND fim análises de regressão polinomial foram realizadas sobre os padrões de metilação relativos entre NOKG vs NOKF (correlação inversa), NOKG vs SCC15 (correlação inversa) e NOKF vs SCC15 (correlação positiva). critérios de selecção Gene (C) para genes diferencialmente metilados entre o controle (NOKG) e grupos de testes (NOKF e SCC15). 100 mais hipermetilado e 100 maioria dos genes hypomethylated foram inversamente combinado com genes diferencialmente metilados de NOKF e SCC15. As listas de genes adjacentes mostram o (também encontrado em SCC15) induzida por FOXM1 diferencialmente hipermetilado pré-seleccionados (vermelho) e genes hypomethylated (verde) em comparação com células de controlo NOKG. Os CDKN2A (codifica
p16
INK4A
) do gene, o seu promotor conhecido por ser hipermetilado em HNSCC, foi incluído como um controlo positivo para a hipermetilação do promotor. (D) correlação amostra de tecido tumoral clínica entre os níveis relativos de metilação e expressão do gene de cada gene finalistas em uma coorte de 10 pacientes com margem normal, emparelhados e amostras de tecido tumoral CECP. Cada ponto representa a média ± SEM de cada gene. barras de erro verticais foram derivados a partir da expressão do gene relativo de pares de tecidos de 10-margem de tumor e as barras de erro horizontais foram derivadas de metilação do promotor relativa de 3 NOK primário independente (/NOKF NOKG) experiências. O coeficiente de correlação (R
2) de um não-linear 2
nd análises de regressão polinomial de ordem foram realizados em todos os genes 30 candidatos (painel esquerdo), 16 genes hypermethylated (painel do meio) ou 14 genes hypomethylated (painel da direita) , respectivamente.
Para validar nossa hipótese de que
FOXM1
-orchestrated uma assinatura metilação que imita um methylome câncer, genes diferencialmente metilados (100 mais hypomethylated e 100 mais hypermethylated) foram inicialmente selecionados para comparações inversas entre NOKG e NOKF /SCC15, e um subconjunto de 30 genes de consenso, compartilhados entre as células NOKF e SCC15, com oposição estado de metilação de NOKG células de controlo, foram posteriormente seleccionados para análises posteriores (Figura 3C). Se estes candidato
FOXM1
induzida por genes diferencialmente metilados eram de fato uma assinatura epigenética do cancro, que a hipótese de que tecidos tumorais HNSCC deve manter um inverso
in vivo
mRNA assinatura destes genes candidatos expressão. Para verificar isso, realizamos absoluta qPCR para quantificar cada um dos genes 30 candidatos: i, os níveis relativos de metilação do DNA promotor de cada gene em NOKG vs células NOKF, e, ii, os níveis de expressão de mRNA relativas na margem normal, emparelhado vs HNSCC amostras de tecido de tumor. Análises de correlação de regressão dos genes 30 candidatos mostrou uma relação inversa (R
2 = 0,62; Figura 3D, painel esquerdo). Entre a expressão genética dos tecidos tumorais HNSCC e metilação do DNA de células NOKF
Curiosamente, hypomethylated genes mostraram significativamente maior padrão de correlação inversa (R
2 = 0,92; Figura 3D, painel direito) do que os genes hypermethylated (R
2 = 0,27; Figura 3D, painel do meio). Isto sugere que o promotor de hipometilação exibiram um efeito mais forte na activação da transcrição em comparação com a hipermetilação do promotor em repressão transcricional. Uma explicação pode ser que pode ser mais fácil para detectar a activação da transcrição a seguir hipometilação do promotor em oposição a detecção de repressão de transcrição, que depende do facto de os genes foram activadas antes da hipermetilação. Os nossos resultados indicam que hipo /hipermetilação pode não ser uma simples simétrico interruptor on /off para a transcrição do gene. Mais estudos são necessários para delinear os mecanismos de transcrição regulados pelo DNA metilação do promotor /desmetilação.
Da lista de 15 romance
FOXM1
induzida por genes hypermethylated (Figura 3D, painel do meio), 4 genes (
C6orf136
,
MGAT1
,
NDUFA10
e
PAFAH1B3
) tinha reprimidos de forma significativa os níveis de expressão de mRNA em tumores CECP, juntamente com o controlo positivo
p16
INK4A
(
CDKN2A
). informações gene pouco publicou estava disponível para
C6orf136
.