Sumário

Os microRNAs (miRNAs) desempenham papéis importantes em vários processos biológicos e estão intimamente associados com o desenvolvimento de câncer. De facto, a expressão aberrante de pequenos RNAs tem sido implicada em numerosos cancros. No cancro cervical, o miR-203 diminuiu os níveis são, embora a causa desta expressão aberrante permanece obscura. Neste estudo, investigar os mecanismos moleculares que regulam o miR-203 a transcrição do gene. Nós identificar o local de início da transcrição miR-203 por amplificação rápida 5 ‘do cDNA extremidades e, posteriormente, identificar a região do promotor do miR-203. Promotor análise revelou que IRF1, um factor de transcrição, regula o miR-203 a transcrição por ligação ao promotor de miR-203. Também demonstramos que o miR-203 alvos região não traduzida a 3 ‘de

BANF1, downregulating assim a sua expressão, enquanto que o miR-203 a expressão é conduzida pelo IRF1. MiR-203 está envolvida na regulação do ciclo celular e a sobre-expressão de miR-203 suprime a proliferação de células de cancro do colo do útero, a formação de colónias, migração e invasão. O efeito inibidor de miR-203 em células cancerosas é parcialmente mediada pela downregulating seu alvo,

BANF1

, uma vez que knockdown de

BANF1

também suprime a formação de colónias, migração e invasão.

Citation: Mao L, Zhang Y, Mo W, Yu Y, Lu H (2015)

BANF1

é regulada negativamente pelo regulada-IRF1 MicroRNA-203 em Câncer cervical. PLoS ONE 10 (2): e0117035. doi: 10.1371 /journal.pone.0117035

Editor do Academic: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, United States |

Recebido: 15 Agosto, 2014; Aceito: 17 de dezembro de 2014; Publicação: 06 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Mao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação.

Introdução

Estima-se que aproximadamente 30% dos genes humanos são regulados por miRNAs. A desregulação de miARN pode alterar os níveis de expressão de genes alvo, resultando em processos celulares anormais [1]. Recentemente, vários estudos têm demonstrado que a expressão aberrante de microARNs (miARNs) está implicado em numerosos estados de doença e que esta expressão está estreitamente associada com o desenvolvimento de malignidades humanas [2]. Além disso, alguns miARNs têm sido explorados como potenciais marcadores para o diagnóstico ou prognóstico de doenças humanas [3-6]. Portanto, os mecanismos envolvidos na miRNA desregulamentação são uma questão de investigação urgente e importante.

Os mecanismos que levam à expressão aberrante de miRNAs ainda não estão completamente esclarecidos. miARNs são normalmente transcrito pela ARN-polimerase II em miARNs primárias (pri-miARNs), que são processados ​​por Drosha para pré-miARNs e, em seguida, ainda clivado por Dicer para miARNs curtas, maduras [7,8]. Teoricamente, a expressão aberrante de miARN pode ser causada por vários mecanismos, incluindo deleções, mutações e amplificações envolvendo miARN loci, modificações epigenética e a desregulação de factores de transcrição que têm como alvo miARNs específicos. No nível genômico, anormalidades cromossômicas e modificações epigenéticas, incluindo mutações, CpG ilha metilação e modificações das histonas repressivas, são responsáveis ​​por miRNA silenciar no câncer. No nível transcricional, miRNAs interagir com fatores de transcrição e inibidores de transcrição para criar um equilíbrio dinâmico que regula a sua expressão [1].

O câncer cervical é um dos cânceres mais comumente diagnosticados e a principal causa de mortes por câncer em mulheres em todo o mundo, respondendo por 9% dos novos casos de cancro e 8% do total de mortes por câncer entre as mulheres [9]. miARN expressão aberrante foi encontrado no cancro do colo do útero [10-12], e um grande número de funções de miARN aberrantes foram relatados globalmente [13]. No entanto, a maioria dos estudos têm-se centrado na expressão aberrante de miARN, enquanto os mecanismos envolvidos na miARN desregulação são menos relatado.

miR-203 tem sido relatado para ser desreguladas e para funcionar como um supressor tumoral no carcinoma hepatocelular, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de esôfago e câncer cervical [14-18]; No entanto, o mecanismo que conduz à expressão aberrante de miR-203 não é completamente claro. Neste estudo, identificar o sítio do início da transcrição de miR-203 (TSS) em 5 ‘de amplificação rápida de extremidades de ADNc (5’ RACE) e, subsequentemente, identificar a sequência do promotor de miR-203. Nós demonstramos que o miR-203 alvos região 3 ‘não traduzida (3’UTR) de

BANF1

, assim downregulating

BANF1

expressão, e que o miR-203 a expressão é conduzida pelo factor de transcrição IRF1 . Nosso estudo estabelece uma via de sinalização linear de

IRF1

para

BANF1

que podem contribuir para a

BANF1

tumorigênese induzida em câncer cervical. Este trabalho contribui para a compreensão abrangente do mecanismo de progressão do cancro do colo do útero mediada por HPV.

Materiais e Métodos

Ética declaração

tecidos de câncer do colo do útero Humanos e adjacentes tecidos cervicais normais foram coletadas de Shanghai Changhai Hospital (Xangai, China). Todos os pacientes forneceram consentimento por escrito, eo estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética de Shanghai Changhai Hospital e da Universidade Fudan (número de referência 2011-120).

cultura de células, moléculas de RNA e transfecção

Cervical linhas celulares de cancro (CaSki e HeLa) foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM, Gibco, EUA) contendo 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS, Gibco) a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera. moléculas de miARN sintéticos, incluindo o miR-203 mímico, inibidor e de controlo negativo, foram adquiridos da Ambion, EUA. Os pequenos RNAs de interferência contra

BANF1 Comprar e controle negativo foram sintetizados por Genepharma (Xangai, China) [19]. As sequências foram as seguintes: siARN-BANF1, 5′-CCAGGUGCAUUUAAAGAAATT-3 ‘e a sequência de controlo, 5′-UUUCUUUAAAUGCACCUGGTT-3’. As células foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

extracção de RNA e PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR)

O ARN total foi extraído a partir de tecidos e células usando TRIzol reagente (Ambion, EUA) e transcrito de forma inversa utilizando o Kit de reagentes PrimeScript RT (Takara, China) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores utilizados são listados na Tabela S1. Para a detecção de miR-203, o ARN foi transcrito de forma inversa por um iniciador de transcrição reversa específica (RT-miR-203). Para a detecção de ARNm, o ARN foi transcrito de forma inversa pela Random 6 meros e iniciador oligo dT. Pré-mistura de SYBR Ex Taq (Takara, China) foi utilizado para quantificar a expressão madura miR-203 e ARNm utilizando o LightCycler 480 II sistema de PCR em Tempo Real (Roche, Alemanha). RNU6B e da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foram utilizados como controlos internos para a expressão de miR-203 e ARNm, respectivamente. níveis de expressão génica relativos foram determinados usando o método de delta Ct [20] e expressas como a média de três experiências independentes ± o desvio padrão.

5 ‘de amplificação rápida de extremidades de ADNc (5’ RACE)

p> o TSS do transcrito primário de miR-203 (a partir de células HeLa) foi determinada utilizando um kit de RACE 5 ‘completa (Takara, China). Dois microgramas de RNA foi utilizado em cada reacção, e HL60 ARN total, a qual foi fornecida no kit, foi utilizado para analisar a extremidade 5 ‘do humano

proibitina

(PHB) gene (produto de PCR de 750 pb) , que serviu como um controlo positivo. Os níveis do transcrito primário de miR-203 foram determinadas por PCR utilizando os iniciadores exteriores e interiores (S1 tabela). Todas as reacções foram realizadas utilizando os mesmos parâmetros como sugerido no manual. Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 1%, detectada, purificada e depois sequenciado.

ensaios de repórter de Dual-luciferase e análise de fator de transcrição

A 3’UTR de

BANF1

foi amplificado a partir de ADN genómico humano de células HeLa e clonado no vector repórter psiCHECK-2 (Promega, EUA), e mutação e eliminação do

BANF1

3’UTR foi conseguida por SOE PCR (splicing do gene por extensão de sobreposição PCR). As células HeLa foram co-transfectadas com os vectores repórter e quer o miR-203 mímico (30 nM) ou controlo negativo miARN mímico (NC, 30 nM). A actividade de luciferase foi medida utilizando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, EUA), e os resultados foram expressos como a razão normalizada de Renilla para a luciferase de pirilampo.

Para o ensaio de repórter de promotor de miR-203, o 744 sequência genómica -bp a montante do miR-203 foi amplificado por PCR e clonado no (Promega, EUA) vector repórter pGL3-Basic. As células HeLa foram co-transfectadas com o vector repórter promotor e pcDNA-IRF1 ou o plasmídeo controlo, pcDNA3.1. Um plasmídeo de luciferase de Renilla, pRL-TK, foi utilizada para normalizar a eficiência da transfecção. As células foram lisadas em 24 ou 48 h após a transfecção, e a actividade da luciferase foi medida com o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, EUA). Os resultados são expressos como a razão normalizada de pirilampo para a luciferase da Renilla e são apresentados como médias ± desvios-padrão de três experiências independentes.

Western blotting

As células foram lisadas em tampão RIPA mais inibidores de protease ( Millipore, EUA). Os lisados ​​foram então sujeitas a SDS-PAGE, electrotransferidas para membranas de PVDF (Millipore, EUA), bloquearam-se com leite magro a 5%, incubadas com anticorpos durante 2 horas à temperatura ambiente, incluindo o anti-beta-tubulina (Abmart, M20005, 1: 2000, China), anti-BANF1 (Santa Cruz, SC-33787, 1: 200, EUA), anti-HRP de coelho (KPL, 4751-1516, 1: 2000, EUA) e anti-rato HRP (KPL, 0751- 1809, 1: 2000, EUA), e visualizada utilizando CECL Reagentes de detecção (CWBIO, China). As imagens foram adquiridas utilizando o sistema Gene Gnome Bio Imagem (Syngene, UK).

cromatina imunoprecipitação (chip) ensaios

ensaios ChIP foram realizadas utilizando o Kit EZ-Magna ChIP Um Dia Cromatina imunoprecipitação (Millipore, EUA) de acordo com o manual de instruções. Resumidamente, aproximadamente 1×10

7 células HeLa foram reticulados e lisaram-se por tampão de lise contendo Inibidor de Protease Cocktail II. Cromatina foi cortado por ultra-sons (alta potência, 10 ciclos de 30 s ‘on’ e 30 s ‘off’; Bioruptor UCD-300, EUA) para um tamanho médio de 200 a 1000 pb, e as amostras de cromatina cortadas foram divididos em 50 alíquotas -μl. Cada alíquota de cromatina (1×10

6 equivalentes de células de cromatina) foi diluído em 450 ul de tampão de diluição. Cinco microlitros (1%) do sobrenadante foi removido como “entrada”, e o anticorpo imunoprecipitação, IRF1 (Abcam, ab26109, 5 ug, Reino Unido), e 20 ul de proteína A pérolas magnéticas foram adicionados ao sobrenadante restante. Finalmente, os complexos imunes foram recolhidos, lavados e eluiu-se, e as ligações cruzadas foram então invertidas. O DNA foi recuperado e analisado por qRT-PCR. Como um controlo negativo, IgG normal de rato foi utilizado para imunoprecipitação.

Ensaios

proliferação celular e formação de colónias

Para os ensaios de proliferação celular, as células CaSki HeLa e foram semeadas em placas de 96 cavidades e foram transfectadas ou com 30 nM de miR-203 de controlo negativo ou mímica e mantidas em meio de crescimento completo, durante 7 dias. A viabilidade celular foi avaliada utilizando um ensaio MTT. Para este ensaio, as células foram semeadas em triplicado, a densidade inicial do mesmo, e a absorvância a 490 nm foi lida num dia sequencial utilizando um leitor de placas (BioTek, EUA). Para os ensaios de formação de colónias, células 200 foram semeadas em placas de 24 poços e incubadas a 37 ° C durante, quer 10 dias (células HeLa) ou 15 dias (células CaSki). As células foram coradas com 0,1% de violeta de cristal e contadas se a colónia continha mais do que 50 células. As experiências foram realizadas em triplicado.

In vitro

migração e invasão ensaios

Invasion e ensaios de migração foram realizados usando 24 poços transpoço câmaras (8 um dos poros da membrana tamanho policarbonato, Corning, EUA), com ou sem 150 ug Matrigel (BD, EUA). Para os ensaios de migração, 5 × 10

4 células em meio isento de soro foram plaqueadas na câmara superior. Para os ensaios de invasão, 1 × 10

5 as células em meio isento de soro foram plaqueadas na câmara superior. O meio com FBS a 10% foram adicionados aos poços inferiores das câmaras. Após 20 horas (células HeLa) ou 26 horas (células CaSki) de incubação, as células que aderiram ao membrana inferior foram fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal a 0,1%. As células que migraram ou invadidas foram contadas e fotografadas utilizando um microscópio invertido IX51 (Olympus, Japão).

A citometria de fluxo ensaios

As células foram transfectadas com 30 nM de miARN imitar em placas de 6 poços, a o meio foi mudado no dia seguinte e as células foram incubadas a 37 ° C durante mais 48 h após a transfecção. Para a análise do ciclo celular, as células foram ressuspensas em solução /PI coloração de NP40 (0,01 mg /ml de iodeto de propídio, 0,1% citrato de Na, 0,0564% de NaCl, 0,025 mg /ml de ribonuclease A, 0,3% de NP-40) e incubados a 37 ° C durante 30 min. As células foram então analisadas quanto ao conteúdo de ADN, utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD, EUA). modelagem do ciclo celular foi realizada utilizando o software Modfit.

t-teste de análise estatística

Student foi utilizado para avaliar as diferenças significativas entre os dois grupos de dados em todas as experiências apropriadas. A

P

valor 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Identificação do promotor de miR-203

Para determinar se miR-203 expressão é. anormal no cancro do colo do útero, de qRT-PCR foi realizada em 20 amostras de pacientes emparelhados e linhas celulares de cancro cervical (HPV 16 + CaSki e HPV 18 + HeLa). Como mostrado na Fig. 1A, miR-203 expressão foi substancialmente reprimidos em tecidos de câncer cervical e linhas celulares que comparam com os tecidos normais adjacentes cervicais. No entanto, o mecanismo desta regulação negativa permanece obscura. Para explorar a regulação da expressão de miR-203 ao nível da transcrição, determinou-se primeiro o TSS de miR-203 usando análise 5’RACE. Como mostrado na Fig. 1B, havia dois produtos de PCR 5 ‘RACE para pri-miR-203, o que sugeriu que o miR-203 pode ter, pelo menos, duas das EAT. O TSS perto pré-miR-203 foi consistente com o apresentado na publicação anterior [21] e foi rotulado como um.

MIR-203 níveis de expressão (A) em tecidos cervicais humanos normais, tecidos de câncer cervical e linhas celulares de cancro do colo do útero (CaSki e HeLa) foram medidos por qRT-PCR utilizando RNU6B como um controlo interno. Resultados (B) 5 ‘RACE PCR mostrar os locais de início da transcrição de humano (células HeLa) pri-miR-203. (C) Representação esquemática dos locais de ligação previstos de IRF1 no promotor do gene de miR-203. O número indica a distância relativa desde a extremidade 5 ‘do transcrito primário de miR-203 (indicada como 1). (D) Os resultados do alinhamento mostrar a conservação de sequências promotoras de miR-203 entre vários animais. análise de actividade do promotor (E) miR-203 por ensaios de luciferase dupla. O promotor de miR-203 previsto foi clonado no vector pGL3-basic a montante do gene da luciferase do pirilampo. a actividade da luciferase de pirilampo foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla e representados graficamente em relação ao controlo (*

P 0,05

). Os resultados são representativos de três experiências independentes.

Nós, então, realizada análise in silico da região do promotor de miR-203 (incluindo 2 kb a montante de pré-miR-203) utilizando as ferramentas on-line FirstEF, PromoterScan , softberry-FPROM e Promoter 2.0 Prediction. Estas ferramentas previsto que um 1-kb, GC-rich sequência (aproximadamente 70%) perto do miR-203 TSS foi o promotor (Fig. 1C). Tipicamente, as sequências promotoras de espécies diferentes são conservados. Portanto, alinhados a sequência do promotor humano previsto para a região a montante do pré-miR-203 de ratinho, rato, cão e vaca e encontrou uma região altamente conservada (Fig. 1D). Nossa hipótese é que esta sequência conservada era mais provável a sequência do promotor de miR-203. Em seguida, analisou-se a actividade deste promotor utilizando ensaios de repórter de luciferase. Como mostrado na Fig. 1E, em comparação com o vector de controlo, a sequência do promotor previu aumentou significativamente a actividade da luciferase (aproximadamente 17 vezes), o que indica que esta sequência conservada tem actividade de promotor forte.

IRF1 está envolvido na regulação da transcrição de miR- 203

ao digitalizar o promotor identificado miR-203 com TRANSFAC (https://www.biobase-international.com/product/transcription-factor-binding-sites), vários fatores de transcrição potenciais (AP-1, HSF1, MZF1, IRF1 e SP1) foram previstos. Para validar esta previsão, que examinou os efeitos de vários fatores de transcrição potenciais no miR-203 atividade luciferase conduzida pelo promotor. Entre estes factores de transcrição previstos, sobre-expressão de IRF1 em células HeLa activado significativamente o miR-203 a actividade de luciferase conduzida pelo promotor (Fig. 2A). Além disso, o efeito da sobreexpressão IRF1 na expressão de miR-203 foi analisada por miARN qRT-PCR. Como mostrado na Fig. 2B, IRF1 superexpressão aumento endógeno amadurecer miR-203 expressão de 8 vezes em comparação com o vector de controlo. Estes resultados indicam que o miR-203 a transcrição é regulada por IRF1.

(A) Os ensaios de luciferase dupla mostram o efeito de vários factores de transcrição (IRF1, MZF1, AP-1, HSF1, e SP1) em miR- 203 a actividade do promotor. As construções foram co-transfectados em células HeLa com vectores que expressam factores de transcrição e o vector pRL-TK como um controlo de transfeco. O plasmídeo pCDNA3.1 tipo selvagem serviu como um controlo negativo. As actividades de luciferase relativas são mostradas como a razão entre a actividade de luciferase de pirilampo /Renilla. Os ensaios (B) QRT-PCR mostram os efeitos da sobre-expressão em IRF1 expressão de miR-203. ensaios de imunoprecipitação (C) cromatina mostrar o

in vivo

interação entre IRF1 e o promotor de miR-203. fragmentos de cromatina de células HeLa foram imunoprecipitados com um anticorpo para IRF1 ou anticorpo de controlo negativo (IgG normal). As amostras de ADN a partir de imunoprecipitados foram analisados ​​por meio de qRT-PCR utilizando iniciadores específicos para o promotor de miR-203. (D) Os ensaios de luciferase usando as construções promotoras mutantes. Os resultados são representativos de três experiências independentes. *

P

0,05

A interação entre IRF1 e o promotor de miR-203 foi ainda confirmada por ensaios ChIP qRT-PCR.. Como mostrado na Fig. 2C, o

In vivo

ligação de IRF1 ao promotor de miR-203 foi significativamente mais elevada do que a do controle. Para identificar locais de ligação IRF1 na sequência do promotor de miR-203, que os locais de ligação mutado IRF1 preditos (Fig. 1C). Como mostrado na Fig. 2D, a mutação do local de ligação IRF1 2 (pGL3-mut 2) aboliu os efeitos de IRF1 no repórter, enquanto a mutação de local de ligação 1 não teve qualquer efeito. De acordo com estes resultados, IRF1 regula a expressão de miR-203 através da ligação ao local 2 (CACTT).

miR-203 suprime

BANF1

expressão, visando a 3’UTR de

BANF1

para explorar a função de miR-203, que procurou potenciais miR-203 genes alvo usando bancos de dados de miRNA (TargetScan, Miranda, e miRecords). Como mostrado na Fig. 3A, a região de semente de miR-203 é perfeitamente complementar com a sequência alvo na 3’UTR de

BANF1

. Para validar esta previsão em silício, que clonado a porção do

BANF1

3’UTR que contém o local alvo de miR-203 para a luciferase do plasmídeo repórter psiCHECK-2. Em seguida, realizado um ensaio de repórter de luciferase após a co-transfecção do repórter constrói com o miR-203 em células HeLa imitar. Na presença do miR-203 mímico, a actividade da luciferase da construção do repórter contendo o

BANF1

3’UTR foi significativamente reduzida, enquanto que a construção de não modificada não foi alterada (Fig. 3B). Além disso, a mutação (Mut) e de apagamento (DEL) da sequência de semente de miR-203, tanto revogada a redução de miR-203-mediada na actividade da luciferase (Fig. 3B).

BANF1

níveis de mRNA foram medidos por qRT-PCR, que mostrou uma diminuição dos níveis de

BANF1

ARNm na presença do miR-203 mímico (Fig. 3C). Para além disso, confirmam que

BANF1

é alvo de miR-203, examinamos a

BANF1

nível de proteína endógena via western blot após transitoriamente transfecção do miR-203 mímico e inibidor em células HeLa e CaSki . Como mostrado na Fig. 3D, o

BANF1

nível de expressão diminuiu à medida que a concentração de miR-203 transfectadas mímico foi aumentada, enquanto que o

BANF1

nível de expressão aumentada quando as células foram transfectadas com o inibidor de miR-203. Estes resultados indicam que o miR-203 pode direcionar diretamente o

BANF1

3’UTR e regular negativamente

BANF1

expressão.

(A) miR-203 maduro sequências e sítios de reconhecimento dentro 3’UTR de

BANF1

. A sequência de semente de miR-203 é sublinhado. O tipo selvagem (WT), mutante (Mut) e excluídos (Del)

locais BANF1

3’UTR de reconhecimento são também mostrados. (B) A actividade luciferase relativa de construções contendo o

BANF1

WT, Mut ou Del 3’UTRs. construtos de Luciferase foram co-transfectadas com miARN imitar controlo negativo (CN, 30 nM) ou o miR-203 mímico (30 nM) em células HeLa. a actividade da luciferase de Renilla foi medida 36 h após a incubação e normalizada para a actividade da luciferase de pirilampo. Um asterisco indica a regulação negativa significativa da pré-miR-203 em comparação com a expressão do WT

BANF1

3’UTR construto. Os dados são representativos de três experiências independentes. (C) QRT-PCR análise do

BANF1

mRNA a partir de células CaSki e HeLa transfectadas com miRNA imitar NC (30 nM) ou miR-203 mímico (30 nM). Os dados foram normalizados para o nível de ARNm de GAPDH, e a proporção de

BANF1

/GAPDH no controlo negativo foi definido como 1. Os dados são representativos de três experiências independentes. (D) Análise de Western blot de endógena

expressão BANF1

em células CaSki e HeLa 48 h após transfecção com o miR-203 inibidor de mímica ou. Tubulina serviu como um controlo de carga. Os resultados são representativos de três experiências independentes. (E)

BANF1

níveis de expressão em tecidos humanos normais do colo do útero, cancro cervical tecidos e linhas celulares de cancro do colo do útero (HeLa) e CaSki foram medidos por qRT-PCR, utilizando GAPDH como um controlo interno. (F) Análise de mancha de Western dos níveis de BANF1 em 20 tecidos emparelhados tumor (T) e tecidos cervicais normais adjacentes (N). Tubulina serviu como um controlo de carga. As cinco amostras emparelhadas que exibiram nenhuma diferença na expressão BANF1 são indicadas por caixas. *

P

0,05, **

P .

0,01

Para determinar se reduzida expressão de miR-203 está correlacionada com a

BANF1

os níveis de expressão no cancro cervical, foi avaliada a

BANF1

níveis em 20 emparelhado amostras cervicais de tecido de cancro e suas amostras cervicais normais adjacentes, bem como em linhas celulares de cancro do colo do útero (HPV 16+ CaSki e HPV 18+ HeLa) por meio de qRT-PCR.

BANF1

expressão foi significativamente mais elevada em células do colo do útero e tecidos de cancro do que em tecidos normais (Fig. 3E). Além disso, a análise de Western blot mostrou que as expressões de BANF1 foi elevado em 15 dos 20 pares (75%) os tecidos de tumor (T) em relação ao normal (N) de tecidos cervicais (Fig. 3F). As outras 5 amostras emparelhadas exibiram nenhuma diferença na expressão BANF1 são indicadas por caixas. Estes resultados sugerem que a diminuição anormal nos níveis de miR-203 no cancro do colo do útero está relacionado com a alta expressão de

BANF1

.

IRF1 regula miR-203 e indiretamente influencia a expressão de

BANF1

Para validar se o regulamento IRF1 de miR-203 pode mediar mudanças no

BANF1

expressão, avaliamos

expressão BANF1

por qRT-PCR e western blot sob IRF1 superexpressão. Como mostrado na Fig. níveis 4A e B, IRF1 de mRNA e proteína aumentaram significativamente em células CaSki HeLa e depois as células foram transfectadas com pcDNA-IRF1. Curiosamente,

BANF1

níveis de mRNA e proteína foram reduzidas em células CaSki e HeLa transitoriamente transfectadas com pcDNA-IRF1 (Fig. 4C e 4D), que sugere fortemente que IRF1 estimula miR-203 expressão, que posteriormente regula negativamente

BANF1

expressão.

(a, B) de QRT-PCR e análise de western blot de ARNm IRF1 e os níveis de proteína em células CaSki e HeLa transfectadas com pcDNA-IRF1. IRF1 ARNm e os níveis de proteína foram significativamente aumentadas quando transfectadas com pcDNA-IRF1. (C) QRT-PCR análise do

BANF1

expressão de mRNA em células HeLa transitoriamente transfectadas com vector de controlo ou pcDNA-IRF1. Os dados foram normalizados para a expressão de GAPDH. (D) Análise Western blot da expressão em células CaSki BANF1 e HeLa transitoriamente transfectadas com pcDNA-IRF1. Os resultados são representativos de três experiências independentes. *

P .

0,05

miR-203 suprime a proliferação de células de câncer cervical e formação de colônias

Nós exploramos as funções celulares de miR-203 em câncer cervical e encontrado que o miR-203 sobre-expressão marcadamente suprimido o crescimento de células HeLa e CaSki (Fig. 5A e B). Da mesma forma, a capacidade de formação de colónias foi diminuída em células CaSki HeLa e quando o miR-203 foi sobre-expresso (Fig. 5C e D).

(A, B) Os ensaios de proliferação celular de células CaSki e HeLa transfectadas com miR- 203 controle de mímica ou negativo. ensaios de formação (C, D) colônia de células CaSki e HeLa transfectadas com miR-203 controle de mímica ou negativo. Todos os dados são representativos de três experiências independentes. *

P .

0,05

miR-203 está envolvido na regulação do ciclo celular e suprime a migração de células de câncer cervical e invasão

in vitro

as células transfectadas com o miR-203 mímico foram sujeitas a análise do ciclo celular por meio de citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 6A, as células cancerosas cervicais superexpressam miR-203 teve uma maior percentagem de células em fase G1 e uma menor percentagem de células em fase S, sugerindo que miR-203 induz a paragem do G1. Além disso, ensaios de Transwell com Matrigel ou sem mostrou que o miR-203 sobre-expressão em células CaSki HeLa e suprimiu a capacidade de migração e invasão comparado com o controlo negativo células (NC) (Fig. 6B, C, D e E).

(a) análise de citometria de fluxo mostrando o efeito de sobre-expressão de miR-203 sobre o ciclo celular de células CaSki e HeLa. As células foram transfectadas com 30 nM de miR-203 controlo mímica ou negativo (CN) e recolhidas, coradas e analisadas 48 h após a transfecção. (B, C) Transwell ensaios de migração de células CaSki e HeLa transfectadas com miR-203 mímico ou NC. As células migradas foram quantificadas e imagens representativas são mostradas na parte inferior. ensaios de invasão (D, E) Transwell de células CaSki e HeLa transfectadas com miR-203 mímico ou NC. As células invadidas foram quantificadas e imagens representativas são mostrados. Os resultados são representativos de três experiências independentes. *

P .

0,05

BANF1

knockdown suprime a formação de colónias de células, migração e invasão

Para validar ainda mais se

BANF1

está envolvido em miR-203 mediada colônia formação, migração e invasão, siRNA segmentação

BANF1

foi projetado e transfectado em células CaSki e HeLa. Os resultados mostraram que o siRNA alvejando

BANF1

diminuiu significativamente

BANF1

ARNm e os níveis de proteína em células CaSki e HeLa (Fig. 7A e B). Como esperado, knockdown de endógena

BANF1

por siRNA resultou num decréscimo significativo na formação de colónias (Fig. 7C e D). Da mesma forma, as capacidades de migração e invasão de células CaSki e HeLa foram também significativamente diminuída pela

BANF1

siRNA, mas não pelo controle negativo (NC) siRNA (Fig. 7E, F, G e H).

(A, B) QRT-PCR e análise de western blot de

BANF1

níveis em

BANF1

-knockdown CaSki e HeLa.

BANF1

níveis de mRNA e proteína foram significativamente reduzidos quando transfectadas com siRNA-BANF1. (C, D) ensaios de formação de colónias revelou que o número médio de formação de colónias foi reduzido em células in

BANF1

-knockdown e CaSki HeLa. (E, F) ensaios de migração celular, revelando que as células migraram foram diminuiu derrubando

BANF1

. (G, H) ensaios celular invasão revelando que as células invadidas foram diminuiu derrubando

BANF1

. Todos os dados são representativos de três experiências independentes. *

P 0,05

Discussão

Um número crescente de estudos têm mostrado que miARNs estão envolvidos em vários processos fisiológicos e estão associados com o desenvolvimento de doenças. através da sua capacidade de regular genes alvo [22,23]. A regulação da expressão de miARN é importante para manter a homeostase celular; No entanto, os mecanismos moleculares que regulam a transcrição de genes de miARN não são bem compreendidos [24,25]. Regulação da expressão a nível da transcrição é um passo crítico na biossíntese de miARN [26].

miARN genes são transcritos como uma unidade ou do agrupamento e pode residir em qualquer regiões intergénicas ou dentro dos intrões ou exões de codificação de genes [ ,,,0],27]. Quando miARNs residem nas regiões intragênicos, que pode ser transcrito de forma independente, se eles têm os seus próprios promotores [27], ou eles podem ser transcritas em conjunto com o gene de acolhimento se lhes falta os seus próprios promotores. Identificação de promotores TSSs e é crítica para a compreensão dos mecanismos de transcrição e factores que medeiam a expressão de miARN [28]. O gene de miR-203 está localizada numa região intergénica e é transcrito de forma independente. Nosso estudo identificou miR-203 TSSs por 5 ‘RACE e posteriormente identificados a sequência do promotor de miR-203.

Tendo múltiplos TSSs é um mecanismo importante para aumentar a complexidade genética e contribuindo para a diversidade funcional, um fenômeno que tem sido bem estudada para genes codificadores de proteínas. Em espécies complexas, é comum que os genes de ter várias das EAT diferentes que podem estar activa em condições diferentes [29]. Tem sido relatado que o aglomerado de genes humanos miARN miR-23a-miR-27a-miR-24-2 e

Drosophila melanogaster

miARNs miR-276a e miR-277 têm alternativa TSSs [30]. Neste estudo, identificamos dois TSSs para miR-203. Na maioria dos casos, os transcritos de variáveis ​​para cada miARN pode produzir o mesmo madura miARN [31]. Portanto, formando várias transcrições tem pouca influência sobre a função de um miARN. No entanto, especula-se que distinta TSSs de miARN pode ter diferentes eficácias de transcrição e pode regular o nível de expressão dos miARNs. Uma maior compreensão do splicing alternativo pode fornecer mais informações sobre a regulação de genes miRNA.

Nosso estudo estabelece uma via de sinalização linear (

IRF1

para miR-203 a

BANF1

) (Fig . 8).

IRF1

codifica interferon fator de regulação 1, um membro da família interferon regulamentar fator de transcrição (IRF). IRF1 é diminuída em tecidos de câncer e funções na resposta imune, regulação da apoptose, DNA reparação de danos e supressão do tumor [32-34]. Estudos anteriores têm validado que miR-203 regula uma série de genes-alvo, incluindo

VEGFA

[18],

ALB1

[35],

PKC

α [16], e

ATM

[36] (Fig. 8). Estes genes alvo estão envolvidas em processos biológicos semelhantes a IRF1.