Abstract

Doença agressividade continua a ser um factor crítico para a progressão do câncer de próstata. A transformação de células epiteliais à linhagem mesenquimal, associados com a perda de E-caderina, oferece potencial invasivo significativo e capacidade de migração. Recentemente, a proteína de ligação especial rica em AT (SATB1) tem sido associada à progressão do tumor. SATB1 é um tipo de célula restrito proteína nuclear, que funciona como um organizador específica de tecido de sequências de ADN durante a diferenciação celular. Os nossos resultados demonstram que SATB1 desempenha papel significativo na invasão de tumor da próstata e a migração e a sua localização nuclear correlaciona-se com a agressividade da doença. análise amostra clínica mostrou que SATB1 foi predominantemente expresso no núcleo de tumores de grau elevado, em comparação com tumores de baixo grau e tecido benigno. Um aumento progressivo nos níveis de SATB1 nucleares foi observada em tecidos de cancro em comparação com amostras benignas. Do mesmo modo, os níveis de proteína SATB1 foram maiores em um número de células de cancro da próstata

viz. HPV-CA-10, DU145, DUPRO, PC-3, PC-3M, LNCaP e C4-2B, em comparação com células não tumorigénicas PZ-HPV-7. expressão nuclear do SATB1 foi maior em subclones biologicamente agressivo de células cancerosas da próstata com suas respectivas linhas celulares parentais. Além disso, a transfecção ectópica SATB1 conferiu aumento da motilidade celular e capacidade invasiva em epiteliais da próstata humana PZ-HPV-7 células imortalizadas que se correlacionou com a perda de expressão de E-caderina. invasão e crescimento tumoral, consequentemente, knockdown de SATB1 no câncer de próstata humano células PC-3M altamente agressivos inibida

in vivo

, juntamente com o aumento da expressão da proteína caderina-E. Nossos resultados demonstram que SATB1 tem capacidade de promover a agressividade do câncer de próstata através da transição epitelial-mesenquimal

Citation:. Shukla S, Sharma H, Abbas A, MacLennan GT, Fu P, Danielpour D, et al. (2013) regulação positiva de SATB1 está associado com o cancro da próstata agressividade ea progressão da doença. PLoS ONE 8 (1): e53527. doi: 10.1371 /journal.pone.0053527

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de agosto de 2012; Aceito: 03 de dezembro de 2012; Publicação: 07 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Shukla et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Subvencionado por Estados Unidos Saúde Pública Subsídios para Serviços RO1CA115491 de Doações fundos para SG. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é a segunda principal causa de morte relacionada com câncer entre os homens nos Estados Unidos, com cerca de 33.720 mortes ocorreram no ano de 2011 [1]. O mau prognóstico de cancro da próstata está relacionado com a agressividade de células tumorais que os dota com o aumento da capacidade de intravasate nos compartimentos vascular e linfático, metastizar para locais distantes, e provocar a recorrência mesmo após tratamentos definitivos como a cirurgia e radiação [2], [3 ]. transição epitelial-mesenquimal (EMT) é um acontecimento chave no processo de invasão de tumores por meio de que tumores derivados de células epiteliais adquire características mesenquimais, perdem os seus contactos de polaridade e célula-célula e passam por profunda remodelação citoesqueleto [4] – [6]. A perda de expressão de E-caderina é uma característica da EMT [7], [8]. E-caderina (CDH1) desempenha um papel central nas junções de adesão célula-célula na manutenção da polaridade celular e o ambiente [7]. Perda de expressão da caderina-E é comumente associado com invasão tumoral, metástases e mau prognóstico em vários cancros humanos, incluindo cancro da próstata [8], [9]. Identificação de proteínas que causam a reprogramação molecular de EMT poderia conduzir à sua identificação como biomarcadores prognósticos e alvos terapêuticos, permitindo assim o desenvolvimento de novas estratégias para reduzir a agressividade do câncer de próstata.

Especial AT-rica proteína de ligação 1 (SATB1) é um factor de transcrição que funciona como um organizador genoma [10], [11]. Ele tende a ligar-se com a AT ricas desemparelhados sequências de bases do gene alvo [11]. SATB1 adquire uma estrutura “3 D chickenwire” através da formação de âncora laços em torno da cromatina, recruta complexos de cromatina remodelação nos locais de ancoragem, e regula modificações de histonas, tornando sequências de DNA acessíveis ou inacessíveis para a transcrição [12], [13]. Transcrição GenBank referencia duas variantes de transcritos de mRNA SATB em humanos: SATB1 e SATB2 [14]. A activação constitutiva de SATB1 foi demonstrado principalmente em células da linhagem hematopoiética e está envolvido nas fases de desenvolvimento de células T e diferenciação controlar a expressão do gene bcl-2 a BCL-2 importante região do ponto de interrupção (MBR) localizado no interior da 3 ‘ UTR [15], [16]. SATB2 está implicado como um regulador do desenvolvimento de diferenciação neuronal [17]. Estudos recentes têm demonstrado a expressão aberrante de SATB1 em uma variedade de cancros epiteliais, incluindo o melanoma, o carcinoma de células escamosas da laringe, e carcinomas da mama, cólon, pulmão, ovário e fígado [18] – [24]. A sobre-expressão de SATB1 foi identificado como um marcador de prognóstico para o cancro gástrico independente [25], e tem sido demonstrado que desempenham um papel na progressão do tumor da mama por meio de um processo de reprogramação a expressão do gene e promover assim o crescimento tumoral e metástase [26]. Pouco se sabe sobre a influência de expressão SATB1 no comportamento biológico de cancro da próstata.

SATB1 Embora tenha sido relatada a ser activada em vários tipos de cancro, o seu papel na progressão do cancro não é clara. A análise da expressão gênica global de amostras de cancro da próstata clínico revelou reprogramação transcricional distinto associado com potencial metastático [27]. perfilamento funcional de genes sugeriram a associação de SATB1 com modificação cromatina impactando a regulação da transcrição de genes que regulam moléculas de adesão celular e EMT [9], [12]. Dado o papel significativo da capacidade de invasão de EMT em cancro da próstata, foi levantada a hipótese de que a sobre-expressão de SATB1 no cancro da próstata pode promover a capacidade de invasão do cancro da próstata por regulação negativa da E-caderina. Até agora, não houve dados sobre o papel de SATB1 no câncer de próstata. Neste estudo de expressão SATB1, a sua localização nuclear e citoplasmática foi avaliado num número de espécimes da próstata primário de tecido de cancro e linhas celulares estabelecidas, através de uma combinação de imuno-histoquímica e Western blotting. Os nossos resultados demonstram que a presença nuclear de SATB1 significativamente correlacionados com a agressividade do cancro da próstata e progressão da doença. Consistente com os achados clínicos, alterações ectópica na expressão SATB1 resultou em alterações da motilidade celular e invasão ambos

in vitro

e

in vivo

. Esta linha de evidência demonstra o significado prognóstico da SATB1 no câncer de próstata e esclarece ainda a influência do SATB1 na promoção da capacidade de invasão de câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

Humano células do cancro da próstata, LNCaP, 22Rv1, DU145, PZ-HPV-7, CA-HPV-10 e PC-3 foram compradas na American Type Culture Collection (Manassas, VA). células cancerosas humanas da próstata

viz

. PC-3M foi fornecida pelo Dr. ME Kaighn no Instituto Nacional do Cancro [28]; células C4-2B por Dr. Robert Sikes da Universidade de Delaware [29] e células DUPRO por Dr. Rajvir Dahiya da Universidade da Califórnia em San Francisco [30]. Relatórios anteriores documentaram o estabelecimento dessas linhas celulares [28] – [30]. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor, 100 ug /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA), mantidas numa incubadora com uma atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2 a 37 ° C. As células cultivadas foram cultivadas até -60% de confluência e lisados ​​(lisados ​​totais, citosólicas e lisados ​​nucleares) foram preparados de acordo com o protocolo anterior para posterior análise.

próstata humana amostras de tecido e imuno-histoquímica

Amostras de tecido da próstata humana descartados foram recebidos pela Facilidade de recolha de tecidos da Universidade Hospitais processo Medical Center e da Divisão Centro-Oeste da Rede Cooperativa de tecido humano. Sem o consentimento foi obtido para estes tecidos descartados por suas políticas hospitalares e protocolos Institutional Review Board. Esses estudos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Hospitais Processo Medical Center. Os doentes a quem estes tecidos foram adquiridos foram submetidos a procedimentos cirúrgicos para doenças da próstata e não tinha recebido qualquer forma de terapia adjuvante. O grau de Gleason e pontuação de adenocarcinoma em amostras de tecido foram atribuídos por um patologista cirúrgico experientes em patologia genito-urinário. Imediatamente após a colheita, as amostras foram congeladas rapidamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C na fase de vapor de azoto líquido até à sua utilização. Para estudos de IHC um microarray de tecido da próstata humana (Cat # 73-5063) foi obtido a partir de Zymed Laboratories (San Francisco, CA), incluindo núcleos de próstata normal, o tecido da próstata hiperplasia benigna, cancros de baixo grau e cânceres de próstata de alto grau. Nestas amostras, a análise imuno-histoquímica foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Biocare Medicals, Concord, CA).

Transient transfecção

andrógeno-refratário altamente metastático cancro da próstata humana PC-3M, que possuem maior expressão de SATB1, ao passo que, PZ-HPV-7, que tem muito baixo nível basal de SATB1in o núcleo foram utilizados no estudo. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 100 mm e deixadas a aderir durante a noite. Aproximadamente 70% confluentes PZ-HPV-7 foram transitoriamente transfectadas com 8 MU g de qualquer pCMV6-AC verdadeiro clone de ADN de plasmídeo humano contendo expressão SATB1 (SC320672) foi adquirido a partir de OriGene (Rockville, MD) ou vector vazio, ao passo que, as células PC-3M foram infectadas com shRNA (SATB1) de DNA do plasmídeo humano de knockdown da expressão do gene SATB1; que contém piscina de vetor lentiviral especifica de alvo que codifica cada 3 19-25 nt (mais hairpin) (SC-36460-SH) e o plasmídeo vector vazio shRNA-A (SC-108060) (Santa Cruz Biotechnology, CA), utilizando Fugene 6 reagente de transfecção. Após 6 h o meio foi suplementado com meio de cultura de soro, e as células foram incubadas a 37 ° C num incubador humidif içado, durante 48 h. Mais tarde, as células foram processadas para análise de imunotransferência, bem como migração de células e ensaios de invasão.

foram preparados Western Blotting

lisados ​​tumorais, bem como lisados ​​de células (total, citosólicas e nucleares) e submetido a análise de immunoblot. A proteína (40 MU g) a partir de lisados ​​de células totais ou de lisados ​​de tumor da próstata humana foi resolvido por 4-20% de SDS-PAGE e transferidos para membrana de nitrocelulose. Após bloqueio com tampão de bloqueio (PBS contendo 0,1% de Tween-20 e 10% de FBS), durante 2 h, a membrana foi incubada com anticorpo primário durante 2 h à temperatura ambiente. Os anticorpos utilizados foram SATB1 (Cat # ab49061, Abcam, Cambridge, MA); Histonas H4 (Cat # 07-108, Millipore, Denvers, MA); E-caderina (Cat # SC-8426); MMP-9 (Nº de Cat SC-10737); beta -actina (Cat # SC-47778) e citoqueratina-18 (Cat # SC-6259) de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). A membrana foi então incubada com o anticorpo secundário conjugado com HRP durante mais 2 h à temperatura ambiente. A proteína foi detectada por reagentes de substrato ECL (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL).

invasão celular Ensaio

transfectar transitoriamente SATB1 em PZ-HPV-7 (células que expressam SATB1over) e PC -3m células (knockdown) SATB1 infectadas foram tomadas no estudo para examinar o efeito do gene SATB1 na invasão celular, bem como na migração. Após 48 horas de infecção SATB1 gene nas células, meio contendo soro foi removido das células e foi reabastecido fresco sem soro meio RPMI durante 6 h. Mais células foram tripsinizadas, contadas e plaqueadas para os transwells contendo 1 × 10

6 células /ml. O kit de ensaio de câmara de invasão foi utilizado QCMTM ECMatrix celular Invasão Ensaio, de 24 poços (8 MU m) (Millipore Corporation, Denvers, MA, Cat # ECM550) baseado no princípio da câmara de Boyden. A camada de colagénio obstrui os poros da membrana, bloqueando as células não invasivas de migração através da membrana. células invasivas, por outro lado, migra através da camada de colagénio polimerizado e agarrar a parte inferior da membrana de policarbonato. células invadidas na parte inferior da membrana foram incubadas com o inserto celular solução Stain, em seguida, extraiu-se, posteriormente, e detectado num leitor de microplacas padrão (560 nm). Todo o procedimento foi seguido de acordo com o protocolo do fabricante.

Cell Migration Assay

ensaio de migração foi realizada em PZ-HPV-7 (células SATB1over expressando) e PC-3M infectados (SATB1 knockdown células) células usando QCMTM, 24 poços kit ensaio colorimétrico migração celular (Millipore Corporation, Denvers, MA, Cat # ECM508) seguindo o protocolo do fornecedor.

transcrição reversa-polymerase Chain Reaction

Semi Quantitativas inversa reacção em cadeia da polimerase de transcrição (RT-PCR) foi realizada para determinar os níveis de transcrição de SATB1 em amostras de tecido de próstata humanas de diferentes graus de Gleason e a amplificação de transcritos de GAPDH foram utilizados como controlo para normalizar os níveis de transcrição de SATB1. Os tecidos foram cortados em pequenos pedaços e colocados em Melt, um sistema total de isolamento de ácido nucleico (Ambion, Austin, TX), de acordo com o protocolo dos fabricantes. RT foi realizada utilizando o iniciador oligo-dT (Invitrogen), e 0,5 MU g de ARN total numa lt 25 MU l mistura de reacção, contendo Tris-HCl 50 (pH 8,3), KCl 75 mM, 10 mM DTT, 5 mM MgCl

2, 2,5 mL de dNTP (10 mM), 10 L de RNAsin, e 200 U de transcriptase MMLV (Invitrogen) inverter. A reacção de RT foi realizada a 39 ° C durante 1 h para sintetizar ADNc. Em seguida, a PCR foi realizada para amplificar cDNAs de lt 25 MU l mistura de reacção contendo 50 nmol de cada iniciador específico para o gene, 3 produto ml de RT, 2,5 de dNTP mM, 1x tampão de PCR (Tris-HCl 5 mM, pH 8,3, KCl 42,5 mM , 0,1% de Triton X-100), 0,5 ml de polimerase Taq (Promega, Madison, WI), 2 mM de MgCl

2, juntamente com os iniciadores utilizados na reacção de PCR. As sequências dos iniciadores específicos do gene para a frente SATB1: 5′-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 ‘e inverso: 5′-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3′; GAPDH frente: 5’-ATGACC CCTTCATTGACCTCA-3 ‘e inverter: 5′-GAGATGATGA CCCTTTTGGCT-3’. transcrições SATB1 foi amplificado durante 30 ciclos (1 min a 94 ° C, 1 min a 59 ° C e 1 min a 72 ° C), e o ADNc de transcritos de GAPDH foram amplificadas durante 25 ciclos (1 min a 94 ° C, 1 min a 55 ° C e 1 min a 72). Os números dos ciclos de PCR tinha sido optimizada para evitar a saturação de amplificação. Dez microlitros do produto de RT-PCR foi separado em géis de agarose a 2%, as quais foram, subsequentemente, corados com brometo de etídio. Os géis foram visualizados e intensidades das bandas foram medidos sob a estação de imagem Kodak 2000R.

SATB1 Knockdown

células PC-3M foram transduzidas por partículas lentivirais SATB1 shRNA, que é um conjunto de partícula viral contendo 3 -Alvo construções específicas que codificam 19-25 nt (mais hairpin) shRNA projetado para derrubar a expressão do gene (Santa Cruz Biotechnology, CA; sc36460-v). As células PC-3M foram plaqueadas em placas de 12 poços a 24 horas antes da infecção viral. Transduções foram efectuadas em meio RPMI contendo 10% de meio completo (com soro e antibióticos) e as células incubar durante a noite. Meio RPMI completo foi removido e suplementado com polibreno (5 MU g /ml) de meio completo RPMI. As células PC-3M foram infectadas com adicionando as partículas de lentivírus shRNA para as células contendo o meio. Todos procedimento foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante.

Colony Formação Ensaio

Cerca de 400 células de PC-3M e PC-3M (SATB1 derrubar), as células foram recolhidas 100 mm petridish ( Falcon; Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) e cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 e 95% de ar. Após 12 dias as células foram lavadas com tampão de fosfato e depois corado com azul de Coomassie. Células colónias foram contadas e fotografadas.

Tumor Xenoenxerto Estudos

Os ratinhos nus foram adquiridos a partir do Processo Comprehensive Cancer Center, academia de ratinhos nus atímicos e mantidos em gaiolas microisolator. Todos os animais foram utilizados em conformidade com as diretrizes institucionais e os experimentos atuais foram aprovados pelo Comitê de Uso para o cuidado de animais na Case Western Reserve University. As células tumorais, PC-3M e PC-3M (SATB1 KO) foram suspensas em RPMI 1640 meio de cultura completo com 25% de Matrigel (BD Biosciences) e inoculadas 1 × 10

6 células subcutaneamente no flancos direito e esquerdo de 6 a ratinhos nus com 7 semanas de idade. Os ratinhos foram monitorizados diariamente para a formação de tumores palpáveis ​​e tumores foram medidos duas vezes por semana utilizando uma craveira, pesados ​​e fotografado.

Análise Estatística

Os dados de expressão nuclear SATB1 foram resumidos pela média (intervalo ), bem como caixa de bigodes. As variações de volume de tumor e peso corporal, durante o decurso das experiências foram visualizadas por gráfico de dispersão. Diferenças de expressão SATB1 nucleares (por 1000 núcleos), o volume do tumor (mm3) e peso corporal no final da experiência entre os vários grupos foram examinados pela análise de variância (ANOVA), seguido por procedimento de comparação múltipla de Tukey. A significância estatística de diferenças entre o grupo de controlo e de tratamento foi determinada pelo teste-t para dados de amostras independentes ou emparelhado teste-t para dados a partir de amostras correlacionadas. Todos os testes foram bicaudais e os valores de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Expressão de Proteína SATB1 no tumor benigno e espécimes

A expressão perfil de SATB1 foi determinada nas amostras clínicas removidos cirurgicamente. Foi realizada análise de Western blot para SATB1 e CK18 como controle de carga epitelial em 14 benigna, 14 de câncer de próstata de baixo grau (escore de Gleason ≤7) e 6 amostras de tumores de alto grau (escore de Gleason 8-10). Uma transferência típica apresentada na figura 1A, SATB1 foi encontrado para ser expresso em ambos os tecidos de cancro da próstata benignos e cancerosos. Níveis de SATB1 foram significativamente maiores nas amostras de cancro em comparação com o tecido benigno. A análise densitométrica demonstrou um aumento de 1,6 vezes na expressão SATB1 em espécimes de tumor de baixo grau e 2,62 vezes em amostras de tumores de grau elevado, em comparação com o tecido benigno. Em seguida nós determinar se SATB1 é regulada no nível de mensagem. Foi realizada RT-PCR para a expressão do mRNA para SATB1 e GAPDH como um controlo de carga. Como mostrado na Figura 1B, o transcrito de ARNm para SATB1 foi significativamente regulada positivamente em tumores de grau elevado em comparação com tumores de baixo grau e tecido benigno. A análise densitométrica demonstrou um aumento de 1,64 vezes na expressão de ARNm de SATB1 em espécimes de tumor de baixo grau e 1,51 vezes em tumores de grau elevado, em comparação com o tecido benigno. Desde SATB1 é uma proteína nuclear e promove uma estrutura de cromatina transcricionalmente activo, interagindo com as sequências de ADN rica em AT, regulados positivamente em cancro, portanto, determinou-se os níveis desta proteína no citosol e fracção nuclear em amostras tumorais benignas e obtidos a partir de mesmo indivíduo. De facto, os níveis mais elevados de proteína SATB1 estava presente na fracção nuclear, em comparação com o citosol de tecido de tumor em comparação com o tecido benigno (Figura 1C).

(A) Expressão das proteínas SATB1 em vários tipos de tumores da próstata e tecido benigno foi analisada por transferência Western; expressão cytokeratin18 serviu como controle de carga. (B) a expressão de ARNm SATB1 em vários tipos de tumores da próstata e tecido benigno; a expressão de ARNm de GAPDH como controlo de carga servido. a expressão da proteína (C) SATB1 em amostras emparelhadas benignos e câncer do mesmo indivíduo foi analisada para a distribuição citoplasmática e nuclear. A análise densitométrica de cada mancha é apresentado no painel da direita. Detalhes estão descritos na secção “materiais e métodos”.

Em seguida, analisou a expressão SATB1 por coloração imuno-histoquímica das secções de tecido embebidos em parafina que consistem em 19, tumor 5 baixo grau benigno (escore de Gleason 5- 6), 10 tumor médio-grade (escore Gleason 7-8) e 5 tumores de alto grau (escore de Gleason 9-10) no tissue microarray (Figura 2). SATB1 expressão foi observada tanto no núcleo ou no citoplasma, ou ambos, mas predominantemente visto no núcleo das células cancerosas. Em comparação com o tecido benigno, um aumento progressivo na expressão SATB1 foi observada no núcleo com o aumento do grau do tumor. Baixos níveis de expressão SATB1 foi observado em tumores moderadamente diferenciadas. imunocoloração imagens representativas de expressão SATB1 em graus tumorais benignas e vários estão apresentados na Figura 2A. Também foram avaliados os níveis nucleares de SATB1 em vários componentes histológicos das amostras de tecidos através da contagem do número de núcleos que mostram expressão SATB1 positiva com uma ampliação X40, e analisadas as contagens estatisticamente por média e desvio padrão, bem como a análise boxplot (Figura 2B). As diferenças de expressão nuclear SATB1 (por 1000 núcleos) entre amostras de tumor de grau benignas e outras foram examinadas por análise de variância (ANOVA), seguido por procedimento de comparação múltipla de pares de Tukey. espécime benignos (n = 15) apresentaram uma média de 56,93 núcleos corados (intervalo 37-79), tumores de baixo grau com pontuação de Gleason de 5-6 (n = 13) mostrou uma média de 90,54 núcleos corados (intervalo 56-115) ; tumores moderadamente diferenciados com pontuação de Gleason de 7-8 (n = 12) apresentaram uma média de 146.33 núcleos corados (intervalo 93-198); e tumor de alto grau com Gleason score 9-10 (n = 11) mostrou uma média de 205,27 (158-298) núcleos corados para SATB1. A expressão SATB1 nuclear entre os 4 grupos foi estatisticamente altamente significativa (P 0,0001). Além disso, o procedimento de comparação múltipla de pares de Tukey demonstraram que a expressão SATB1 em amostras tumorais pontuação elevada foi significativamente maior do que nas amostras de baixa pontuação (P 0,05).

parafina-embedded (4,0 mm) secções (A) de câncer benigno da próstata e de várias pontuações Gleason foram utilizados para expressão SATB1 por imuno-histoquímica. A coloração nuclear e citoplasmática forte foi observada na escala de Gleason 3 + 3, ao passo que o aumento de coloração SATB1 nuclear foi observada em cancro de alto grau (pontuação de Gleason 3 + 4 + 4 e 5, respectivamente). Ampliada em x20 e x40 (B) Análise estatística da presença nuclear SATB1 foi realizada comparando SATB1 células coradas nucleares positivos de vários locais de benigna, pontuação 5-6, 7-8 marcar e marcar 9-10 espécimes. Os dados representam a média ± SE. *

P Art 0,05

contra

correspondente controle. P 0,05, detalhes são descritos na seção “materiais e métodos”

SATB1 expressão em células cancerosas humanas da próstata

Nós examinados expressão SATB1 em linhas de células epiteliais 8 de próstata, incluindo non. -tumorigenic células transformadas por vírus epiteliais da próstata humana (PZ-HPV-7) e o seu homólogo cancro (CA-HPV-10), 3 linhas de células de cancro da próstata primário viz. DU145, LNCaP e PC-3 e seus subclones biologicamente agressivos: DUPRO, C4-2B e PC-3M, respectivamente. Como mostrado na Figura 3A, os níveis de proteína SATB1 foram maiores em todas as linhas celulares de cancro da próstata em comparação com as células não tumorigénicas PZ-HPV-7. As linhas de células de cancro primário viz. células CA-HPV-10, DU145, LNCaP e PC-3 expressam 7.94- aumento de 16,82-vezes na expressão SATB1 comparação com células PZ-HPV-7. A exposição subclones agressivos para 17.0- 20.53 aumento vezes na expressão SATB1, em comparação com células não tumorigénicas. Também comparamos a citosólica e expressão nuclear de SATB1 em LNCaP e PC-3 respectivas subclones C4-2B, e as células PC-3M. Tal como mostrado na Figura 3B, a expressão de SATB1 em LNCaP e PC-3 células foram relativamente semelhantes em citosólica e fracções nucleares. Em contraste, observou-se níveis elevados de expressão da proteína SATB1 na fracção nuclear da C4-2B subclone agressivo e células PC-3M. Estes resultados estão de acordo com as amostras de tecido, onde significativamente alta nuclear expressão SATB1 correlacionadas com a agressividade da doença

(A) transferência de Western para a expressão da proteína SATB1 em várias células cancerosas da próstata.; CA-HPV-10, DUPRO, DU145, PC-3 epitelial, PC-3M, LNCaP e C4-2B incluindo transformado (PZ-HPV-7), as células. (B) citoplasmática e nuclear expressão da proteína SATB1 foi analisada no cancro da próstata linhagem celular dos pais e seus subclones agressivos LNCaP e C4-2B; PC-3 e PC-3M, que representava a presença nuclear superior de SATB1 em subclones agressivos. Histonas H4 serviu como controle de carga. A análise densitométrica de cada mancha é apresentado no painel da direita. Detalhes estão descritos em “materiais e métodos” seção.

SATB1 Knockdown Reduz Agressividade de células cancerosas da próstata

Nós investigamos se SATB1 é necessário para o fenótipo invasivo de células de câncer de próstata. No ensaio, as células PC-3M, que expressam elevados níveis constitutivos de SATB1 foram usadas e curtas hairpin RNAs (shRNA) para knockdown expressão SATB1. Usamos shRNA de duas sequências diferentes SATB1 (shRNA1 e shRNA2) e controle de shRNA em células PC-3M altamente agressivos. Como mostrado na figura 4A, a expressão SATB1 foi significativamente reduzida em 85,5% e 77,5% em ambos SATB1 shRNA1 shRNA2 e, respectivamente, ao passo que não houve alterações significativas na expressão SATB1 foi observado em células PC-3M tratados com controlo shRNA. Além disso, SATB1 knockdown diminuição das capacidades de migração e invasão de células PC-3M em comparação com a linha celular parental e células shRNA controlo. A migração e a capacidade invasiva de células in vitro de ARNm SATB1 foi reduzido em 68-80%, o que se correlacionou com um aumento da expressão de E-caderina e diminuiu os níveis de MMP-9 após shRNA knockdown (Figura 4B). A redução dos níveis SATB1 em células PC-3M decréscimo da proliferação celular, restaurado do crescimento dependente da ancoragem e as células revertidas para uma morfologia polarizada como observada por microscopia de luz (Figura 4C).

de cancro da próstata PC-3M células foram transfectadas com e sem ADN (simulação), ou o vector de shRNA SATB1-alvo 1e 2 e continuaram em cultura durante 24 h. (A) SATB1, E-caderina, MMP9 e -actina expressões de proteínas totais foram analisados ​​por transferência de Western. (B) silenciamento SATB1 em células PC-3M foi associada com baixo potencial invasivo e migração. Barras representam a média ± DP de três ensaios diferentes. **

P Art 0,001

contra

controle. (C) representativos células imagens PC-3M são mostrados com e sem SATB1 shRNA transfecção. Detalhes estão descritos na secção “materiais e métodos”.

SATB1 Promove Fenótipo agressivo na próstata células epiteliais

A seguir, examinar se a expressão ectópica de SATB1 é suficiente para induzir a atividade invasiva em forma viral transformadas células epiteliais da próstata humanas não tumorigénicas. Controle de células PZ-HPV-7 foram transitoriamente transfectadas com DNA plasmídeo humano pCMV6-A6 verdadeiro clone contendo SATB1 e com RNA simulada SATB1. Transfecção com SATB1 plasmídeo de expressão aumentou a expressão de SATB1 em PZ-HPV-7 células e aumento da migração e invasão capacidades

in vitro

por 50-67%. SATB1 sobreexpressão em PZ-HPV-7 células resultou na diminuição da expressão de E-caderina e aumento em níveis de MMP-9 nestas células (Figura 5A-C).

células PZ-HPV-7 foram transfectadas com e sem DNA (simulada), ou o vetor 1 SATB1-alvo e continuou em cultura durante 24 h. (A) SATB1, E-caderina, MMP9 e histona H4 expressões de proteínas foram determinadas na citosólica e da fração nuclear por transferência de Western. SATB1 superexpressão resultou na diminuição da expressão de E-caderina e MMP9 regulada positivamente. (B) A sobre-expressão de SATB1 em células PZ-HPV-7 foi associado com o aumento do potencial invasivo. Barras representam a média ± DP de três ensaios diferentes. **

P Art 0,001

contra

controle. (C) Representante PZ-HPV-7 imagens com e sem SATB1 superexpressão vector trasfection. Detalhes estão descritos na secção “materiais e métodos”.

SATB1 Esgotamento inibe crescimento do tumor em ratinhos nus atímicos Xenoenxerto

Nós testamos se o esgotamento SATB1 a partir de células PC-3M inibiu o crescimento do tumor. Para estes estudos, desenvolvemos linhas celulares que foram silenciados de forma estável para a expressão SATB1 usando um sistema de entrega de shRNA-lentiviral. As células foram seleccionadas até 10 passagens e células acima passagem 11 foram usadas para os estudos. Uma diminuição significativa na expressão SATB1 foi observada em células PC-3M-KO. Knockdown de SATB1 foi mais proeminente na fracção nuclear nestas células. células SATB1-KO exibiram um aumento no tempo de duplicação de 26,86 ± 4,89 h, em comparação com as células PC-3M com 20,04 ± 4,34 h, respectivamente. Também determinou que a capacidade invasiva

in vitro de células

SATB1-KO. esgotamento consistente de SATB1 reduziu a formação de colônias destas células em agar mole, indicando que a perda de SATB1 restaurado o seu crescimento dependente de ancoragem (Figura S1 A-C).

A seguir, procedeu-se

In vivo

estudos. As células de controlo PC-3M e células SATB1 KO foram injectados para os flancos de ratos nus para formar tumores. O volume do tumor foi registado em dias alternados e a experiência foi terminada no dia 31 dia, como o tamanho do tumor de tumores PC-3M foi grande, enquanto que os ratinhos injectados com o clone SATB1 KO resultou na redução do crescimento tumoral com uma diminuição no peso do tumor e o volume (P 0,003) (Figura 6 A-C). Também medimos a expressão da proteína de proliferação de antigénio de célula nuclear (PCNA), E-caderina, MMP9 e SATB1 nestes tumores. Como mostrado na figura 6 D; SATB1 knockdown resultou em redução marcada na expressão da proteína do PCNA nos xenoenxertos de tumor. Um aumento na expressão de E-caderina foi observada em tumores SATB1-KO em comparação com tumores PC-3M. Estes resultados indicam que a expressão SATB1 em células PC-3M pode ser um requisito para o crescimento do tumor e agressividade destas células.

(A) SATB1 knockout em células PC-3M, resultou numa diminuição no volume do tumor. (B) Fotografia de xenotransplante tumoral em tumores SATB1-KO PC-3M e. (C) Os tumores foram retirados, pesados ​​e medidos no final do estudo. O peso do tumor foi significativamente reduzido em tumores SATB1-KO em ratinhos nus atímicos. Cerca de 1 × 10

6 células foram injectadas nos flancos de cada ratinho para iniciar ectópica de tumor da próstata tal como descrito em ‘materiais e métodos’. O tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana em duas dimensões ao longo do estudo. O volume do tumor (mm3) e peso molhado dos tumores são representados como a média de 8-10 tumores em tumores SATB1-KO PC-3M de controlo PC-3M e.