Abstract

Fundo

A chaperona molecular Hsp90 é um novo alvo promissor na terapia do cancro e inibidores selectivos da Hsp90 estão actualmente em ensaios clínicos. Anteriormente, estes inibidores têm sido relatados para induzir quer a paragem do ciclo celular ou a morte celular em células cancerosas. Se a paragem do ciclo celular é reversível ou irreversível, geralmente não foi avaliado. Aqui temos examinado em detalhes a prisão e morte celular respostas do ciclo celular de linhas de pequenos humanos células cancerosas nos pulmões para a inibição de Hsp90.

Metodologia /Principais Achados

Em ensaios MTT, cancro do pulmão de pequenas células células mostraram uma resposta bifásica ao inibidores geldanamycin e radicicol Hsp90, com baixas concentrações causando prisão proliferação e concentrações elevadas, causando morte celular. Avaliação da actividade intracelular de Hsp90 usando a perda de expressão da proteína cliente mostraram que as concentrações que inibiram geldanamicina Hsp90 correlacionada de perto com as causadoras de prisão proliferação mas não morte celular. A prisão proliferação induzida por baixas concentrações de geldanamycin não foi revertido por um período de mais de trinta dias após a remoção de drogas e mostrou características de senescência. populações raras de células de câncer de pulmão de pequenas células variante pode ser isolado que tinha alterações genéticas adicionais e não mais foram submetidos a prisão proliferação irreversível em resposta aos inibidores da Hsp90

Conclusões /Significado

Nós concluímos que:. ( 1) inibição Hsp90 primariamente induz senescência prematura, ao invés de morte celular, em pequenas células de câncer de pulmão de células; (2) As células do cancro do pulmão de pequenas células pode ignorar esta senescência através de novas alterações genéticas; (3) inibidor de Hsp90 induzida morte celular em células de cancro do pulmão de células pequenas é devido à inibição de um alvo com excepção de Hsp90 citosólica. Estes resultados têm implicações no que diz respeito à forma como estes inibidores irão comportar-se em ensaios clínicos e para a concepção de inibidores futuros nesta classe

Citation:. Restall IJ, Lorimer IAJ (2010) Indução de senescência prematura por Hsp90 inibição em pequenas células do cancro do pulmão. PLoS ONE 5 (6): e11076. doi: 10.1371 /journal.pone.0011076

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de dezembro de 2009; Aceito: 17 de maio de 2010; Publicação: 11 de junho de 2010

Direitos de autor: © 2010 Restall et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações para IL dos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde (number62797 subvenção) (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html) e da Canadian Cancer Society (número de concessão 020.121) (http 😕 //www.cancer.ca/canada-wide.aspx sc_lang = en). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução funções

Hsp90 como uma chaperona em células normais, promovendo a dobragem correcta de ambas as proteínas sintetizadas de novo e proteínas que foram parcialmente desnaturada devido ao stress [1]. Parece ser principalmente envolvidos em estágios tardios da dobragem, provavelmente por reconhecer superfícies hidrofóbicas expostas nas proteínas parcialmente dobradas. O mecanismo básico da dobragem de proteínas induzida por Hsp90 de comutação envolve conformacional entre conformações aberta e fechada, que é regulada por meio de hidrólise de ATP [2]. As taxas de hidrólise de ATP Hsp90 são controlados por sua vez, por sua associação com vários cochaperones.

Embora o número de proteínas conhecidas para exigir Hsp90 para a dobragem correcta continua a aumentar, a Hsp90 é claramente selectivo para um subconjunto de proteínas celulares. Estas incluem um certo número de proteínas com actividade oncogénica conhecido, incluindo Her2, RAF1 Cdk4 e [3]. Em alguns casos, a Hsp90 mostra associação preferencial com o mutante, formas oncogénicas de proteínas; este tem sido demonstrado para ambos quinase Src e o receptor EGF [4] – [6]. Hsp90 também mostra um aumento da associação com cochaperones e maior atividade ATPase em células cancerosas, tanto

in vitro

e

in vivo

[7]. Por estas razões, há um interesse considerável na Hsp90 como um alvo para terapia do câncer.

A geldanamicina e radicicol são dois produtos naturais estruturalmente não relacionados que se ligam ao site da ATP ligação de Hsp90, bloqueando o ciclismo conformacional que é necessário para a sua actividade de chaperona. Estes compostos apresentam boa selectividade para a Hsp90, embora também se ligam a Hsp90 o retículo endoplasmático parálogo Grp94 e a Hsp90 TRAP1 parálogo mitocondrial em concentrações mais elevadas [8] – [10]. Enquanto estes compostos estabelecer no princípio de que a Hsp90 é um alvo “druggable” do ponto de vista farmacologia, fraca solubilidade e toxicidades não-específicos os torna inadequados para utilização em seres humanos. versões derivadas de geldanamicina foram produzidos que têm propriedades farmacológicas melhoradas, embora eles ainda têm algumas das limitações do composto progenitor [11]. Apesar disso, há evidências de alguns ensaios que a inibição de Hsp90 é possível, com base na análise de biomarcadores em linfócitos de pacientes [12], [13] e amostras de tumor [14]. Há também alguma evidência de atividade anticancerígena [15]. Recentemente novos inibidores de Hsp90 têm sido desenvolvidos que não tem as limitações dos compostos anteriores, e estas estão agora a entrar ensaios clínicos [11]. Com estes avanços na farmacologia da inibição da Hsp90, uma nova área crítica de investigação será a identificação de subconjuntos de pacientes com câncer que são mais susceptíveis de beneficiar de inibição de Hsp90.

O cancro do pulmão é a maior causa de mortes por câncer no mundo todo. Cerca de 15% dos cancros do pulmão são de um subtipo conhecido como câncer de pulmão de pequenas células. Este cancro geralmente se apresenta como doença metastática e, geralmente, não é tratado com cirurgia. cancro do pulmão de pequenas células geralmente responde muito bem à radiação e quimioterapia inicialmente, mas a maioria dos pacientes com recaída da doença resistente e morrem dentro de dois anos [16]. A maioria dos cancros do pulmão de pequenas células têm propriedades neuroendócrinos e secretam ativamente hormônios polipeptídicos [17]. Estes hormônios secretados causar uma série de síndromes paraneoplásicas que são complicações comuns de câncer de pulmão de pequenas células.

Aqui nós investigamos a resposta das células cancerosas do pulmão de pequenas células à inibição Hsp90. Um estudo anterior havia mostrado que os inibidores de Hsp90 induzir a morte celular em células pequenas do cancro do pulmão de células através da activação da via intrínseca da apoptose [18]. Nossos resultados estão de acordo com isso, mas observou-se que a morte celular ocorre apenas em concentrações muito mais altas do que as requeridas para a inibição da Hsp90 citosólica. Observa-se que o tratamento de células de câncer de pulmão de pequenas células com inibidores de Hsp90 em concentrações suficientes para inibir citosólica Hsp90 induz senescência prematura ao invés de morte celular.

Resultados

Resposta de câncer de pulmão de pequenas células humanas As linhas celulares para inibição de Hsp90

a linha de células pequenas do pulmão humano de células de cancro H69 apresentaram uma resposta bifásica com o tratamento com uma gama de concentrações de geldanamicina (Figura 1A). Em um ensaio de MTT, um 48 h de exposição de células a 0,1 uM geldanamicina um decréscimo no número de células viáveis ​​em aproximadamente 40%. O aumento da concentração de geldanamicina de até 3 uM não causou uma redução ainda maior no número de células viáveis. Com concentrações de geldanamicina 4 mm, o número de células viáveis ​​diminuiu para H69 essencialmente zero. Radicicol, um segundo inibidor de Hsp90 que é estruturalmente relacionado com geldanamicina, também deu uma curva de dose resposta bifásica com células H69, embora com uma fase de plateau menos distintas (Figura 1B). Duas outras linhas celulares de cancro de pulmão de células pequenas (H187 e H889) também mostram uma resposta bifásica à geldanamicina (Figura 1C e D); No entanto, a linha de células U87MG glioblastoma mostrou apenas a primeira fase desta resposta (

ie

. a fase visto em baixas concentrações de geldanamicina) (Figura 1E).

A, ensaio MTT de H69 células tratadas com geldanamicina, durante 48 h; B, H69 ensaio MTT de células tratadas com radicicol durante 48 h; C, o ensaio de MTT de células de câncer de pulmão de pequenas células H187 com geldanamycin para 12, 36 e 60 h; D, ensaio MTT de células H889 tratadas com geldanamicina, durante 48 h; E, ensaio MTT de células de glioblastoma U87MG tratados com geldanamicina, durante 48 h; F, H69 células tratadas com geldanamicina, durante 48 h e analisadas por (•) de células viáveis ​​(○) e contagens totais utilizando um analisador de viabilidade celular de células XR-Vi. As barras de erro mostram a média ± DP de três repetições.

Como a primeira fase pode ser, potencialmente, devido a qualquer inibição da proliferação celular ou a morte selectiva de um subconjunto de células SCLC, outros ensaios foram realizados para distinguir entre estas possibilidades. A resposta de células H69 para o tratamento com uma gama de concentrações de geldanamicina foi ensaiada por contagem de células, usando exclusão com azul de tripano para distinguir células viáveis ​​de células mortas (Figura 1F). As contagens de células vivas mostrou também uma resposta bifásica quando ensaiado por este método. As contagens de células totais foram semelhantes para viver contagens de células na primeira fase da curva de resposta bifásica mas divergiram na segunda fase. Estes dados mostram que a geldanamicina induz principalmente prisão proliferação em células H69 em concentrações baixas, mas induz a morte celular em altas concentrações. Os dados na Figura 1C, que mostram ensaios MTT sobre células H187 tratadas durante diferentes períodos de tempo (12, 36 e 60 h) com geldanamicina, são consistentes com esta conclusão, como a primeira fase é evidente apenas com tratamentos mais prolongados quando há tempo para a proliferação celular significativa para tomar lugar no controlo. Isto mostra também que a morte de células a concentrações elevadas de geldanamicina acontece relativamente rapidamente (

ie

em menos de 12 h).

Resposta de células H69 após a retirada da Hsp90 inibição

detenção proliferação induzida por drogas pode ser reversível ou irreversível (

ie

senescência e similares). Para distinguir entre estas possibilidades, H69 células foram tratadas com diferentes concentrações de geldanamicina por dois dias. O fármaco foi então removido e as contagens de células viáveis ​​foram monitorizadas. A proliferação celular recuperado do tratamento com concentrações de geldanamicina de 50 nM ou menos. No entanto, após o tratamento com 100 nM de geldanamicina, uma população de células viáveis ​​que permaneceu não aumentou ao longo de um período de tempo superior a trinta dias após a remoção da droga (Figura 2A). Resultados semelhantes foram obtidos com as linhas H187 e H889 pulmão de células pequenas células de cancro (Figura 2B e Figura S1A) e H69 em células tratadas com o Hsp90 clinicamente relevante inibidor 17-AAG (Figura 2C). células H69 necessário um mínimo de 24 h de exposição para a geldanamicina para induzir a paragem irreversível da proliferação (Figura 2D) e a induo da paragem irreversível da proliferação não foi afectada por inibição de caspases (Figura 2E). Para comparação, a mesma experiência foi realizada na linha celular de glioblastoma humano U87MG (Figura 2F). Estas células recuperar o crescimento após o tratamento com 100 nM de geldanamicina e também recuperar de um tratamento com uma concentração dez vezes superior de geldanamicina. A prisão proliferação sustentada induzida por geldanamicina não é, portanto, uma resposta universal das células cancerosas, mas sim é cancro cell- tipo específico.

As células foram tratadas durante 48 horas com a concentração indicada de inibidor, o qual foi, em seguida, removido. As contagens de células viáveis ​​foram então determinados nos tempos indicados após a remoção do inibidor. A, as células H69 tratados com a geldanamicina; B, células H187 tratadas com a geldanamicina; C, as células H69 tratada com 17-AAG. D, células H69 tratadas com 100 nM de geldanamicina de 4, 12 ou 24 h. E, células H69 foram tratadas durante 48 horas com 100 nM de geldanamicina na ausência ou na presença de 100 uM de Z-VAD-FMK, um inibidor geral de caspases. tratamento de Z-VAD-FMK foi iniciada 1 h antes da adição de geldanamicina. F, as células U87MG tratados com geldanamycin.

Para confirmar a paragem do crescimento sustentado por um segundo método, a incorporação de BrdU em H69 células que tinham sido expostas a 100 nM geldanamycin também foi avaliado. Consistente com as contagens de células viáveis, este ensaio mostraram que as células H69 não conseguiu recuperar a sua capacidade proliferativa depois de remoção de geldanamicina (Figura 3A).

. As células H69 foram tratadas durante 48 horas com 100 nM de geldanamicina. Geldanamicina foi então removido. Seis ou oito dias após a remoção da droga, 25000 células tratadas (GA) por poço foram plaqueadas em noventa e seis placas de poços juntamente com o mesmo número de células não tratadas para comparação H69 (sem GA). As células foram deixadas a absorção de BrdU durante 16 h e a incorporação de BrdU foi, em seguida, ensaiada como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados foram normalizados para os valores para as células não tratadas. Os dados apresentados são a média ± DP de seis réplicas. B. As células foram tratadas durante 48 h com geldanamicina. Os lisados ​​celulares totais foram então recolhidas e analisadas por transferência de Western utilizando anticorpos para as proteínas indicadas. O painel inferior mostra uma mancha manchado de proteína total com negro de amido antes da incubação de anticorpos. Quantidades iguais de DMSO foram adicionados às células para cada tratamento, excepto na pista mais à esquerda, onde DMSO foi omitido.

As alterações nas proteínas Hsp90 cliente e proteínas de choque térmico em resposta à inibição de Hsp90

Os efeitos de diferentes concentrações de geldanamycin em clientes Hsp90 conhecidos também foram avaliadas em H69 células (Figura 3B, direito quatro pistas de blot). depleção substancial da Hsp90 proteínas clientes CDK4 e RAF1 foram vistos em concentrações tão baixas como geldanamicina 50 nM. Uma segunda resposta bem descrito de células para a inibição de Hsp90 é a indução de outras proteínas de choque de calor que ocorre através da activação de HSF1 [19]. Tal como acontece com as respostas de proteína cliente, as concentrações de geldanamicina tão baixas quanto 50 nM causou aumentos de Hsp70, Hsp27 e Hsp90α /β. Estas concentrações de geldanamicina paralelos aqueles que causam paragem da proliferação, mas são cerca de 100 vezes menos do que as concentrações que causam a morte celular substancial.

U87MG e as células H69 apresentaram sensibilidade muito semelhantes a geldanamicina com respeito à diminuição da proteína de choque térmico e do cliente aumentos de proteína (Figura 3B). Isto indica que a diferença de comportamento entre as células H69 e U87MG após a remoção do geldanamycin não é uma consequência das diferenças no metabolismo da droga (

por exemplo

multidroga transportador de atividade ou diaforase atividade, ambos os quais afetam a atividade geldanamycin [20], [21]). Em vez disso, parece que as diferentes respostas destas células após a retirada de geldanamicina são devidas a diferenças que estão a jusante da inibição de Hsp90. A análise Western blot confirmou que H69 células faltava p53 detectável (Figura 3B), de acordo com Smith

et al

., que mostraram que existe uma mutação parada em

P53

exão 5 nesta célula linha [22]. p16INK4a estava presente em H69 células e os seus níveis não foram afetados pelo tratamento com geldanamycin por 48 h (Figura 3B).

marcadores de senescência em células de câncer de pulmão de pequenas células presos de crescimento

A prisão proliferação irreversível induzida por inibição de Hsp90 em células de cancro do pulmão de células pequenas sugeriu que estas células se tornam senescentes tinham. Para avaliar esta ainda, marcadores adicionais de senescência foram avaliados. A Figura 4A mostra a morfologia de culturas em suspensão de células não tratadas H69 oito dias após a remoção geldanamicina. As células tratadas mostrar algum alargamento e aumento da granularidade citoplasmática, traços característicos de células senescentes. Outra característica comum de células senescentes, é a presença de focos associada a senescência heterocromatina (SAHF) [23]. Consistentes com a indução de senescência, a inibição da Hsp90 com geldanamicina, levou à formação de SAHF em células H69 como demonstrado por coloração com DAPI (Figura 4B). SAHF foram mantidas após a remoção da geldanamicina, como esperado para um marcador de senescência e foram enriquecidas em histona H3 trimetilada em lisina 9, consistente com estudos anteriores (Figura S1B) [24]. A activação de uma resposta a danos no ADN é uma característica importante de ambos senescência replicativa e prematura que contribui para o fenótipo paragem do crescimento de células senescentes [25]. Uma característica central da resposta a danos no ADN, é a geração de histona H2AX fosforilada (γH2AX) em locais adjacentes a danos no ADN. Ambos os geldanamicina e radicicol tratamentos aumentaram os níveis de γH2AX em H69 células (Figura s1c). níveis γH2AX permaneceram elevados por até seis dias após a remoção geldanamycin, o ponto mais tempo avaliado (Figura 4C). Isto é consistente com os relatos de que as células senescentes manter uma resposta de dano de ADN activado por um período prolongado após a indução da senescência [25], [26].

. As células H69 foram tratadas com DMSO por si só ou 100 nM durante 48 h a geldanamicina. Geldanamicina foi então removido. Oito dias mais tarde, as células foram deixadas a assentar em lamelas de poli-L-lisina-revestidas, fixadas com paraformaldeído e fotografado sob contraste de fase com uma lente objectiva 63X. B. SAHF formação após o tratamento de células com inibidores de Hsp90. As células H69 foram tratadas com DMSO ou 100 nM durante 48 h a geldanamicina. As células foram então fixadas, coradas com DAPI e examinadas por microscopia de fluorescência. C. As células H69 foram tratadas com DMSO (controlo) ou 100 nM de geldanamicina. Geldnamycin DMSO e foram, em seguida, removido no dia 0. Os lisados ​​celulares totais foram recolhidos nos dias indicados após a remoção geldanamicina e analisadas para os níveis de γH2AX H2AX e por Western blotting. A densitometria mostra o gráfico para análises de Western blot de três réplicas biológicas. Os dados foram normalizados para as células de controlo tratados com veículo e são apresentados como a média ± SE.

Isolamento de células variante de H69 que ignoram induzida por geldanamicina senescência

H69 Apesar de as células mantiveram uma Estado proliferação-preso por mais de trinta dias após a remoção da geldanamicina, após aproximadamente 40 dias de uma população de células não começar a proliferar numa experiência. Nós designamos esta população como células H69 /41d. H69 /41d células têm uma morfologia distinta: H69, enquanto as células são células não-aderentes, que formam agregados irregulares, as células da variante, ao mesmo tempo, não aderente, formam esferas apertadas que lembram os observados com populações de células estaminais (Figura 5A). Após reexaminar, estas células ainda foram submetidos a prisão proliferação em resposta a 100 nM geldanamicina, mas foram capazes de recuperar a capacidade proliferativa após a remoção do fármaco, semelhante ao que foi observado em células de glioblastoma (Figura 5B). H69 /41d células também foram capazes de recuperar a capacidade proliferativa após o tratamento com o inibidor de Hsp90 radicicol (Figura 5C). Em comparação com a linha celular H69-mãe, células H69 /41d mostraram respostas semelhantes à inibição de Hsp90 no que diz respeito à inibição da proliferação na presença do fármaco, embora a morte celular tenderam a ocorrer para concentrações ligeiramente mais baixas do que o observado com as células H69 (Figura 5D). A degradação de proteínas clientes e indução de outras proteínas de choque térmico também foi semelhante nas duas linhas celulares (Figura 6A). Como acima, isto exclui diferenças no processamento de drogas entre as duas populações de células, e indica que as diferenças são devido a eventos a jusante da inibição da Hsp90 que afetam especificamente se as células sofrem uma paragem proliferação reversível ou irreversível. formação SAHF também foi prejudicada em H69 /41d células (Figura 6B). Em células H69, SAHF maximamente foram detectados em cerca de 35% das células (Figura 6C). Em contraste, o tratamento geldanamicina só causou um aumento modesto em SAHF em células H69 /41d e SAHF foram detectados em 4,5% de células maximamente (Figura 6c).

. Fotografias de H69 e H69 /41d células sob microscopia de fase, a baixo (painéis superiores) e alta (painéis inferiores) de ampliação; B. H69 e H69 /41d células foram tratadas com 100 nM de geldanamicina durante 48 h. Geldanamicina foi então removido e os números de células viáveis ​​foram avaliados nos tempos indicados após remoção da droga. C. H69 e H69 /41d células foram tratadas com 5 uM radicicol durante 48 h. Radicicol foi então removido e os números de células viáveis ​​foram avaliados nos tempos indicados após remoção da droga. D. Ensaio de MTT de células H69 /41d tratadas durante 48 h com geldanamicina.

H69 e H69 células /41d foram tratadas durante 48 h com geldanamicina ou DMSO como controlo de veículo. Os lisados ​​celulares totais foram recolhidos A. depois de 48 h de tratamento e analisadas por transferência de Western tal como na Figura 3. As células tratadas com DMSO B. foram coradas para SAHF 2 dias depois de remover o DMSO. células tratadas com geldanamicina foram coradas para SAHF 2, 4 e 6 dias após a remoção da droga. As imagens de microscopia de fluorescência representativos de H69 e H69 /41d núcleos celulares, seis dias após a remoção da geldanamicina, são mostrados. C. SAHF em H69 (cinza claro) e H69 /41d células (cinza escuro) foram contadas nos tempos indicados após a retirada da droga. Os dados são expressos como a percentagem de núcleos que são SAHF positivo. As barras mostram a percentagem média ± SE. D. extractos celulares totais de células H69 e H69 não tratada /41d foram analisadas quanto à expressão de proteína p21 por Western blotting.

Para avaliar directamente a relação genética de células com células H69 H69 /41d, o DNA foi isolado a partir de ambas as linhagens celulares e analisados ​​usando Affymetrix Genome-wide SNP humano matriz 6.0 chips, que contêm sondas para 900.000 polimorfismo de nucleotídeo único e um número semelhante de sondas para avaliar cópia número variação. Figura S2 mostra cariótipos das duas linhas de células reconstruídas a partir destes dados (cada um é comparado com um cariótipo referência Affymetrix). As células H69 mostrar extensas aberrações cromossómicas como esperado para as células cancerosas. Estas perdas, ganhos e regiões de amplificação /cópia número variação são muito semelhantes entre H69 e H69 células /41d, mostrando inequivocamente que eles são clonalmente relacionada. Algumas diferenças eram evidentes entre as duas linhas celulares. Estes incluem um Mbp eliminação 4.8 na única cópia do cromossomo 2 que contém aproximadamente dezenove genes e uma Mbp eliminação 9.6 em uma cópia do cromossomo 11, que contém cerca de 83 genes. Há também um ganho do braço longo do cromossomo 3 e uma perda de um longo braço parcial do cromossomo 15. No entanto, a análise do número de SNP /copy não apontar para um único locus genético definido que poderia explicar por que H69 células /41d são capaz de evadir senescência Hsp90 induzida por inibidor. Numa segunda abordagem para determinar o mecanismo através do qual estas células evadir senescência Hsp90 induzida por inibidor, as células foram testadas para uma série de proteínas que têm sido anteriormente demonstrado que têm importantes papéis na senescência. p21 (CDKN1A, p21Waf1 /Cip1) é uma tal proteína que é de particular interesse uma vez que foi demonstrado induzir a senescência em células cancerosas falta p53 [27]. p21 é expresso em células H69 mas é indetectável em H69 /41d células (Figura 6D). Dada a sua função conhecida na indução e manutenção da senescência [26], a perda de expressão de p21 fornece uma explicação plausível para o fracasso das células H69 /41d se submeter a senescência, em resposta aos inibidores de Hsp90.

Discussão

Em estudos anteriores, a resposta mais comumente descrito de células cancerosas para inibição de Hsp90 foi paragem do ciclo celular. Esta paragem do ciclo celular tem sido geralmente assumido ser reversível na natureza, embora a maioria dos estudos não resolver isso diretamente. a paragem do crescimento pode ocorrer em qualquer G1 /S ou transição G2 /M [28], [29] e é provável que seja uma consequência da dependência de Hsp90 de proteínas, tais como CDK4, cdc2 e polo-like-quinase [30] – [ ,,,0],32]. Num subconjunto de tipos de células de cancro, inibidores de Hsp90 foram mostrados para induzir a apoptose. Estes incluem células de câncer de pulmão de células pequenas e células de mieloma múltiplo [18], [33].

Além de parada do ciclo celular transitória e morte celular, um terceiro destino celular para células cancerosas é a senescência. No caso de células cancerosas, isto é por vezes referido como “prematura” ou “acelerada” senescência celular para distingui-la da senescência replicativa que as células normais sofrem ao atingir o seu limite de Hayflick [34], [35]. Senescência em cancro tem sido estudada em dois contextos: o primeiro destes é a senescência visto em resposta à activação do oncogene, onde pode desempenhar um papel na protecção dos organismos de desenvolvimento de cancro; a segunda é como uma resposta à terapêutica do cancro [36]. agentes quimioterápicos que danificam DNA parecem induzir a senescência a uma extensão muito maior do que os agentes que têm como alvo os microtúbulos [37]. Isto é mais provável de ocorrer com exposição a doses mais baixas de fármaco, com doses mais elevadas que provocam a apoptose. senescência induzida por quimioterapia foi observada tanto em cultura de células e em modelos animais [38].

A chave, características de definição de células senescentes são de que eles permanecem metabolicamente activa, mas sofrer uma retirada sustentada do ciclo celular que é não revertida por estímulos mitogénicos padrão. Após a exposição transitória a baixas concentrações de geldanamicina, células de cancro do pulmão de células pequenas permaneciam vivos e metabolicamente ativo (tal como indicado por exclusão com azul de tripano e ensaios MTT). No entanto, estas células foram submetidos a uma proliferação de captura que foi mantida durante mais de trinta dias, a despeito da adição regular de meio fresco contendo soro fetal de vitelo, uma fonte rica de mitogénios. A prisão proliferação foi evidente tanto da contagem de células vivas e de ensaios de incorporação de BrdU.

Além de prisão proliferação permanente, marcadores adicionais de senescência foram desenvolvidos, embora nenhum deles é visto atualmente como sendo um marcador definitivo da o estado de senescência [39]. Um conjunto característico de mudanças morfológicas foram descritas para as células senescentes, que incluem o alargamento celular e um aumento da granularidade do citoplasma [40]. Esses recursos eram evidentes em células de câncer de pulmão de pequenas células H69 em que sustentadas prisão proliferação tinha sido induzida por inibidores de Hsp90. (Não mostram o achatamento descrito para células aderentes, como as células do cancro do pulmão de pequenas células utilizadas neste estudo crescer em suspensão.) SAHF são outro marcador que é vulgarmente observada em células senescentes e que se pensa ter um papel na manutenção da fenótipo senescente. SAHF estavam presentes em pequenas células de cancro de pulmão de células em que a proliferação sustentada de detenção tinha sido induzida por inibidores de Hsp90. Expressão de SAHF foi mantida durante até seis dias após a remoção de inibidor de Hsp90 (o ponto de tempo mais longo examinados) e o decurso de tempo para a sua aparência foi semelhante aos estudos anteriores sobre a indução da senescência prematura por vários agentes [41], [42] . A activação da resposta a danos no ADN também é vulgarmente observado em senescência, onde tem um papel em ambos a iniciação e manutenção do fenótipo senescente [25], [26]. inibidores de Hsp90 (tanto geldanamicina e radicicol) activada uma resposta danos no ADN que foi mantida após a remoção do inibidor. Esta conclusão também é consistente com um fenótipo de senescência e fornece um mecanismo pelo qual estes inibidores ativar a senescência.

danos no DNA, tanto telomérica ou não-telomérica, é o indutor mais amplamente caracterizado de senescência. Para além de ser um marcador de senescência, a activação da resposta a danos no ADN por inibidores de Hsp90 também proporciona um mecanismo através do qual eles induzir a senescência em células de cancro do pulmão de células pequenas. Estudos anteriores também apontou para uma ligação entre Hsp90 e danos ao DNA:. ambas telomerase eo DNA anemia via de resposta danos Fanconi são dependentes de Hsp90 para a sua actividade [43], [44]

β- associada à senescência galactosidase (SAβgal) também tem sido amplamente utilizada como um marcador de senescência [35]. SAβgal actividade é detectada como uma consequência da expansão do compartimento lisossomal em células senescentes, mas não é necessário para indução ou manutenção senescência [45]. células de câncer de pulmão de pequenas células tratados com inibidores da Hsp90 não foram positivos para SAβgal. Adriamicina, também não induziu SAβgal em células de cancro do pulmão de células pequenas, quando utilizado em concentrações que este marcador induzidas em outros tipos de células de cancro. Isto sugere que SAβgal não pode ser um marcador útil da senescência no cancro do pulmão de pequenas células. Uma possível explicação é que estas células têm citoplasma escasso e são células secretoras especializadas que podem ter um compartimento lisossomal relativamente pequeno.

Tomados em conjunto, os dados anteriores mostram que os inibidores de Hsp90 induzem uma proliferação sustentada de detenção que tem características consistentes com senescência prematura. Este senescência prematura ocorreu em concentrações de geldanamicina que correlacionaram de perto com as concentrações necessárias para induzir a degradação de proteínas Hsp90 cliente bem estabelecidos e para induzir a expressão de outras proteínas de choque de calor (um marcador amplamente utilizado de inibição de Hsp90). senescência prematura também foi induzida por 17-AAG (tanespimycin; 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina), um derivado de geldanamicina, que foi testado em ensaios clínicos [46]. 17-AAG induzida senescência a uma concentração que é semelhante às concentrações obtidas no plasma de pacientes tratados com a dose máxima tolerada do presente composto [12], o que sugere que esta resposta é clinicamente relevante. indução da senescência por inibidores de Hsp90 não requer p53 nem Rb, dado que ambas estas supressores de tumores são conhecidos por ser mutado na linha celular H69 usado neste estudo.

Em algumas experiências, as populações de células que começam a crescer depois cultura de longo prazo de células senescentes H69. Uma destas populações de células, designado H69 /41d, foi caracterizada em detalhe. SNP e do número de cópias análise dessas células mostra que, enquanto eles são claramente derivadas de células H69 eles têm um conjunto distinto de alterações genéticas. Estas células apresentam respostas semelhantes à inibição de Hsp90 como o pai H69 células no que diz respeito à inibição da proliferação na presença do fármaco e a indução de morte celular em concentrações elevadas de geldanamicina. No entanto, elas passam por uma proliferação de captura reversível, e não irreversível, em resposta à inibição de Hsp90. H69 /41d células também mostram respostas idênticas à linha de células-mãe com respeito à degradação de proteínas Hsp90 cliente e indução de outras proteínas de choque de calor. Assim, esta forma de “resistência” à inibição Hsp90 é claramente distinto do descrito em estudos anteriores, onde a resistência foi devido a alterações nas enzimas que metabolizam drogas e foi refletida em um requisito para doses mais elevadas para ver efeitos celulares [47]. O isolamento destas células demonstra que, em princípio, pequenas células de câncer de pulmão de células com alterações genéticas adicionais podem fugir a senescência prematura induzida por Hsp90. p21 (CDKN1A) foi previamente demonstrado ser um importante regulador da senescência, uma propriedade que parece ser independente da sua actividade inibidora contra as cinases dependentes da ciclina [48]. p21 é regulada por ambos os mecanismos de p53 e independentes de p53 e pode induzir sensescence em células que carecem de p53 (como é o caso para as células H69) [27].