Abstract

Os cânceres foram revelados para ser extremamente heterogénea em termos de frequência e tipos de mutações presentes em células de tumores malignos diferentes. Assim, é provável que o tratamento clínico uniforme não é ideal para todos os pacientes, e que o desenvolvimento de regimes terapêuticos individualizados pode ser benéfico. Descrevemos a geração de múltiplos, originais pequenos peptídeos nove para trinta e quatro aminoácidos de comprimento, que, quando marcada com o radioisótopo

32 P, se ligam com eficiência muito diferentes de linhas celulares derivadas de diferentes adenocarcinomas do cólon. Além disso, a mais eficaz destes péptidos permanentemente transfere o

32P radioisótopo de proteínas celulares de cancro colorrectal no prazo de duas horas a uma velocidade que é mais de 150 vezes mais elevada do que em linhas celulares derivadas de outros tipos de cancro, ou a partir dos tecidos normais testados. Actualmente, os únicos dois agentes radioimmunotherapeutic aprovados pela FDA em uso empregam ambos os anticorpos dirigidos contra o marcador CD20 de células B para o tratamento de linfoma não-Hodgkin. Ao utilizar o método aqui descrito, grandes números de diferentes peptídeos

32P-marcados podem ser facilmente produzidos e ensaiados contra um amplo espectro de tipos de cancro. Este relatório propõe o desenvolvimento ea utilização de peptídeos

32 P-rotulados como potenciais terapias individualizadas de ligação de peptídeos para o tratamento de pacientes com adenocarcinoma de cólon

Citation:. Abraham JM, Cheng Y, Hamilton JP, Paun B, Jin Z, R Agarwal, et al. (2008) Geração de pequeno

32 P marcado Peptides como uma potencial abordagem à terapia do cancro colo-rectal. PLoS ONE 3 (6): e2508. doi: 10.1371 /journal.pone.0002508

editor: Edathara Abraham, da Universidade de Arkansas, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Abril de 2008; Aceito: 06 de maio de 2008; Publicação: 25 de junho de 2008

Direitos de autor: © 2008 Abraham et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 e 7R21 /R33CA106763 do Instituto Nacional do Câncer

competir interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

recentes descobertas referenciais de forma convincente documentou a grande heterogeneidade genética entre os cânceres humanos, particularmente tumores colorretais, ao estabelecer a existência de um pequeno número de genes “montanhas” frequentemente mutados e um número muito maior de gene “colinas” mutado a frequências muito mais baixas [1], [2]. Esse alto grau de diversidade entre os cancros colo-rectais humanos sugere que as estratégias de tratamento individualizado uma grande promessa na intervenção clínica bem sucedida. Vários imunoterapias anticancerígenos estão atualmente em uso, incluindo Herceptin, Rituxin e Avastin, um anticorpo monoclonal dirigido contra o VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), que foi aprovado para o tratamento do cancro colorectal [3] – [9].

A radioimunoterapia (RIT) é uma tecnologia emergente com, até agora apenas dois protocolos aprovados pela FDA, ambos dirigidos contra o linfoma não-Hodgkin (NHL). Cada protocolo utiliza um anticorpo monoclonal dirigido contra o marcador de células B CD20 e pode entregar

90Y (Zevalin) ou

131I (Bexxar), cada um dos quais gera electrões (partículas beta) que danificam o ADN, resultando em morte celular [10], [11]. Actualmente, não foi ainda RIT aprovado para o tratamento do cancro colo-rectal [12].

recentemente relatado um conjunto de nove diferentes decapéptidos, cada um variando dos outros por apenas uma a três aminoácidos, que, quando marcados com o beta-emissor

32 P, obrigado a e permanentemente entregue, em graus variados, este radioisótopo de linhas celulares derivadas de um painel de diferentes adenocarcinomas colorretais [13]. O mais eficiente decapéptido

32P-marcado resultou na incorporação permanente de radioisótopo em proteínas celulares de adenocarcinoma do cólon, a uma taxa mais de 100 vezes maior do que em linhas celulares derivadas de uma variedade de outros cancros ou do cólon normal, do rim ou do esófago.

a seguir, relata uma classe de peptídeos ligeiramente maiores (até 34 aminoácidos de comprimento) que contêm sequências de péptidos mais díspares, resultando em uma ampla gama de propriedades de absorção de ligação e de radioisótopos celulares. Cada péptido ácido 34 amino contém um núcleo de ácido nove amino na sua extremidade amino para permitir

32P rotulagem pela proteína quinase A, um núcleo de ácido de oito aminoácidos na sua extremidade carboxi, e até 17 aminoácidos adicionais que alterar drasticamente ambos a sua ligação às células e sua incorporação permanente do radioisótopo em proteínas celulares de cancro do cólon. Estes resultados suportam uma maior exploração desta estratégia para desenvolver potenciais novos regimes terapêuticos individualizados contra cancros do cólon.

Resultados

Produção de peptídeos

32 P-rotulados e que se ligam a células de adenocarcinoma de cólon

Anteriormente, reportamos a descoberta de nove diferentes decapéptidos

32P-rotulados, cada um variando de um outro apenas por um a três aminoácidos, que exibiram capacidades mais díspares para se ligarem e transferência radioisótopo permanentemente para proteínas em linhas celulares estabelecida a partir de um painel de adenocarcinomas do cólon. O mais eficiente destes decapéptidos

32P-rotulados emitido permanentemente radioisótopo a células do cancro do cólon mais do que 100 vezes mais eficiente do que em linhas celulares derivadas de outros cancros ou tecidos normais testados. Relata-se a produção e identificação de uma nova série de péptidos, até 34 aminoácidos de comprimento, cujas sequências de aminoácidos alterar drasticamente a sua capacidade para se ligarem e permanentemente facilitar

incorporação de 32P em células. A Figura 1 é uma representação esquemática do modelo experimental, que ilustra a clonagem de um fragmento de ADN contendo 17 codões gerados aleatoriamente no local BamHI enzima de restrição de pGEX-2TK. Após a transformação bacteriana, clones individuais foram selecionados e ampliada para produzir um conjunto diversificado de peptídeos

32 P-rotulados. Se não há codões de paragem estavam presentes na sequência de ADN aleatória, em seguida, um péptido de 34-resíduo foi gerado, flanqueada na sua extremidade amino da proteína-9 resíduo cinase A rotulagem motivo e no seu terminal carboxilo por uma sequência de 8 resíduos. Como esperado, em vários clones, um codão de paragem foi inserido, resultando em péptidos truncados; No entanto, todos estes péptidos truncados continha a proteína cinase A porção de substrato. Estes diversos péptidos foram incubadas com várias linhas diferentes de células durante duas horas, as células aderentes foram lavadas três vezes, e a radioactividade remanescente ligada a células foi ensaiada tanto imediatamente ou a seguir à incubação durante a noite em meio completo.

Um produto de PCR contendo 17 codões aleatórios foi inserido no local BamHI do vector pGEX-2TK produção de várias proteínas de fusão glutationa-S-transferase, que foram obrigados a glutationa-sefarose, e marcado com

32P usando cinase de proteína A. Após a lavagem e a trombina digestão, o rotulado péptidos foram incubadas com várias linhas diferentes de células e ensaiaram-se.

a Figura 2 mostra a variação dramática dos níveis de permanente

32P incorporação na linha de adenocarcinoma do cólon Caco2 após a lavagem e durante a noite de incubação forma. Anteriormente mostrou que as células de ligação com sucesso decapéptidos após duas horas de incubação, lançou-se para 88% do seu inicialmente ligado

32P em meios após incubação durante a noite, mas ainda assim permanentemente incorporados elevados níveis de radioisótopo em suas proteínas. Os dezenove peptídeos diferentes na Figura 2 são designados MA (Modificado adjuvante) 10 a 28. Onze destes 19 contêm inserções de 17 resíduos completos, com MA18 transferir permanentemente

32 P às células Caco2 mais de 37 vezes mais eficiente do que MA26. A incorporação de radioisótopos permanente mais eficiente em células Caco2 ocorreu após incubação com MA27, que contém apenas um aminoácido inserido aleatoriamente a montante de um codão de paragem. Os péptidos foram MA16 e MA17 codificado pelo vector de expressão recombinante original, levando a baixos níveis de incorporação de radioisótopos

.

Diferentes péptidos

32P-marcadas foram incubadas durante duas horas com 10.000 células Caco2, lavou-se três vezes, e incubadas em meio completo durante 24 horas. A quantidade de

32P radioisótopo que permaneceu permanentemente incorporada em proteínas celulares é mostrada como uma percentagem de absorção da quantidade de péptido adicionado a cada poço de cultura de células (quer dizer, mais de um desvio padrão). O número de aminoácidos presentes em cada inserção é mostrada e variou de 0 a 17 aminoácidos. A sequência de aminoácidos de cada inserção é mostrada abaixo do nível de

32P incorporação atribuído a cada inserção.

visualização de

32P incorporação por autoradiografia gel

Quatro peptídeos mostrando níveis médios de incorporação de radioisótopos foram selecionados para um estudo mais aprofundado; ensaios em triplicado poços de estes péptidos são apresentados na Figura 3. inserção do Péptido MA11 continha três resíduos a montante de um codão de paragem, resultando num péptido de apenas 12 aminoácidos de comprimento. Apesar do seu comprimento relativamente curto, este péptido truncada transferida

32P para células Caco2 215 vezes mais eficientemente do que a do derivado de tumor do colo do útero linha de células HeLa em duas horas. Após lavagem e incubação durante a noite em meio de, radioactividade retida pelas células Caco2 foi mais do que 150 vezes maior do que o retido por células HeLa. Como mostrado na Figura 3, a maioria

32P ligada a células Caco2 estava presente numa baixo peso molecular (LMW) componente (

negrito seta

) às 2 horas, mas após 24 horas a maior parte desta radioactividade tinha foram incorporados em várias proteínas celulares diferentes.

IV do MA (adjuvante de modificação)

32P-peptídeos mostrados na Figura 2 foram incubadas com poços em triplicado de células Caco2 ou HeLa durante duas horas. Após a lavagem, adicionaram-se 100 ul de tampão de carga do gel e o conteúdo foram corridas em géis de SDS-poliacrilamida (designado como “2 horas”). poços idênticos havia meio completo adicionado imediatamente após o passo de lavagem e foram incubadas durante um período adicional de 24 horas, e os conteúdos dos poços foram então correr em géis (designados como “24 horas”). Filme foi desenvolvido após uma exposição durante a noite mostrando a incorporação aparente permanente de

32P em proteínas celulares às 24 horas (marcados com * no painel MA11). Péptido ligado MA11 215 vezes mais avidamente às células Caco2 do que para as células HeLa em duas horas, e a 150 vezes mais avidamente às 24 horas. Peptide MA20 obrigado bem para ambas as células Caco2 e HeLa em duas horas, mas apenas as células Caco2 parecia possuem a maquinaria celular necessária para incorporar

32P em proteínas celulares. A seta fina mostra a posição do péptido

32P-marcado, enquanto que a seta negrito mostra a posição de um peso molecular relativamente baixo marcado intermediário que não foi observado nas células HeLa.

similares resultados foram observados para os péptidos MA15 e MA22, ambos os quais continham inserções de 17 resíduos para um comprimento total de 34 aminoácidos, e ambas as quais incorporada 23 vezes mais

32P em células Caco2 do que em células HeLa após incubação durante a noite (Figura 3). Mais uma vez, ambas MA15 e MA22 mostrou uma banda de LMW altamente radioactivos (

negrito seta

) em 2 horas que tinha desaparecido quase completamente em 24 horas, com a incorporação do restante

32P em proteínas celulares. Originalmente, assumiu-se que esta banda LMW visto em 2 horas (

negrito seta

) representados intacta ligado peptídeo

32 P-rotulados. No entanto, os 34 peptídeos de aminoácidos MA15 e MA22 identificou estes precursores intactos 34-aa peptídicos como distinta da banda MW menor intensidade (

setas corajosas

). Assim, concluiu-se que a banda menor foi uma molécula intermediária pequena rapidamente processados, o que diminuiu consideravelmente ao longo dos garantindo 24 horas durante o qual o

32P estava sendo incorporados nas proteínas celulares.

Peptide MA20 também continha uma inserção de 17-resíduos. Este peptídeo foi especialmente notável, já que era o único testado que era capaz de se ligar a uma linha celular não derivado de adenocarcinomas do cólon e forneceu provas de chave sugerindo um possível mecanismo de processamento celular. Como mostrado na Figura 3, MA20 ligado em níveis elevados para ambos Caco2 e a células HeLa em duas horas. No entanto, a banda de LMW (

negrito seta

) visto com os outros três péptidos na Figura 3 foi apenas visível com células Caco2, mas não com células HeLa. Após lavagem e incubação durante a noite, as células Caco2 parecia ter processado a banda intermediária LMW (

negrito seta

) em proteínas celulares, enquanto as células HeLa, aparentemente, não tinha a capacidade para completar este passo seguinte (

ou seja

, há proteínas celulares radioactivos nestas MWs foram visualizadas, e todos radioactividade HeLa ligado ainda estava no mesmo peso molecular como o originalmente vinculado peptídeo

32 P-rotulados (

fina seta

)). As duas bandas (

setas finas

, primeira pista de MA20 e géis MA22) foram o resultado de incubação do péptido

32P-marcado em meio contendo soro durante duas horas a 37 ° C, e demonstrou aparente parcial proteólise do peptídeo durante esse tempo.

radioactividade Apenas células de adenocarcinoma de cólon processo de limite em proteínas celulares

Figura 4 mostra os resultados de peptídeos incubação MA11, MA20 e MA22 com sete linhas de células de carcinoma diferentes em 2 horas e, após incubação durante a noite. Peptídeos MA11 e MA22 exibiu forte transferência de ligação e de

32P apenas para as três linhas de adenocarcinoma de cólon (Caco2, HCT116 e HCT15) e não cervical (HeLa), fibrossarcoma (1080), células de adenocarcinoma do pâncreas ou pulmão. MA20, em contraste, ligado avidamente para todas as sete linhas de células, mas a sua radioactividade foi processado para a banda de LMW (

negrito seta

) e depois em proteínas celulares somente pelas linhas de adenocarcinoma de cólon (Caco2 três, HCT116, e HCT15). células HCT116 consistentemente ligado, bem como transformado em bandas maiores-MW, radioactividade de todos os três péptidos

32P-marcado (MA11, MA20 e MA22) a uma taxa muito mais baixa do que Caco2 e HCT15 células, mas a incorporação HCT116 celular proteínas, eventualmente, era visível em exposições mais longas (dados não mostrados).

Os péptidos

32P-rotulados MA11, MA20 e MA22 foram incubadas com sete linhas de células diferentes, tal como descrito na Figura 3. MA11 e MA22 obrigado a e tinha

32P radioisótopo permanentemente incorporado pelas três linhas celulares derivadas de adenocarcinoma do cólon. MA20 significativamente ligado a todas as sete linhas de células, incluindo uma derivada de um adenocarcinoma pancreático e uma derivada de um adenocarcinoma do pulmão, mas teve níveis significativos de

32P incorporado permanentemente em proteínas celulares apenas pelas três adenocarcinomas do cólon. O

seta fina

mostra a posição do peptídeo

32 P-rotulados, enquanto o

corajoso da seta

indica a posição de um peso molecular relativamente baixo rotulada intermediária que só foi visto em adenocarcinoma de cólon células.

não-fosforilada peptídeo compete com peptídeo

32 P-rotulados para se ligar a células Caco2

O peptídeo 12-aa MA11 foi sintetizado quimicamente, marcado com

32P e utilizado num ensaio de ligação competitiva com células Caco2 contra várias quantidades de péptido frio MA11, não-fosforilado. A Figura 5 ilustra que a fosforilação deste peptídeo não foi necessária para competir com sucesso para a ligação a células Caco2, e que quantidades crescentes de competidor frio inibiu rapidamente a quantidade de péptido

32P-marcado que se ligou às células.

em cada poço contendo células Caco2 foi adicionado 0,005 g peptídeo MA11

32 P-rotulados e na quantidade indicada de frio MA11, não fosforilada. Após uma hora de incubação, as células aderentes foram lavadas e as contagens radioactivas ligadas determinada.

Discussão

Dezanove diferentes pequenos péptidos até 34 aminoácidos de comprimento foram produzidos de forma recombinante, cada contendo uma inserção de até 17 resíduos de comprimento, que pode ser marcado em um substrato de ácido amino nove conservada usando

32 P e da proteína quinase A. Estes

32 P-rotulados peptídeos se ligam com afinidades exclusivas para linhas celulares estabelecidas de diferentes adenocarcinomas do cólon e transferir permanentemente radioisótopo para proteínas celulares após duas horas de incubação. Os resultados com mais eficiência de ligação peptídicas na absorção permanente de

32P por células do cancro do cólon mais de 150 vezes maior do que através de linhas celulares derivadas de outros cancros ou tecidos normais. Além disso, um peptídeo

32 P-marcada ligada a todas as linhas celulares testadas, mas

32P foi processado e permanentemente incorporados apenas por linhas celulares derivadas de adenocarcinomas do cólon, o que implica que apenas este tipo de célula cancerosa possui a maquinaria necessária para esta etapa de processamento. As dezanove péptidos diferentes mostrados na Figura 2 foram seleccionados a partir de um painel de rastreio inicial contendo apenas 25 péptidos. Este surpreendentemente elevada taxa de obtenção de péptidos de sucesso aumenta a probabilidade de que esta estratégia para o desenvolvimento de terapia individualizada será viável. Finalmente, um ensaio de ligação competitiva usando péptido sintético MA11 e

32P-marcado frio demonstrou que o peptídeo não fosforilado compete muito eficazmente para a ligação a células Caco2.

A maioria cancerosas actualmente aprovado regimes imunoterapêuticos utilizar um anticorpo dirigido contra uma molécula celular conhecido e pode também ser acoplada a um agente de ablação do tumor, tal como um radioisótopo ou uma toxina [14] – [18]. Apenas dois radioimmunotherapeutic (RIT) tratamentos são actualmente aprovado pela FDA; ambos são dirigidos contra o linfoma não-Hodgkin utilizando

131I (Bexxar) ou

90Y (Zevalin) através da atividade das células-matança de elétrons emitidos.

32P radioisótopo é um emissor beta puro, e como mostrado na Tabela 1, que tem muitas propriedades que se comparam favoravelmente com

131I e

90Y, além de ser prontamente disponível e relativamente barato. Uma vantagem da utilização de partículas beta para matar células tumorais é que a sua gama de caminho de até 5 mm resulta em um grande número de células a ser penetrado por cada electrão, levando a um “efeito espectador” cumulativa devido ao fogo cruzado a partir de células marcadas vizinha.

Uma área muito activa de investigação biomédica concentra-se no acoplamento de radioisótopos a péptidos, bem como a sua utilização em aplicações de diagnóstico e terapêuticas [19] – [22]. A nossa proposta de aplicação de pequenos peptídeos

32 P-rotulados em terapia de ligação de péptidos sugere uma série de vantagens sobre RIT tradicional baseado em anticorpos monoclonais. Por exemplo, espera-se que pequenas moléculas terapêuticas para proporcionar uma melhor penetração do tumor, e o peso médio do péptido pequeno molecular inferior a 4000 Da é inferior a 3% do tamanho de uma molécula de anticorpo [23]. halogénios radioactivos tais como

131I pode ser processado e libertado prematuramente por células, enquanto que a

32P emitido por estes pequenos peptídeos é permanentemente incorporada em proteínas de células de cancro [24]. Um pequeno péptido é menos provável para incitar o tipo de resposta anti-proteína do hospedeiro que pode desenvolver-se quando utilizando os anticorpos muito maiores, e a ausência de um fragmento Fc de imunoglobulina deveria resultar em menos ligação não específica pelo fígado. O radioisótopo

32P tem uma longa história de uso clínico que data do início dos anos 1930, enquanto que hoje ainda é utilizado para tratar a policitemia e trombocitemia essencial [25]. Existe uma clara necessidade para o desenvolvimento de novos tratamentos eficazes para o cancro colorrectal [26]. O nosso trabalho sugere que uma extremamente grande biblioteca de péptidos pequenos diferentes, cada um com e

capacidades únicas de transferência de 32P de ligação, podem ser facilmente produzidos quimicamente ou biologicamente, aumentando assim a possibilidade de desenvolver regimes de tratamento individualizado para pacientes diferentes. O câncer tem sido demonstrado ser uma doença altamente heterogêneo, assim, o desenvolvimento destes péptidos única terapias de ligação poderia facilitar enormemente tratamentos individualizados dos pacientes.

Materiais e Métodos

Produção do recombinante

32P péptidos marcado com

Tal como descrito na Figura 1, produtos de PCR consistindo em 17 codões aleatórios flanqueadas por locais BamHI foram clonados no local BamHI do vector pGEX-2TK (GE Healthcare) gerado. Após transformação em bactérias DH5a, os clones isolados foram cultivados durante a noite em caldo LB-amp, diluídos a 1/10 em mesma, crescidas durante duas horas, adicionou IPTG a 1 mM, e cultivados a 37 ° C durante cinco horas. Dez ml da cultura foram centrifugadas e ressuspensas em 1 ml de TBS contendo 1 × 100 ug /ml de lisozima. Depois de dois ciclos de congelamento e descongelamento, o lisado foi centrifugado e misturado com 100 ul de Sepharose-glutationa, durante uma hora, lavadas três vezes com 1 x TBS, e as proteínas de fusão recombinantes ligados marcados utilizando

32P-γ-ATP e cinase de proteína a de acordo com as instruções do fabricante (Sigma, St. Louis, Mo.). O sedimento foi lavado três vezes com 1 x PBS e o péptido marcado foi clivado e libertado para o sobrenadante utilizando trombina (GE Healthcare). Para cada péptido recombinante produzidos e ensaiados, foi determinada a sequência de ADN do inserto no plasmídeo de expressão.

Ensaio da ligação de péptidos

32P-rotulados para linhas celulares

As linhas celulares foram cultivadas em meio completo contendo 10% de soro de bovino fetal inactivado. Em cada poço de uma placa de 96 poços, 10.000 células de várias linhas de células foram cultivadas durante a noite. Dez ul de péptido a

32P-marcado em 1 × PBS e 90 ul de meio completo foram adicionadas a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante duas horas. O péptido-meio foi removido e uma ul adicionados a 100 ul de tampão de carga do gel para contagem por cintilação para a quantificação da sonda ou corrido num gel de poliacrilamida-SDS a 10% -20% (Biorad). As células aderentes foram brevemente e suavemente lavadas com meio completo e algumas vezes três poços foram ensaiados imediatamente por adição de 100 ul de tampão de carga do gel a cada poço e corrido num gel ou contados num contador de cintilação. Outros poços identicamente tratadas tinham 200 ul de meio completo adicionado e incubado a 37 ° C durante um período adicional de 24 horas. O meio foi removido e 100 ul de tampão de carregamento de gel adicionado e as amostras corridas num gel ou contadas como descrito acima.

Produção do péptido sintético

32P-marcado

O amino ácido 12 MA11 péptido foi sintetizado quimicamente e 0,2 ug foi marcado como descrito acima, utilizando 300 uCi de

32P-ATP e γ-30 unidades de proteína cinase A. Após uma reacção de marcação cinco horas, a mistura foi microcentrifugação através de uma unidade Microcon-10 para remover a enzima a partir de ensaios de ligação subsequentes. Para o ensaio de ligação competitiva, 0,005 ug de péptido

32P-marcado MA11 foi adicionada a um poço contendo 10.000 células Caco2 e uma quantidade designada de frio MA11, não-fosforilado. Após incubação durante uma hora, as células aderentes foram lavados suavemente e o conteúdo do poço contado.