Abstract
receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e vascular do receptor do factor de crescimento endotelial 2 (VEGFR2) surgiram como dois alvos clínicos eficazes para o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC-). No presente estudo, descobrimos que delfinidina, um anthocyanidin, presente em frutas e vegetais pigmentados, é um potente inibidor de ambos EGFR e VEGFR2 em células NSCLC que superexpressam EGFR /VEGFR2. Usando essas células, o próximo determinados os efeitos da delfinidina no crescimento celular e apoptose
in vitro Comprar e no crescimento do tumor e angiogênese
in vivo
. Delfinidina (5-60 uM) tratamento de células NSCLC inibiu a activação de PI3K, e fosforilação de AKT e MAPK. Além disso, o tratamento de células NSCLC com delfinidina resultou na inibição do crescimento celular sem ter efeitos tóxicos significativos em células epiteliais brônquicas humanas normais. Especificamente, o tratamento de NCI-H441 e células SK-MES-1 com delphindin (5-60 uM) resultou em (i) clivagem de proteína PARP, (ii) a activação de caspase-3 e -9, (iii) a regulação negativa de anti proteínas -apoptotic (Bcl2, Bcl-xL e Mcl-1), (iv) a regulação positiva de proteínas pró-apoptóticas (Bax e Bak), e (v) diminuição da expressão de PCNA e de ciclina D1. Além disso, em ratinhos nus atímicos implantadas subcutaneamente com células NSCLC humanas, tratamento delfinidina causou um (i) inibição significativa do crescimento do tumor, (ii) uma diminuição na expressão de marcadores de proliferação celular (Ki67 e PCNA) e a angiogénese (CD31 e VEGF) e (iii) indução de apoptose, quando comparado com ratinhos de controlo. Com base nestas observações, sugerimos que delfinidina, sozinho ou como um adjuvante para terapias atuais, poderia ser utilizada para a gestão do NSCLC, especialmente aqueles que sobre-expressar EGFR e VEGFR2
Citation:. Pal HC, Sharma S, Strickland LR, J Agarwal, Athar H, Elmets CA, et ai. (2013) delfinidina reduz a proliferação celular e induz a apoptose de Non-Small-Cell Lung Cancer Cells alvejando EGFR /VEGFR2 vias de sinalização. PLoS ONE 8 (10): e77270. doi: 10.1371 /journal.pone.0077270
editor: Xianglin Shi, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América
Recebido: 03 de agosto de 2013; Aceito: 09 de setembro de 2013; Publicação: 04 de outubro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Pal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NIH Grant AT004966 e do Programa Nacional de Doação para o Desenvolvimento Cancer Institute CA13148-39 UAB Comprehensive Cancer Center Júnior Faculdade. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pulmão é um problema de saúde importante nos Estados Unidos responsável por aproximadamente 28% de todas as mortes relacionadas com o cancro. Além disso, um total de 228,190 novos casos de câncer e 159,480 mortes por câncer de pulmão foram projetados para ocorrer nos Estados Unidos em 2013 [1]. As duas principais formas de cancro do pulmão são o cancro das células pequenas do pulmão (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), que compreendem cerca de 15 e 85% de todos os casos, respectivamente. O cancro do pulmão tem sido difícil de controlar com abordagens terapêuticas e cirúrgicas convencionais que levam ao mau prognóstico. Indicativa desse mau prognóstico, a taxa global de sobrevida em 5 anos é de apenas 15% para NSCLC [2,3]. Claramente, a investigação de opções de tratamento alternativos para NSCLC se justifica e esperamos levar ao alívio deste grande carga de mortalidade.
O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR /HER1 /ErbB1) é um tipo 1 transmembrana do receptor tirosina quinase (RTK) da família ErbB. É constituída por um domínio de ligação extracelular e um domínio intracelular contendo actividade de tirosina-quinase [4]. Está bem estabelecido que o EGFR é sobre-expresso em cerca de 95% de todos os tumores sólidos [5,6]. Além disso, é conhecido por ser um condutor oncogénica crítico que surge em mais de 60% dos casos de NSCLC [7] e cerca de 30% dos cancros da mama [8]. Além disso, o receptor do factor de crescimento vascular endotelial 2 (VEGFR2) tem sido relatada a ser sobre-expressa em vários tumores, incluindo cancro do pulmão [9]. Além disso, a sobre-expressão de ambos o EGFR e VEGFR2 está associada com quimiorresistência e está correlacionada com um prognóstico pobre [10,11]. activação aberrante de EGFR e de VEGFR2 desencadeia a fosforilação de um grande número de proteínas, incluindo as vias de PI3K /AKT e MAPK que estão envolvidos na sobrevivência celular, apoptose e angiogese [12,13]. Devido ao elevado potencial de diafonia e um papel bem estabelecido no crescimento tumoral e angiogénese, inibição de ambos o EGFR e sinalização VEGFR2 pode melhorar o resultado clínico em doentes com NSCLC avançado. Diferentes abordagens foram adotadas para bloquear simultaneamente EGFR e sinalização VEGFR2. As combinações de dois inibidores específicos e agentes únicos que têm como alvo estes receptores têm sido utilizados; no entanto a sua utilização em pacientes encontrou-se com toxicidades inaceitáveis.
Há uma necessidade urgente de desenvolver agente natural terapêutico multi-alvo que bloqueia atividades RTK e sinalização a jusante de ambas EGFR e VEGFR2 para melhorar a eficácia terapêutica e minimizar a toxicidade ao normal células hospedeiras. Um desses agentes é delfinidina, um anthocyanidin dietético conhecido por ser abundantemente presentes em muitas frutas pigmentadas (romãs, bagas e uvas escuras) e vegetais (beringelas, tomates, cenouras e cebolas vermelhas) [14]. Ela possui actividade anti-oxidante [15], anti-inflamatórios [16,17], anti-proliferativos [18] e anti-cancro actividades [19]. Além disso, delfinidina foi mostrado para inibir a via de sinalização de EGFR, bem como a invasão de células de cancro da mama [20]. No entanto, a maior parte do anti-câncer e anti-angiogénicos relatados na literatura são baseados em
in vitro
estudos. O objetivo do presente estudo foi determinar os efeitos da delfinidina no crescimento celular e apoptose
in vitro Comprar e no crescimento do tumor e angiogênese
in vivo
em células NSCLC. Os nossos resultados indicaram que delfinidina é um potente inibidor de ambos o EGFR e VEGFR2 em células NSCLC. Além disso, delphindin inibiu a activação de PI3K, e fosforilação de AKT e MAPK. Isto resultou na inibição do crescimento celular e a indução de apoptose em células NSCLC. Além disso, delphindin tratamento inibiu o crescimento de xenoenxertos de ratinhos nus NSCLC em que foi associada a uma diminuição na expressão de marcadores de proliferação celular e na angiogénese, assim como uma indução de apoptose.
Materiais e Métodos
Materiais
delfinidina ( 98% puro) foi adquirido a partir de Extrasynthase (Lyon, França). Os anticorpos monoclonais e policlonais para EGFR e fosfo-EGFR, VEGFR2 e fosfo-VEGFR2, ERK1 /2 (fosfo-p44 /42, Thr
202 /Tyr
204), JNK1 /2 (phospo-p54 /46 , Thr
183 /Tyr
185), p38 (fosfo-p38, Thr
180 /Tyr
204), PI3K, phopho AKT, Bcl2, Bcl-xL, Mcl-1, Bax, Bak, ciclina D1, PARP, caspase-3 e 9 foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Os anticorpos policlonais para o VEGF, PCNA e Ki67 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). O anticorpo anti-ratinho de CD31 foi obtido a partir de BD Biosciences (San Jose CA). Anti-ratinho ou anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano secundário foi obtida da Millipore Corporation (Billerica, MA).
tratamento de células
células NSCLC humano NCI-H441, SK-MES-1 e A549 foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). as células NCI-H441 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT), SK-MES-1 foram cultivadas em meio EMEM (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT), e as células A549 foram cultivadas em M de Ham forma -12K (Mediatech Inc., Manassas, VA) suplementado com soro a 10% inactivado pelo calor fetal bovino e 100 mg /ml de penicilina-estreptomicina. As células normais epiteliais brônquicas humanas (NHBE) foram obtidas da Clonetics Airways Epithelial Cell Systems (Cambrex Bio Ciência, Inc. Walkersville, MD) e cultivadas em meio de crescimento epitelial brônquica suplementado com factores de crescimento (Cambrex Bio Ciência, Inc. Walkersville, MD). As células foram mantidas em condições padrão de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO
2 num ambiente húmido. Delfinidina (dissolvido em DMSO) foi utilizado para o tratamento de células. A concentração final de DMSO utilizada foi de 0,1% (v /v) para cada tratamento. Para estudos dependentes de dose de NCI-H441 e SK-MES-1 foram tratados com delfinidina (5-60 uM), durante 3 a 48 horas em meio completo de células. As células de controlo foram tratados apenas com o veículo. Em experiências adicionais, privadas de soro NCI-H441 e SK-MES-1 foram tratados com delfinidina (5-60 uM), durante 3 horas e, em seguida, incubadas com ou sem EGF (50 ng /ml; 15 min) ou sem e com VEGF (20 ng /ml; 30 min).
Preparação de lisatos de células
Após o tratamento com célula de delfinidina, o meio foi aspirado e as células foram lavadas com PBS (10 mmol /L, pH 7,45). As células foram então incubadas em tampão de gelo de lise frio (HEPES 10 mM (pH 7,9), KCl 100 mM, EDTA 10 mM, EGTA 20 mM, DTT 100 mM, PMSF 20 mM, 0,5% de NP-40 com adicionado de fresco inibidores da protease leupeptina, aprotinina e benzamidina) durante 20 min. As células foram colhidas e o lisado foi recolhido num tubo de microcentrífuga e passada através de uma agulha de 21,5 L para quebrar os agregados celulares. O ligado foi clarificado por centrifugação a 14.000 durante 10 min a 4 ° C, e o sobrenadante (ligado celular total) recolhido, dividido em alíquotas e, em seguida, utilizado no dia da preparação ou imediatamente armazenados a -80 ° C para uso numa altura posterior .
análise western blot
para transferência western, 30-50 ug de proteína foi resolvido por 8-12% de geles de Tris-glicina e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Resumidamente, a membrana foi bloqueada e sondada com o anticorpo conjugado HRP primária e secundária apropriada, seguida por quimioluminescência e autorradiografia, conforme descrito anteriormente [20].
A viabilidade celular ensaio
O efeito de delfinidina na viabilidade celular foi determinada por 3- [2-ilo 4,5-dimetiltiazol-] brometo de tetrazólio ensaio -2,5-difenil (MTT). As células (NHBE, NCI-H441, A549 e SK-MES-1) foram plaqueadas numa placa de microtitulação de 96 poços e tratadas com 5-100 uM concentrações de delfinidina durante 48 horas. 1/10 do volume de solução 10xMTT (5 mg /ml em PBS) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 2 horas e a absorvância foi registada num leitor de microplacas a 540 nm depois de solubilizar o MTT reduzido com DMSO. O efeito da delfinidina na inibição do crescimento foi avaliada como a viabilidade celular por cento em células tratadas com DMSO foram tomados como 100% viável.
O tratamento de ratos pelados atímicos
atímicos fêmea quatro e cinco semanas de idade ( nu /nu) ratos nus foram adquiridos de NCI-Frederick Laboratório Nacional de Câncer Research e alojados em condições livres de patógenos com 12 horas de luz /12 horas de programação escuro na instalação Resource animal da Universidade de Alabama em Birmingham, em conformidade com o orientações animal Care institucional e Comitê Use. O protocolo de origem animal utilizado neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade do Alabama em Birmingham, e o número do protocolo animal é 120609365. Os animais foram alimentados com dieta livre fitoquímico AIN-76 SEMI PD (Test Diet, Richmond, IN)
ad libitum
. Os ratinhos foram injectados por via subcutânea com um número fixo de células NCI-H441 (4×10
6 em 50 ul de meio RPMI + 50 ul de matrigel) em cada flanco para iniciar o crescimento do tumor. Os animais foram então divididos aleatoriamente em três grupos com 6 animais em cada grupo. O primeiro grupo de animais recebeu uma injecção i.p. injecção de DMSO (100 uL) e serviu como um controlo. Os animais do grupo 2 e 3 receberam uma injecção i.p. injecção de delfinidina (1 mg /animal e 2 mg /animal, respectivamente) em 100 ul de DMSO três vezes /semana. Os tamanhos dos tumores foram medidos duas vezes por semana, e o volume do tumor foi calculado pela fórmula ½ (
L
1 ×
L
2 ×
H
) , onde
G
1 é o diâmetro longo,
G
2 é o diâmetro curto, e H representa a altura do tumor. Todos os animais foram sacrificados por CO
2 inalação e a morte foi confirmada por deslocamento cervical quando os tumores atingiram um volume de cerca de 1,200 milímetro
3 no grupo de controlo. Experiências semelhantes foram então realizadas com SK-MES-1 células. Todos os procedimentos realizados foram de acordo com as diretrizes para o uso e cuidado de animais de laboratório e aprovado pelo IACUC.
A imuno-histoquímica e imunofluorescência coloração
Cinco secções micrométricas foram cortadas, desparafinados em xilenos, reidratados em etanol, e lavadas em solução salina tamponada com fosfato. Para a recuperação de antigénio, os cortes foram aquecidos a 95 ° C durante 30 minutos em tampão de citrato (pH 6,0). Resumidamente, as secções foram então incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com um anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano-específico durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, as secções foram incubadas com solução de substrato de peroxidase diaminobenzidene durante 2 min e contrastadas com hematoxilina de Mayer solução. Para a coloração de imunof luorescência após a recuperação de antigénios, as secções foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com um anticorpo secundário marcado AlexaFluor-488 durante 1 hora à temperatura ambiente. As lâminas foram montadas com meio de montagem Vectashield contendo DAPI e foram analisadas sob o microscópio de fluorescência.
A análise estatística
Os resultados são expressos como a média ± SEM. A análise estatística de todos os dados foi realizada por meio do teste t de Student. O
p
valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
tratamento delfinidina inibe a fosforilação constitutiva e induzida por EGF do EGFR nas células NCI-H441
.
activação aberrante e a sobre-expressão de EGFR conduz à desregulação de vias de sinalização importantes para a proliferação de células, a sobrevivência, a progressão do cancro, angiogénese e as metástases [21]. que sobre-expressam as células NCI-H441 foram tratados com EGFR delfinidina (5-60 uM; 3 horas) para determinar o seu efeito na expressão do EGFR. Como mostrado na Figura 1A, o tratamento de delfinidina reduzida significativamente a expressão e a fosforilação do EGFR em células NCI-H441. Além disso, a sobre-expressão do seu ligando EGF, que activa EGFR, desempenha um importante papel na tumorigénese do NSCLC [22]. Por isso, determinado o efeito de delfinidina sobre a fosforilação induzida por EGF do EGFR e descobriram que o seu tratamento inibiu significativamente a activação induzida por EGF e a fosforilação do EGFR (Figura 1A). Um efeito semelhante de delfinidina na fosforilação do EGFR foi também observada em SK-MES-1, células (dados não apresentados). Isto demonstra que o tratamento reduz a delfinidina fosforilação constitutiva e induzida pelo EGF do EGFR.
[A] células NCI-H441 foram tratados com delfinidina (5-60 uM), durante 3 horas em meio completo de células (painel da esquerda) . No painel da direita, as células NCI-H441 carência de soro foram tratadas com delfinidina (5-60 uM), durante 3 horas e, em seguida, incubadas com ou sem EGF (50 ng /ml) durante 15 min. Após tratamento as células foram recolhidas e os lisados celulares foram preparados e determinou-se a expressão do EGFR e EGFR fosforilado-. [B] células NCI-H441 foram tratados com delfinidina (5-60 uM), durante 3 horas em meio completo de células (painel da esquerda). No painel da direita, as células NCI-H441 carência de soro foram tratadas com delfinidina (5-60 uM), durante 3 horas e, em seguida, incubadas sem ou com VEGF (20 ng /ml) durante 30 min. Após tratamento as células foram recolhidas e os lisados celulares foram preparados e foi determinada a expressão de VEGFR2 e VEGFR2 fosforilada. O carregamento igual de proteína foi confirmada por decapagem o imunoblot e reprobing-lo para β-actina. Os imunoblots aqui mostrados são de uma experiência representativa repetida três vezes com resultados semelhantes.
delfinidina tratamento inibe a fosforilação constitutiva e induzida por VEGF de VEGFR2 em células NCI-H441
Semelhante a EGFR, a sobre-expressão e activação aberrante de VEGFR2 também tem sido relatada em várias células cancerígenas, incluindo NSCLC [23]. Tal como EGFR, VEGFR2 sofre dimerização e fosforilação de VEGFR dependente do ligando de activação e resultando em desregulação de sinalização a jusante. Isso, então, aciona mitogênica, quimiotática, e os sinais pró-sobrevivência, juntamente com a estimulação da formação de vasos do tumor [24]. Por isso, nós também avaliado o efeito de delfinidina (5-60 uM; 3 h) na expressão de VEGFR2 em células NCH-H441 e descobriram que o seu tratamento reduziu significativamente a expressão de VEGFR2 em células NCI-H441 (Figura 1B). Além disso, o tratamento de delfinidina inibiu a activação induzida por VEGF e a fosforilação de VEGFR2 (Figura 1B). Um efeito semelhante de delfinidina na fosforilação da VEGFR2 foi também observada em SK-MES-1, células (dados não apresentados). Estes resultados demonstram claramente que o tratamento de delfinidina inibe a fosforilação constitutiva e induzida por VEGF de VEGFR2.
delfinidina tratamento inibe a expressão da proteína de PI3K e fosforilação de AKT e MAPK em NCI-H441 e SK-MES-1 células
a resistência a inibidores de EGFR está associada com a activação da via PI3K /AKT e vias de sinalização MAPKs [25]. EGFR /PI3K /AKT /MAPK sinalização desempenha um papel fundamental na tumorigénese, proliferação celular aumentada, angiogénese, e a inibição da apoptose em várias malignidades humanas, incluindo NSCLC [21,26]. Uma vez que a sinalização de PI3K /AKT é activada por EGFR, que fosforila várias alvos a jusante implicados em processos celulares importantes, incluindo a proliferação celular e a apoptose. Tratamento de delfinidina (5-60 uM; 48 horas) resultou numa diminuição da expressão de p85 (uma subunidade reguladora) e p110α (uma subunidade catalítica) de PI3K em NCI-H441 e SK-MES-1 células (Figura 2A). PI3K regula a fosforilação e activação da AKT, que promove a sobrevivência de células, bloqueando as funções de proteínas pró-apoptóticas e promover a indução de proteínas de sobrevivência celular [27]. Como consequência da inibição de PI3K por delfinidina, AKT fosforilação foi significativamente reduzida em ambos os NCI-H441 e SK-MES-1 células (Figura 2A).
[A] NCI-H441 e SK-MES-1 células foram tratados com 5-60 uM delphindin durante 48 horas para determinar o seu efeito sobre a expressão da proteína de PI3K, fosforilação de AKT e MAPK. Após tratamento as células foram colhidas, foram preparados lisados celulares e de proteína foram sujeitos a SDS-PAGE seguido por análise de imunotransferência e de detecção de quimioluminescência. O carregamento igual de proteína foi confirmada por decapagem o imunoblot e reprobing-lo para β-actina. Os imunoblots aqui mostrados são de uma experiência representativa repetida três vezes com resultados semelhantes. [B] a viabilidade celular de A549, NCI-H441, as células NHBE SK-MES-1 e tratadas com 5-100 uM de delfinidina durante 48 horas, foi determinada pelo ensaio de MTT, tal como descrito em “Materiais e Métodos”. Os dados apresentados são a média ± SEM de três experiências separadas, em que cada tratamento foi repetido em 10 poços. [C] NCI-H441 e SK-MES-1 foram tratados com 5-60 uM delphindin durante 48 horas para determinar o seu efeito na expressão da proteína do PCNA e cyclinD1. Após tratamento as células foram colhidas, foram preparados lisados celulares e de proteína foram sujeitos a SDS-PAGE seguido por análise de imunotransferência e de detecção de quimioluminescência. O carregamento igual de proteína foi confirmada por decapagem o imunoblot e reprobing-lo para β-actina. Os imunoblots aqui mostrados são de uma experiência representativa repetida três vezes com resultados semelhantes.
A via de MAPK é outra cascata de sinalização que é activada por EGFR e desempenha um papel importante na regulação de muitas respostas celulares, incluindo proliferação celular e apoptose [28]. A família MAPKs é composta por três subgrupos principais: a ERK (cinase regulada extracelular da proteína-sinal), de JNK (quinase c-Jun N-terminal) e MAPK p38 [29]. ERKs são principalmente envolvidos na regulação de factores de proliferação /diferenciação activadas por mitogénio, ao passo que a JNK e p38 MAPK executar as funções relacionadas com a morte celular apoptótica [30]. Portanto, nós também avaliou o efeito da delfinidina em MAPKs de sinalização em células NSCLC. Descobrimos que delfinidina tratamento reduziu significativamente a fosforilação de ERK1 /2, JNK1 /2 e p38 em ambos NCI-H441 e SK-MES-1, células (Figura 2A).
delfinidina tratamento inibe o crescimento de células NSCLC
uma vez que a sobre-expressão e activação aberrante de EGFR e as suas vias de sinalização a jusante, é inibida por delfinidina, nós próxima examinado o seu efeito sobre a proliferação celular de células NSCLC, empregando um ensaio MTT. NSCLC A549, NCI-H441 e SK-MES-1 células com superexpressão de EGFR e VEGFR2 foram tratados com delfinidina (5-100? M; 48 horas). Os resultados do ensaio de MTT mostraram que delfinidina foi eficaz em inibir significativamente o crescimento celular de A549 (4-70%; P 0,05-0,01), NCI-H441 (6-59%; P 0,05-0,01) e SK-sagem 1 9-73 células (%; P 0,05-0,01) (Figura 2B). O IC
50 valores de delfinidina foram estimados em 55, 58 e 44 uM para A549, NCI-H441 e SK-MES-1 de células, respectivamente. Examinámos também os efeitos da delfinidina sobre o crescimento de células epiteliais brônquicas humanas normais (NHBE células) sob condições semelhantes e descobriram que estas doses têm efeito marginal sobre o crescimento destas células (Figura 2B).
delfinidina inibe tratamento a expressão da proteína de ciclina D1 e PCNA em NCI-H441 e SK-MES-1 células
as vias de sinalização envolvidos na activação de MAPK também activam várias proteínas nucleares, os quais desempenham um papel crucial na progressão do ciclo celular de G1 para a fase S. Especificamente, a ciclina D1 foi identificado como um efector a jusante chave de sinalização de EGFR em células NSCLC resistentes. Além disso, as células NSCLC EGFR mutante ter uma maior expressão da ciclina D1 [31]. O tratamento de células com delfinidina (5-60 uM; 48 h) NCI-H441 e SK-MES-1 NSCLC resultou numa redução significativa da expressão da proteína ciclina D1 de um modo dependente da dose (Figura 2C). PCNA é um conhecido marcador de proliferação celular activo durante as fases S e G2 do ciclo celular e desempenha um papel importante na iniciação da proliferação de células [32]. O aumento da expressão de PCNA em pacientes com cancro tem sido associada com uma taxa de sobrevivência pobre. Além disso, o EGFR também funciona como um factor de transcrição e aumenta a proliferação celular através da activação e estabilização PCNA [33]. Estudámos, portanto, o efeito de delphindin sobre a expressão PCNA e descobriu que ele reduziu significativamente a expressão da proteína PCNA em ambos os NCI-H441 e SK-MES-1 células (Figura 2C).
delfinidina tratamento modula a expressão de proteínas da família Bcl-2 , e induz a clivagem de caspases e PARP em NCI-H441 e SK-MES-1 células
Activação de /AKT e MAPK sinalização de PI3K por EGFR resulta na proliferação celular aumentada e angiogénese, bem como a inibição da apoptose. O tratamento de células que sobre-expressam o EGFR com NSCLC delfinidina resultou numa inibição significativa da via PI3K /AKT e MAPK vias de sinalização. A seguir, examinou os efeitos de delfinidina em proteínas da família Bcl-2 a jusante de PI3K /AKT. Tratamento de NCI-H441 e SK-MES-1 com as células delfinidina reduziu grandemente a expressão das proteínas anti-apoptóticas, tais como Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1 (Figura 3A). Além disso, descobrimos que a expressão de proteínas pró-apoptóticas Bak e Bax foi significativamente aumentado em delfinidina tratada NCI-H441 e células SK-MES-1 (Figura 3A). A apoptose é um processo altamente regulado que envolve uma cascata de eventos, incluindo a activação proteolítica de caspases. Dentro do processo apoptótico caspases possa actuar quer como iniciadores ou executores. caspases executoras são activados a partir de sua forma pró-enzimática pela acção de outras caspases dentro de uma reacção em cascata. Uma vez activadas, as caspases clivam uma variedade de proteínas intracelulares, tais como a PARP e cinases de proteínas diferentes [34]. Portanto, o próximo examinado se o tratamento delfinidina (5-60 uM; 48 horas) causou a activação de caspases ou a clivagem de PARP, ambas as quais são marcas de apoptose. Nós descobrimos que o tratamento de delfinidina resultou na activação de caspase-9, caspase-3 e a consequente clivagem de PARP em ambos NCI-H441 e SK-MES-1cells (Figura 3B)
[A B] NCI-H441 e SK-MES-1 foram tratados com 5-60 uM delphindin durante 48 horas para determinar o seu efeito sobre a expressão de proteínas da família BCL2, a clivagem de caspases e PARP. Após tratamento as células foram colhidas, foram preparados lisados celulares e de proteína foram sujeitos a SDS-PAGE seguido por análise de imunotransferência e de detecção de quimioluminescência. O carregamento igual de proteína foi confirmada por decapagem o imunoblot e reprobing-lo para β-actina. Os imunotransfer�cias mostradas aqui são de uma experiência representativa repetido três vezes com resultados semelhantes.
delfinidina tratamento inibe a tumorigenicidade de células NSCLC humanas implantadas em ratinhos nus atímicos
Uma vez que o crescimento celular delfinidina efetivamente reduzido e induziu apoptose de células NSCLC
in vitro
, nós próxima determinou os efeitos da delfinidina em um
in vivo
rato modelo xenoenxerto implantado com NCI-H441 ou SK-MES-1cells. Em ratinhos nus atímicos implantados com o EGFR e VEGFR2 superexpressando células NSCLC, delfinidina tratamento resultou numa inibição significativa do crescimento do tumor. delfinidina ratinhos tratados implantados com células NCI-H441 apresentaram inibição significativa do crescimento do tumor (p 0,05-0,001) por 27,92 e 45,37% a uma dose de 1 e 2 mg /animal, respectivamente, em comparação com o grupo de controlo não tratado (Figura 4A). O volume médio do tumor do grupo de controlo foi 1268.62 mm
3, enquanto que nos grupos delphindin tratados os volumes médios de tumor foram 914.38 mm
3 e 693.01 mm
3 em ratos que receberam 1 e 2 mg /animal delfinidina, respectivamente (Figura 4A). Além disso, o tratamento de delfinidina também resultou na inibição significativa do crescimento do tumor em ratinhos nus atímicos implantados com SK-MES-1 células. Tratamento de delfinidina (1 e 2 mg /animal), resultou na inibição do crescimento do tumor 26,34 e 46,01%, em comparação com ratinhos de controlo. Esses achados foram estatisticamente significantes (p ,05-,001). volume médio de tumor nos grupos tratados delfinidina foi significativamente reduzida (913,42 milímetros
3 e 671.18 mm
3), quando comparado com o grupo controle não tratado (1241.18 mm
3) (Figura 4B).
[a] Dezoito atímicos (
nu /nu
) ratos nus fêmeas foram injectados por via subcutânea com 4×10
6 células NCI-H441 (em 50 mL RPMI + 50 pi Matrigel) em cada flanco do mouse para iniciar o crescimento do tumor e, em seguida, aleatoriamente divididas em três grupos (seis ratinhos em cada). Vinte e quatro horas após a implantação de células, os ratinhos do primeiro grupo receberam i.p. injecção de DMSO (100 uL) e serviu como controlo. Os ratinhos do Grupo 2 e 3 receberam i.p. injecção de delfinidina 1 mg /animal e 2 mg /animal, respectivamente, em 100 ul de DMSO três vezes /semana. [B] Foram realizadas experiências semelhantes com SK-MES-1 células. Uma vez que os tumores começaram a crescer, seus tamanhos foram medidos e o volume do tumor foi calculado pela fórmula ½ (
L
1 ×
L
2 ×
H
), em que
G
1 é o diâmetro longo,
G
2 é o diâmetro curto, e
H
é a altura do tumor . Todos os animais foram sacrificados quando os tumores atingiram um volume de 1200 mm
3 no grupo de controlo. Os volumes médios de tumor de controle e grupos tratados delphindin foram plotados ao longo de dias após a inoculação de células tumorais. Os valores representam a média ± SEM. * P 0,05, ** p 0,01, *** p e. 0,001 versus grupo de controlo
delfinidina tratamento inibe marcadores de proliferação e induz a apoptose em tumores de ratinhos nus atimicos com células NSCLC implantados
em seguida, examinámos a expressão de moléculas associadas com a proliferação celular e a apoptose em xenoenxertos de tumor, empregando imunohistoquímica. Como mostrado na Figura 5, os resultados de análise histoquímica de secções de tumor demonstraram que houve uma diminuição significativa no número e na intensidade de marcadores de proliferação celular tais como PCNA e Ki67 em tumores delfinidina tratados quando comparados com os respectivos grupos de controlo não tratados. Além disso, quando estes tumores foram avaliados para a coloração de caspase-3 activa, uma característica da apoptose, verificou-se que houve um aumento significativo no número e na intensidade de caspase-3 coloração activo em tumores de ratinhos delfinidina tratados (Figura 5A e 5B).
ratinhos nus atímicos foram implantados com [A] NCI-H441, e [B] SK-MES-1 células. Os ratinhos foram tratados com delfinidina, tecidos de tumor foram recolhidos em 10% de formalina e foram preparados blocos em parafina e imunomarcação de Ki67, PCNA e clivada da caspase-3 foram realizadas tal como descrito em “Materiais e Métodos”. As fotomicrografias mostram imagens representativas de três amostras de tumor independentes. Bar = 20 mm.
delfinidina tratamento inibe marcadores de angiogênese em tumores de ratos pelados atímicos implantados com células NSCLC
Os tumores sólidos recrutar novos vasos sanguíneos para o crescimento, manutenção e metástase. Portanto, a utilização de agentes que suprimem o desenvolvimento do tumor induzido por de novos vasos sanguíneos são considerados uma importante estratégia para o tratamento do cancro. Portanto muitas terapias clínicas atuais alvo de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e CD31. secções de tumor coradas com anticorpo anti-VEGF e anticorpos anti-CD31 mostraram redução da intensidade da coloração nos grupos tratados delfinidina. Este estudo demonstrou claramente que delfinidina tratamento reduziu significativamente a expressão de VEGF e de CD31 em comparação com secções de tumores de ratinhos de controlo (Figura 6A e 6B).
ratinhos nus atímicos foram implantados com [A] NCI-H441, e [ ,,,0],B] SK-MES-1 células. Os ratinhos foram tratados com delfinidina, tecidos de tumor foram recolhidos em 10% de formalina e foram preparados blocos em parafina e imunofluorescência de CD31 e imuno-histoquímica de VEGF foram realizadas como descrito em “Materiais e Métodos”. As fotomicrografias mostram imagens representativas de três amostras de tumor independentes. Bar = 20 mm
Discussão
Tem havido grandes avanços em desvendar os mistérios da genética e da biologia do câncer.; no entanto, a tarefa mais importante é traduzir essas descobertas em novas terapias que irão melhorar os resultados dos pacientes. terapias-alvo são o futuro do tratamento e desenvolvimento de novos inibidores terapêuticos de moléculas de transdução de sinal de câncer, em particular RTK, é o foco de uma extensa pesquisa. Superexpressão e activação aberrante de RTK tais como EGFR e VEGFR2 estão associados com taxas mais elevadas de proliferação, apoptose reduzida, aumento da angiogênese e metástase [35]. Eles, assim, apresentar um alvo atraente para o desenvolvimento de medicamentos contra NSCLC [36,37].