Abstract

O proteassoma é um regulador chave da homeostase proteína celular e é um alvo anticâncer clinicamente validado. O imunoproteassoma, um subtipo de proteassoma principalmente expressos em células hematopoiéticas, foi inicialmente reconhecida pelo seu papel na apresentação de antigénio, durante a resposta imunitária. Recentemente, o imunoproteassoma tem sido implicada em várias condições de doença, incluindo o cancro e desordens auto-imunes, mas muitos dos factores que contribuem para estes processos patológicos permanecem desconhecidos. Em particular, o codão 60 do polimorfismo

gene PSMB9

que codifica a subunidade catalítica β1i imunoproteassoma tem sido investigado no contexto de uma variedade de doenças. Apesar disso, estudos anteriores têm até agora reportado resultados inconsistentes em relação ao impacto desse polimorfismo sobre a atividade do proteassoma. Assim, partimos para investigar o impacto do

PSMB9

códon 60 polimorfismo na expressão e atividade da subunidade immunoproteasome β1i em um painel de linhas celulares de cancro humano. O substrato fluorogénico β1i-selectiva Acetil-Pro-Ala-Leu-7-amino-4-metilcumarina foi usada para medir especificamente a actividade catalítica β1i. Os nossos resultados indicam que o codão 60 Arg /His polimorfismo não altera significativamente a expressão e actividade de β1i entre as linhas de células testadas. Além disso, nós também analisou a expressão de β1i em amostras clínicas de cólon e pacientes com câncer pancreático. Nossas análises de imuno-histoquímica mostrou que ~ 70% das amostras de câncer de cólon clínicas e ~53% das amostras de câncer de pâncreas tem expressão β1i detectável. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que a subunidade β1i do imunoproteassoma é frequentemente expresso em cancros do cólon e pancreáticos, mas que o codão 60 de variantes genéticas β1i exibir actividades catalíticas semelhantes e não são susceptíveis de contribuir para a inter-cell-line e inter significativa variabilidades individuais na atividade imunoproteassoma

citação:. Parque JE, ao L, Miller Z, Kim K, Wu Y, Jang ER, et al. (2013)

PSMB9

Codon 60 Polimorfismos não têm impacto sobre a atividade do immunoproteasome Catalytic Subunidade B1i Expresso em vários tipos de câncer sólido. PLoS ONE 8 (9): e73732. doi: 10.1371 /journal.pone.0073732

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de maio de 2013; Aceito: 20 de julho de 2013; Publicação: 09 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Park et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por subvenções do National Cancer Institute, R15CA156601 e R01CA128903 e Kentucky Programa de Pesquisa em Câncer de pulmão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o proteassoma é responsável pela degradação de proteínas específicas e é um jogador-chave na manutenção da homeostase proteína celular e a regulação de processos celulares que são essenciais no desenvolvimento e progressão [1] câncer, [2]. O imunoproteassoma, uma forma alternativa do proteassoma, é encontrada em células de origem hematopoiética, mas a sua expressão, também pode ser induzida sob condições de stress e inflamatórias em outros tipos de células [3]. O imunoproteassoma é formado quando os três tipos de subunidade catalítica encontrado no proteassoma constitutivo, β1 (Y,

PSMB6

), β2 (Z,

PSMB7

) e β5 (X,

PSMB5

), são substituídos por três imuno-subunidades homólogas: β1i (LMP2,

PSMB9

), β2i (MECL-1,

PSMB10

) e β5i (LMP7,

PSMB8

). Em comparação com o proteassoma constitutiva, o imunoproteassoma é encontrado para ter especificidades proteolíticas ligeiramente alteradas que são capazes de péptidos que produzem mais apropriada para a ligação ao complexo principal de histocompatibilidade I de moléculas, facilitando assim a apresentação de antigénio [4]. No entanto, estudos recentes indicam que o imunoproteassoma podem ter funções importantes para além da resposta imunitária adaptativa. Por exemplo, o imunoproteassoma é encontrado para ser expresso em não-inflamado, tecidos imunes-priveligiada (por exemplo, retina e do cérebro [5], [6]) e no contexto de vários estados de doença (por exemplo, cancro, doenças neurodegenerativas, doenças auto-imunes, [3], [7] e suas referências). Apesar destas observações, o significado biológico da imunoproteassoma em tais estados de doença não é completamente compreendido.

A subunidade β1i do imunoproteassoma é codificada pelo

PSMB9

gene localizado no cromossoma 6. Este gene abriga uma ocorrência comum /H polimorfismo genético R no codão 60 (p.60R H; c.179G a; rs17587) com frequências H alelos de 1,1% a 34%, variando entre grupos étnicos ([8] e referências aí contidas) . Várias investigações têm relatado possíveis associações entre codão 60

PSMB9

estado polimorfismo e aumento da susceptibilidade a várias doenças, tais como diabetes mellitus dependente de insulina, artrite reumatóide e esclerose múltipla [8] – [16]. No entanto, é difícil para decifrar a partir de estudos anteriores, se as associações observadas estão directamente relacionadas com a actividade alterada da subunidade β1i como resultado do R /H variação de aminoácidos. Isto é em parte devido à natureza inter-subunidades de proteassoma dependente de e a falta de sondas moleculares adequados. Um inquérito anterior por Mishto et al. [17] examinou mais de perto o impacto desse polimorfismo sobre a atividade do proteassoma no cérebro envelhecido utilizando o substrato peptídeo fluorogénico N-succinil-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Suc-LLVY-AMC). Os resultados deste estudo sugeriram que os resultados H alelos em uma actividade de proteassoma diminuiu no cérebro idade [17]. No entanto, uma vez que Suc-LLVY-AMC é convencionalmente usado para medir o tipo quimotripsina geral (CT-L), a actividade proteolítica do proteassoma e, portanto, pode ser hidrolisada por múltiplas subunidades de tanto o imunoproteassoma e o proteassoma constitutivo, esta diminuição na hidrólise de Suc-LLVY-AMC pode não indicar alterações na função β1i. Além disso, um estudo posterior pelo mesmo grupo usando peptídeos recombinantes que imitam substratos endógenos não indicaram diferenças nos perfis de hidrólise do substrato entre os códon 60 genótipos [18].

A maior parte da discrepância em relação ao impacto funcional das códon PSMB9 60 polimorfismo surge a partir da falta de uma ferramenta para observar especificamente a função da subunidade β1i. A este respeito, Lin et ai. [19] e Blackburn et ai. [20] relataram recentemente sobre o desenvolvimento e a aplicação do substrato fluorogénico Acetil-Pro-Ala-Leu-7-amino-4-metilcumarina (Ac-Pal-AMC) a qual é hidrolisada selectivamente por β1i. Esta nova ferramenta tornou possível avaliar o impacto funcional direta de

PSMB9

códon 60 polimorfismo na subunidade β1i. No nosso estudo, foi investigada a expressão de β1i em cancros do cólon e pancreáticos tecidos clínicas de cancro, bem como em linhas de células de cancro humanas estabelecidas. Usando o β1i-selectiva substrato fluorogénico Ac-Pal-AMC, que também avaliada a actividade catalítica de β1i em várias linhas celulares de cancro que transportam diferentes genótipos no codão 60. Os nossos resultados indicaram que β1i é frequentemente expresso em cancros do cólon e pancreáticos, mas o codão 60

PSMB9

polimorfismo não tem impacto significativo sobre a atividade catalítica de β1i expressa em vários tipos de linhas celulares de cancro.

Materiais e Métodos

Cultura de células e reagentes

As linhas celulares derivadas de vários tipos de cancros humanos (cólon, HCT-8, DLD-1, HCT-116, SW480, pulmão, H23, H358, H460, H727, H1299, próstata, PC-3, DU145; pâncreas, BxPC-3, PANC-1, AsPC1; mama, MCF-7, Hs578T, MDA-MB-231) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC) e mantidas sob as condições recomendadas. Os substratos fluorogênicos Suc-LLVY-AMC e Ac-PAL-AMC foram costume-sintetizado seguindo a estratégia de síntese de peptídeos padrão. Os inibidores do proteassoma UK-101 e epoxomicina foram sintetizados e purificados como descrito anteriormente [21], [22]. Purificada 20 S proteassoma constitutivo e immunoproteasome foram adquiridos de Boston Biochem.

Análise imuno-histoquímica

Tissue microarrays contendo de-identificados, casos de arquivo de cólon humano e amostras de tecido de câncer pancreático foram obtidos a partir de US Biomax. O uso de amostras identificou-de matriz de tecido a partir de uma fonte comercial para o estudo atual foi considerado isento do Assunto regulamento Humana pela Institutional Review Board. Um ensaio de estreptavidina-biotina-imunoperoxidase foi realizada após o procedimento de recuperação de antigénios (tampão citrato, pH 6) utilizando um anticorpo monoclonal contra β1i (1:100 diluição, Enzo Life Sciences) de acordo com o protocolo previamente relatada [23]. reacção imune foi visualizada utilizando 3,3′-diaminobenzidina (DAB), e os núcleos foram contrastadas com hematoxilina. A especificidade de sinais imunorreactivos foi verificada por omissão quer do primário ou o anticorpo secundário. As seções tissue microarray imunomarcadas foram analisadas por um patologista experiente (Dr. Eun Y. Lee). A intensidade da imunomarcação foi atribuído em uma escala de 0 a 2 ou 3.

Determinação da

PSMB9

Estado polimórfica no códon 60

O

PSMB9

genótipos no codão 60 foram inicialmente determinadas utilizando métodos convencionais de PCR e digestões enzimáticas de DNA como descrito anteriormente [24]. O amplicon cobrindo toda a estrutura de leitura aberta foi posteriormente clonados e analisados ​​por sequenciação directa para verificar se as linhas de células não contêm variações genéticas adicionais no gene PSMB9.

Análise Immunoblotting

Um montante equivalente de tecidos ou extractos celulares foram resolvidas em géis de poliacrilamida e transferidos para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% e sondado com anti-β1i (1:1000, Abcam) e anticorpos anti-β-actina (Novus, 1:1000). Depois da lavagem, os blots foram incubados com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. Os anticorpos ligados foram detectados utilizando um substrato de quimioluminescência aumentada (Pierce Biotechnology). A fim de comparar os níveis de expressão relativos de β1i entre várias linhas de células, extractos de células H23 diluídas em série foram usadas como padrões de calibração e as intensidades da banda foram quantificados densitometricamente usando o software Uma Quantidade (Bio-Rad).

proteassoma Ensaios de actividade

a actividade catalítica de β1i foi determinada por monitorização da velocidade de hidrólise de fluorescente de 7-amino-4-methylcoumarine (AMC) a partir de Ac-Pal-AMC [20]. Resumidamente, preparações proteossomo purificado ou extractos celulares contendo a quantidade de proteína total equivalente (10 ug) foram adicionados a placas de 96 poços e ajustado a um volume final de 50 ul usando tampão de ensaio (Tris 20 mM /Cl, 0,5 mM de EDTA, pH 8,0). A reacção foi iniciada pela adição de Ac-Pal-AMC (100 uM) e a fluorescência de AMC libertado foi monitorizado durante 90 min utilizando um leitor de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices, excitação a 360 nm e emissão 460 nm). A fim de verificar que a hidrólise do substrato é mediada por β1i, conjuntos adicionais de extractos celulares ou preparações purificadas proteossomo foram pré-tratados com inibidores de proteassoma UK101 ou epoxomicina durante 1 h, após o que os sinais fluorescentes foram monitorizados. Em experiências separadas, a hidrólise de Suc-LLVY-AMC (100 uM) foi monitorizada para avaliar a actividade global CT-L proteolítica.

Análise estatística

Valores de dados foram expressos como médias com desvio padrão. A comparação entre os grupos foi realizada através do Estudante

t

-teste e p 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Expression frequente de β1i em Colon e do cancro do pâncreas tecidos.

ao avaliar a expressão de β1i no câncer de cólon, primeiro utilizados quatro pares de câncer de cólon e tecidos do cólon adjacentes não-malignas de doadores correspondentes. Nossas análises de imunotransferência indicaram que os níveis β1i foram altamente elevados em todos os quatro tecidos de cancro do cólon clínicos em comparação com os tecidos não malignos do cólon emparelhados (Figura 1A). Para melhor avaliar a frequência de expressão β1i no câncer de cólon, foi realizada análise imuno-histoquímica em uma matriz de tumor contendo 153 avaliáveis ​​espécimes de cancro do cólon de todos os estágios clínicos. A intensidade de coloração β1i foi avaliada numa escala de 0 a 3 e os nossos resultados indicaram que a maioria (cerca de 70%, N = 107 de 153 amostras no total) de tecidos de cancro de cólon foi positivo (a intensidade da coloração ≥1) para β1i coloração (Figura 1B). Análises semelhantes foram realizadas utilizando uma matriz de tumor contendo 43 avaliáveis ​​espécimes de cancro do pâncreas de todos os estágios clínicos. Devido à dimensão limitada da amostra, a intensidade da coloração β1i foi avaliada numa escala de 0 a 2 e os nossos resultados indicaram que, aproximadamente, 53% (n = 23 em cada 43 Total de amostras) de tecidos de cancro do pâncreas tinha positivo (o ≥ intensidade de coloração 1) coloração β1i (Figura 1C). Para ambas as matrizes de tecido, avaliamos se há alguma associação entre a expressão β1i e fatores clínico-patológicas disponíveis (por exemplo, gênero e grau do tumor). No entanto, os resultados não revelaram quaisquer associações aparentes.

(a) análise de imunotransferência de lisados ​​de proteína β1i usando preparados a partir de nonmalignant (N) e cancerosos (T) tecidos do cólon a partir dos mesmos doadores (n = 4 pares) . β-actina foi utilizado como um controlo de carga. As intensidades das bandas para β1i e β-actina foram densitometricamente analisadas e utilizadas para obter a expressão β1i relativo normalizado para p-actina níveis. (B) coloração imuno-histoquímica para β1i usando uma matriz de tumor contendo 153 amostras de tecido do cólon tumor avaliáveis. As intensidades de coloração positiva β1i foram avaliados numa escala de 0 a 3. Cerca de 70% (46 amostras tinha intensidade do grau 1, 38 com o grau 2, e 8, com o grau 3, de 153 amostras de tumor totais) de tecidos colorrectais têm positiva (a intensidade da coloração ≥1) β1i coloração. (C) coloração imuno-histoquímica para β1i usando uma matriz de tumor contendo 43 amostras de tecido de tumores pancreáticos avaliáveis. As intensidades de β1i coloração positiva foram avaliados em uma escala de 0 a 2. Aproximadamente 53% (9 espécimes com intensidade de grau 1 e 14 com grau 2, de 43 espécimes de tumor total) de tecidos de câncer de pâncreas teve ≥1 β1i intensidade de coloração .

atividade catalítica da β1i em um painel de linhas celulares de cancro humano contendo diferentes Codon 60 polimórfica Variantes

Anteriormente, Blackburn et al. [20] relataram que o AC-Pal-AMC (Figura 2A) pode ser utilizado como uma sonda selectiva para a medição da actividade catalítica de β1i. Antes da utilização de Ac-Pal-AMC no nosso estudo, ainda verificado que a hidrólise de Ac-Pal-AMC foi selectivamente mediados por β1i utilizando preparações purificadas de proteassoma imunoproteassoma e constitutiva. Com efeito, Ac-Pal-AMC foi facilmente hidrolisados ​​pelo imunoproteassoma, mas não pelo proteassoma constitutiva (Figura 2B). O pré-tratamento com UK101, um inibidor de proteassoma β1i-selectiva [21], a hidrólise Ac-Pal-AMC completamente inibida, validando o Ac-Pal-AMC como uma sonda β1i-selecitve (Figura 2B). Do mesmo modo, cerca de 90% de hidrólise de Ac-Pal-AMC foi inibida em extractos de Panc-1 células por UK-101 pré-tratamento (Figura 2C). Em contraste, a hidrólise de Suc-LLVY-AMC foi apenas parcialmente bloqueadas por UK101 pré-tratamento em Panc-1 extractos, sugerindo que Suc-LLVY-AMC é hidrolisado por meios diferentes β1i subunidades de proteassoma (por exemplo, β5 ou β5i) (Figura 2C).

(a) a estrutura química de Ac-PAL-AMC. (B) hidrólise Ac-PAL-AMC ao longo do tempo pelo proteassoma purificado constitutiva (cruz), immunoproteasome purificado (círculo fechado), ou immunoproteasome purificada pré-tratados com UK101 (praça). Um aumento linear foi observada apenas em poços contendo imunoproteassoma. (C) A taxa de hidrólise de Ac-Pal-AMC ou Suc-LLVY-AMC, na presença de extracto de células Panc-1 (10 ug). A hidrólise de Ac-Pal-AMC foi quase completamente inibida por pré-tratamento UK101 (10 uM). A hidrólise de Suc-LLVY-AMC foi parcialmente inibida por UK-101 pré-tratamento. Epoxomicina (EPX, 10 mM), um inibidor de proteassoma amplamente na qualidade, foi usado como um controlo positivo.

Após a validação de Ac-Pal-AMC como uma sonda β1i-selectiva, que, em seguida, avaliada a actividade β1i num painel de linhas celulares de cancro humano. Estas linhas celulares foram selecionados para a sua

PSMB9

genótipos no códon 60 (n = 6 para aqueles que transportam HH ou HR genótipo; n = 11 para os portadores do genótipo RR) e não verificado para ter quaisquer variações adicionais no

PSMB9

gene por sequenciação directa (Tabela S1). Os nossos resultados indicaram que as actividades catalíticas de β1i avaliadas pela velocidade de hidrólise de Ac-Pal-AMC substancialmente variar entre estas linhas celulares, no entanto, estas diferenças não parecem estar associadas com o estado polimórfico codão 60 (Figura 3).

(a) a actividade catalítica de β1i medido pela velocidade da hidrólise de Ac-Pal-AMC em linhas de células de cancro humano com H /H ou genótipo R /H (barras em branco) e R /R genótipo (barras a cheio). Foi observada atividade variável entre linhas celulares. (B) taxa de hidrólise Ac-Pal-AMC em linhas de células com H /H ou genótipo R /H (círculos abertos) ou R /R genótipo (quadrados fechados). Taxa de hidrólise não mostraram qualquer diferença estatisticamente significativa entre H + e linhas de células H-.

β1i Expressão em linhas celulares de cancro humano contendo diferentes Codon 60 polimórfica Variantes

Como próximo passo , nós examinamos se os níveis de expressão β1i são influenciadas pelo estado polimórfico codão 60 nas linhas celulares tumorais testadas. De modo a quantificar os níveis de proteína β1i, que exibem uma variabilidade substancial entre diferentes linhas celulares, utilizou diluídos em série extractos de células H23 como padrões de calibração (Figura 4). Uma comparação de linhas celulares com o H-alelo para aqueles que não têm o H-alelo não mostraram diferenças estatisticamente significativas na expressão β1i (Figura 5A). Em vez disso, encontramos uma correlação altamente significativa entre a β1i catalítica de atividade e seu nível de expressão (Figura 5B, r

2 = 0,86, p 0,0001, valores individuais estão incluídos na Tabela S1). Estes achados sugerem que os diferentes níveis de expressão de β1i consideração a probabilidade de a maioria de variabilidade observado na actividade β1i em diferentes linhas celulares.

Uma quantidade equivalente (10 ug) de extractos celulares foram sujeitos a imunotransf erência com um anticorpo para β1i juntamente com extractos de células H23 diluído seriadamente (padrões de calibração). As análises densitométricas de intensidades de bandas foram realizados para quantificar os níveis de expressão relativos de β1i. elevados níveis de β1i linhas celulares de expressão são mostrados em (a) e linhas de células com baixa expressão de β1i são mostrados em (B).

(a) β1i expressão em linhas de células com H /H ou R /H (círculo aberto) e genótipos R /R (quadrado fechado). expressão β1i não mostrou diferença estatisticamente significativa entre H + e linhas de células H-. (B) hidrólise de Correlação de Ac-Pal-AMC com expressão β1i em todas as linhas celulares testadas. Uma correlação altamente significativa foi observada entre os níveis de expressão de β1i e sua atividade catalítica (R

2 = 0,86, p 0,0001).

Discussão

Em nosso estudo , investigamos o impacto da

PSMB9

códon 60 polimorfismos na subunidade β1i do immunoproteasome expressa em várias linhas celulares de cancro usando um relatado recentemente sonda atividade β1i, Ac-PAL-AMC. Os nossos resultados indicam que o polimorfismo do codão 60 não tem um impacto importante sobre os níveis de expressão ou actividades catalíticas de β1i no painel de linhas celulares de cancro humano, testadas. Estes resultados são diferentes dos resultados anteriores que indicavam que o tecido cerebral de indivíduos com idade entre portadores do alelo H códon 60 tinham diminuído atividade do proteassoma comparação com o tecido de quem não realizou o códon 60 H alelo [17]. Uma possível razão para estas aparentes discrepâncias podem estar relacionadas às diferentes substratos utilizados para avaliar a actividade proteolítica. O substrato fluorogénico Suc-LLVY-AMC utilizada por Mishto et ai. [17] é normalmente utilizado para medir a actividade geral do tipo quimotripsina do proteassoma. No entanto, uma vez que este substrato pode ser hidrolisado por tanto o imunoproteassoma (β1i e β5i) e o proteassoma constitutivo (β5) [25], os resultados obtidos usando Suc-LLVY-AMC não pode analisar-se a contribuição directa do polimorfismo genético β1i. Os nossos resultados actuais foram obtidos utilizando o recentemente reportado substrato Ac-PAL-AMC que é clivado selectivamente por a subunidade β1i (Figura 2) [20]. Os nossos resultados são consistentes com o relatório anterior de que o

PSMB9

códon 60 polimorfismo não teve impacto sobre os perfis de degradação de um péptido 28-mer (Kloe 258) e uma forma recombinante da IkBα, um regulador chave da NF clássica via -κB e substrato de proteassoma bem conhecido [18]. Embora não possamos excluir totalmente a possibilidade de que o impacto do polimorfismo codão 60 pode variar dependendo dos tipos de substrato e da doença, os resultados do presente estudo e outros sugerem que o polimorfismo do codão 60 não irá provavelmente contribuem para a variabilidade inter-individual β1i níveis de atividade catalítica.

Com os sucessos clínicos notáveis ​​de bortezomib e carfilzomib no tratamento de mieloma múltiplo e outras doenças malignas hematológicas, o proteassoma é agora reconhecido como um importante alvo quimioterápico. No entanto, as toxicidades indesejáveis ​​limitar o amplo uso de drogas-alvo do proteassoma atualmente disponíveis. Para superar estas limitações, o imunoproteassoma, uma forma alternativa do proteassoma constitutivo, tem sido explorada como um alvo terapêutico alternativo. Esses esforços renderam compostos-alvo immunoproteasome promissores com eficácia anticancerígena e melhores perfis de toxicidade [7], [23], [26], [27]. Ao explorar abordagens immunoproteasome-alvo para terapia de câncer, é importante considerar a expressão immunoproteasome através de diferentes tipos de câncer. Enquanto o imunoproteassoma é conhecido por ser sobre-regulada em doenças malignas hematológicas, a expressão do imunoproteassoma no cancro sólido não tenha sido completamente examinada. No estudo actual, que relatam que a subunidade β1i é frequentemente expressas em amostras de tecido do cólon e clínicos de cancros do pâncreas, bem como um painel de linhas celulares de cancro humano derivadas de tecidos do cólon, do pulmão, da próstata e da mama. Embora os resultados semelhantes foram relatados por nosso grupo e outros [21], [23], [28], [29], o nosso estudo actual fornece informações mais robusta relativamente à expressão de β1i na maioria dos cólon clínica e tecidos de cancro pancreático testadas . Deve notar-se que a regulação negativa das subunidades imunoproteassoma também tem sido relatado, em alguns tipos de cancro [30] – [34] e é possível que o estado do imunoproteassoma expressão pode ser dependente de tipos de doenças e seus mecanismos patogénicos. Por outro lado, deve notar-se que os nossos resultados sobre as frequências dos polimorfismos β1i de linhas celulares de cancro derivadas de diferentes órgãos não são necessariamente reflexivo daqueles entre estes tipos de cancro. Isto é em parte devido ao pequeno tamanho da amostra eo desenho experimental do nosso estudo atual. Em particular, o desenho da pesquisa envolveu a exclusão de várias linhas de células albergando polimorfismos adicionais nos genes que codificam β1i e /ou de outras subunidades tais como imunoproteassoma β5i, a fim de minimizar os factores de composição potenciais. Os nossos resultados sugerem que o codão 60 polimorfismos não são susceptíveis de ser responsável pela variabilidade observada na β1i expressão /actividade entre as linhas de células testadas. Em ainda validar os nossos resultados, pode ser importante empregar um tamanho de amostra maior de linhas de células de cancro ou de amostras clínicas derivados dos mesmos órgãos, talvez comparação das amostras com os níveis de expressão comparáveis ​​β1i. Além disso, estudos de associação genética examinando o polimorfismo β1i no códon 60 no contexto do desenvolvimento e progressão do câncer também são garantidos.

Em conclusão, nossos resultados demonstram que a subunidade β1i do immunoproteasome é frequentemente expressa em cólon e pâncreas cancros e possivelmente em outros tipos de cancros sólidos. Além disso, o polimorfismo genético no codão 60 parece não ter qualquer impacto importante sobre a expressão e a actividade catalítica de β1i em células cancerosas. Tomados em conjunto, estes resultados podem fornecer informações úteis para o desenvolvimento de agentes anti-câncer de metas immunoproteasome. Além disso, estes resultados excluem códon 60 estatuto polimórfica como um fator potencial de contribuir para a sensibilidade variável aos inibidores immunoproteasome segmentação β1i.

Informações de Apoio

Tabela S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0073732.s001

(DOCX)