Abstract

Fundo

O melanoma maligno é um tumor agressivo da pele e parece ser resistente a actual terapêutica abordagens. transformação melanocítico é pensado para ocorrer pelo acúmulo sequencial de alterações genéticas e moleculares capazes de ativar o /Raf /MEK /ERK Ras (MAPK) e /ou da PI3K /AKT (AKT) vias de sinalização. Especificamente, as mutações de B-RAF activar via MAPK resultando na progressão do ciclo celular e na prevenção de apoptose. De acordo com estes resultados, MAPK e vias AKT pode representar alvos terapêuticos promissores para uma doença de outra forma devastadora.

Resultado

Aqui nós mostramos um modelo computacional capaz de simular as principais interações bioquímicas e metabólicas no PI3K /AKT e MAPK potencialmente envolvido no desenvolvimento de melanoma. Em geral, esta abordagem computacional pode acelerar o processo de descoberta de drogas e encoraja a identificação de novos activadores da via com o consequente desenvolvimento de novos compostos antioncogenic para vencer a resistência de células tumorais a agentes terapêuticos convencionais. O código-fonte das várias versões do modelo estão disponíveis como S1 Arquivo

Citation:. Pappalardo F, Russo G, Candido S, Pennisi M, Cavalieri S, Motta S, et al. (2016) Modelagem Computacional da PI3K /AKT e MAPK vias de sinalização em cancro da melanoma. PLoS ONE 11 (3): e0152104. doi: 10.1371 /journal.pone.0152104

editor: Suzie Chen, da Universidade Rutgers, Estados Unidos

Recebido: 22 Janeiro, 2016; Aceito: 08 de março de 2016; Publicação: 25 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Pappalardo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e como um arquivo de informações de apoio

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente apoiado pela FIR 2014 Universidade de Catania, Itália concessão. Não houve outras fontes de financiamento que apoiam este trabalho. FIR 2014 parcialmente apoiado o trabalho. O esforço restante vem de pessoal interno trabalhar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

RAS /RAF /MEK /ERK e PI3K /AKT percursos /mTOR representam transdução de sinalização fundamental e redes de regulação para a maioria dos processos fisiológicos celulares, como a proliferação, diferenciação e sobrevivência celular.

Estas vias são mais ativados por alterações em Ras, B-RAF, PI3K , e genes PTEN [1]. A activação destes percursos é responsável de proliferação celular descontrolada e pode contribuir para a resistência aos medicamentos. As terapias de combinação com inibidores farmacológicos destas vias pode ter potenciais utilizações para a supressão da proliferação de células cancerosas e, por sua vez pode ser eficácia para reverter a resistência. O melanoma maligno é um bom modelo de tumor para investigar a activação de RAS /RAF /MEK /ERK e as vias de PI3K /AKT /mTOR, uma vez que é frequentemente afectada por B-RAF

mutação V600E que causa a activação de MAPK via [2 ]. É um tumor agressivo da pele com um mau prognóstico para pacientes com doença avançada e parece ser resistente a abordagens terapêuticas atuais.

transformação melanocítico é pensado para ocorrer pelo acúmulo sequencial de alterações genéticas e moleculares [3 , 4]. Embora, os mecanismos patogénicos subjacentes ao desenvolvimento de melanoma são ainda largamente desconhecida, vários genes e vias metabólicas foram mostrados para realizar alterações moleculares em pacientes com melanoma. mutações apresentam melanomas na via de Ras /RAF /mitogénio proteína quinase activada (MAPK). Demonstrou-se que 50% melanomas cutâneos Anexo B-RAF

mutações V600E, o que resulta numa substituição de aminoácidos na posição 600 em B-RAF, a partir de uma valina (V) com um ácido glutâmico (E). Esta mutação é conhecida por desempenhar um papel fundamental na proliferação e sobrevivência de células de melanoma, através da activação da via de MAPK [5]. Em particular, ocorre dentro do segmento de activação do domínio quinase e que resulta numa actividade aumentada do próprio quinase. A activação constitutiva da actividade quinase leva a unresponsitivity de mecanismos de feedback negativo dentro da via MAPK [6].

Além disso, uma interacção entre a MAPK e a phosphatidylinositide 3-quinase (PI3K) /AKT vias tem sido encontrada em melanoma cutâneo [7]. Curiosamente, estes estudos sugerem que MAPK e AKT percursos são activados em paralelo e a evidência de que a via PI3K /AKT e MAPK /ERK1 /2 cascatas estão interligados é largamente descrito [8, 9, 10]. Existem vários pontos de conversa cruzada entre estas duas vias, cuja acção coordenada determina o destino das células [11]. Não é surpreendente que as PI3K /AKT e MAPK vias influenciam uns aos outros em diferentes fases de propagação do sinal, tanto negativa como positiva, resultando em cross-talk dinâmico e complexo. De acordo com estes resultados, MAPK e AKT percursos poderiam representar alvos terapêuticos promissores para uma doença de outra forma devastadora.

As simulações de computador e modelagem computacional são úteis para analisar e para aumentar o conhecimento de vias metabólicas e suas interações complexas com o objectivo de compreender os mecanismos de resistência à terapia medicamentosa convencional no melanoma [12, 13, 14].

neste trabalho desenvolvemos um modelo computacional que simula tanto PI3K /AKT e MAPK caminhos e as suas interacções, a fim de analisar as reacções da cascata responsáveis ​​pelo desenvolvimento de melanoma. Além disso, modelada o comportamento da linha de células de melanoma maligno A375, abrigando B-RAF

mutação V600E, no âmbito do tratamento de Dabrafenib, um inibidor selectivo da comercial B-RAF, recentemente aprovado para o tratamento de pacientes com mutation- BRAF V600E melanoma positiva avançada [15].

no geral, pode ser utilizado este modelo para um laboratório em silico para estudar os efeitos de potenciais inibidores que podem melhorar a resposta aos tratamentos padrão.

Métodos

modelo computacional de MAPK e PI3K /AKT

a fim de compreender os efeitos das alterações B-RAF em ambas as vias RAF-ERK e PI3K-AKT nós iniciados a partir do modelo desenvolvido por Brown e colaboradores [16]. No seu trabalho, os autores apresentaram um modelo computacional do Factor de Crescimento Epidérmico (EGF) e o Factor de Crescimento do Nervo (NGF) via ERK activada em células PC12, contendo 13 espécies diferentes de proteína e 16 reacções bioquímicas. Nosso modelo foi desenvolvido utilizando COPASI (complexo percurso simulador), um software para simulação e análise de redes bioquímicas e sua dinâmica [17]. Nosso modelo expandiu-se consideravelmente o modelo Brown. É composto por 48 espécies e 48 reações bioquímicas.

Para incluir todas as entidades e suas respectivas interações úteis para o alvo deste estudo, nós recuperado todas as informações necessárias a partir KEGG (Enciclopédia Kyoto de genes e genomas) CAMINHO banco de dados [18]. Em particular, nós nos concentramos sobre as interacções entre dois caminhos específicos: via de sinalização MAPK (referência Kegg: ko04010) e via de sinalização PI3K-AKT (Kegg referência: hsa04151). Foi estudado o comportamento complexo dos mais importantes cascatas de cinase de proteína que envolvem o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), fosfatidilinositol 4,5-bifosfato-3-quinase (PIK3CA), cinase RAC serina /treonina-proteína (AKT) e proto RAF quinase de serina /treonina-proteína -oncogene (RAF1). Isso, inevitavelmente, levar-nos a considerar as outras vias de sinalização que mostraram uma correlação com os que podem induzir fenómenos de resistência Dabrafenib. Para este fim, também incluiu nas Ras modelo via de sinalização (Kegg referência: ko04014) e via de sinalização mTOR (Kegg referência: ko041150). Investigar eventuais mecanismos não observados antes

concentrações iniciais relativos de entidades incluídas no o nosso modelo foram recolhidas a partir de GSE22301 disponíveis no GEO (Gene Expression Omnibus) conjunto de dados (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) incluindo perfil de expressão de vários linha celular de melanoma A375, assim como utilizado no presente estudo. dados da matriz de microarray foram normalizados pela transformação log usando MeV ferramenta de análise de dados [19]. Resumindo, foi utilizado banco de dados KEGG para compreender e modelar o fluxo percurso e o conjunto de dados GEO para obter a linha de células A375 perfil de expressão; Além disso, vamos definir os valores das concentrações das proteínas como encontrado por Brown et al.

As leis que regiam as ativações /desativações no modelo de Brown foram baseados na cinética de Henri-Michaelis-Menten. Esta lei cinética é um dos modelos mais comuns de cinética enzimática. A sua forma matemática é a seguinte:

descreve a taxa de reacções enzimáticas, em que “V” representa a taxa máxima atingida pelo sistema, enquanto Henri-Michaelis-Menten (Km) é a concentração de substrato na que a taxa de reação é a metade do V [20].

Nós ligeiramente modificada a lei clássica Henri-Michaelis-Menten para ter em conta tanto o substrato e o modificador que desempenha um papel específico quando consideramos reações que ativados (e /ou desactivada) proteínas específicas. A equação do Henri-de Michaelis-Menten modificada é:

K cat representa o número de reacções enzimáticas catalisadas por segundo e a equação inclui dois tipos de substratos. Substrate1 representa o modificador da reacção, enquanto que o substrato é Substrate2 genérico. Isso resulta mais adequado para os nossos objectivos porque analisa a relação entre as reacções do sistema e a sua afinidade para o substrato, tendo em conta a eficiência do modificador envolvido.

Todas as reacções bioquímicas utilizados no nosso modelo pode ser portanto, dividida em quatro classes principais:

i)

reações de desativação de ativação /modelados com uma lei Henri-Michaelis-Menten modificada (por exemplo Raf1Inactive torna-se activado (Raf1Active) através RasActive);

ii)

reações que fisiologicamente inativar espécies, modelados com a legislação ação de massa (por exemplo C3G desativação);

iii)

proteínas degradação modelado com direito a ação de massa (por exemplo, a degradação Dabrafenib);

iv)

produção de proteínas modeladas com a legislação constante fluxo irreversível (por exemplo, a produção de livre RTK).

Uma das metas do modelo foi analisar a dinâmica dos nós críticos em A375 linha de células de melanoma abrigar B-RAF

mutação V600E. Portanto, nós modelamos essa linha celular como se segue:

i)

introduzimos as novas espécies bRafMutated com a mesma concentração inicial de bRafInactive de 120,000 mmol /ml;

ii)

que foi excluído a ativação B-RAF por Rap1 como as novas espécies bRafMutated não é afetado por essa sinalização (o mesmo se aplica para Ras);

iii)

que inibiu a desativação de B-RAF por Raf1PPtase (como Raf1PPtase não influencia mais B-RAF);

iv)

bRafMutated substitui a espécie bRafActive no desencadeamento da activação Mek. O outro objectivo do modelo é a usá-lo como um silico em laboratório para analisar o comportamento de tratamentos terapêuticos específicos contra o melanoma, em particular nos seus mecanismos de resistência, com o objectivo sugerir novas estratégias que podem ser utilizados nestas circunstâncias. Nós, portanto, inserido no modelo as características para reproduzir o efeito do inibidor Dabrafenib na dinâmica complexa da via PI3K /AKT. Para fazer esta tarefa, nós adicionamos a espécie Dabrafenib (em diferentes concentrações, consulte a secção Resultados). Em seguida, modelado duas reacções específicas isto é, a degradação do fármaco normal e o efeito principal de Dabrafenib na inibição das espécies bRafMutated. A partir da literatura específica, é relatado que a meia-vida de Dabrafenib é de 10 horas (web site da Agência Europeia de Medicamentos: https://www.ema.europa.eu). Usamos esse parâmetro para definir a lei ação de massa associada a reproduzir a sua decadência.

Outro aspecto importante não é considerado no modelo de Brown é que todos os receptores estão muito rapidamente desencadeada por EGF e, consequentemente, permanecem constitutivamente activado porque o seu modelo não ter em conta qualquer reação da degradação dos receptores. Modelamos este aspecto da inserção de um processo de degradação com base em uma lei de acção de massas irreversível que afeta tanto os receptores livres e ligadas RTK. Além disso, o modelo de Brown EGF original não incluem a via C3G /Rap1, um ponto fundamental para a tecla de activação de B-RAF e consequentemente sobre a dinâmica de ERK. Para este fim, modelada a activação das espécies C3G através do receptor RTK ligada e a activação Rap1 através da proteína C3G activado.

Além disso, nós profundamente analisado o papel fundamental da proteína quinase AKT na diafonia entre os dois principais vias envolvidas. Em particular, nós focada sobre o papel de AKT na activação da via de mTORC1 e na máquina de activação /desactivação de várias proteínas de sinalização AKT. A aplicação resultante do modelo de vias, juntamente com o conjunto de equações diferenciais ordinárias relativa pode ser encontrado olhando para o Figs 1 e 2.

reacções de activação /desactivação (modelado com uma lei-Henri de Michaelis-Menten modificado) são mostrados da seguinte maneira: o modificador ou seja, o catalisador que desencadeia a reacção é representada por uma linha fina luz verde terminando com um losango; as espécies envolvidas são conectados por setas que começam com uma cor azul (espécies de entrada) e terminando com uma cor marrom (espécies resultantes). Por exemplo, Raf1Inactive torna-se activado (Raf1Active) através RasActive. Reações que fisiologicamente inativar espécies (modelados com a legislação ação de massa) são representados por uma seta começando com uma cor azul e terminando com uma cor marrom, por exemplo C3G desativação. Proteínas degradação (modelado com a legislação ação de massa) são descritos com as espécies consideradas ligadas por um final seta com um símbolo conjunto vazio, por exemplo degradação Dabrafenib. produção de proteínas (modelado com a lei de fluxo constante irreversível) são descritos com as espécies consideradas ligados por uma seta (por exemplo, a produção de livre RTK). O software Arcadia (https://arcadiapathways.sourceforge.net) tem sido utilizado para produzir a representação gráfica do modelo.

As versões dos modelos Copasi pode ser acessado como S1 Archive.

cultura de linha celular e tratamento

linha de células A375 foi obtido de ATCC (LGC Standards, Itália). Esta linha celular derivada de uma mulher de 54 anos com melanoma maligno e representa um bom modelo para o estudo do papel de MAPK e AKT vias porque é afectada por uma única alteração apresentada no gene da B-RAF (V600E) (Ver site cósmica , https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Na verdade, a presença de outras alterações genéticas, tais como as mutações em genes KRAS ou ARN, pode determinar a activação de MAPK via.

A linha de células de melanoma A375, obtidas a partir de ATCC (LGC Standards, Itália), foram cultivadas numa atmosfera de 5% incubadora de CO2 humidificada a 37 ° C com meio RPMI-1640 suplementado com 2 mmol /L de L-glutamina, 100 UI de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (FBS), adquirido a partir de Lonza ( Walkersville, EUA). O A375 foram plaqueadas em placas de cultura celular de 70 mm a uma densidade de 500.000 células e depois de 24 h foram tratadas durante 48 h com Dabrafenib (Selleck Chemical, EUA) a uma concentração final de 2, 1, 0,5, 0,25 e 0,125 nM. Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich, EUA) foi utilizado como controlo.

análise Western blot

Proteína perfis de linhas de células A375 tratadas foi analisado por transferência de Western utilizando o anti-MAP cinase ERK1 /ERK2 (pThr202 /pThr204) de coelho Ab (cat. n. 442685) e anti-MAP cinase ERK1 /ERK2 coelho Ab (cat. n. 442704) fornecida a partir de Merck Millipore (Darmstadt, Alemanha) para detectar fosforilada e total de ERK 1 /2 proteínas, respectivamente. O Anti-beta Tubulin Ab (ab 15568- Abcam, Cambridge, UK) foi usado como gene housekeeping. cromogénico detecção das proteínas foi realizada com HRP cromogénico Novex (Invitrogen, EUA). imagens de Western blot foram analisados ​​com o software de imagem J. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. O teste t de Student foi utilizado para análise estatística.

Resultados

Foram simulados nosso modelo em condições normais do factor de crescimento genérico (GF) estimulação para verificar se ele deu uma forte ativação transitória da ERK. Em seguida, simulou a linha de células A375 com a mutação B-RAF. Neste caso, esperávamos actividade ERK elevada que é característica do B-RAF

V600E mutante melanomas. A Fig 3 mostra a dinâmica de ERK activada tanto (pERK) e B-RAF. Painel esquerdo destaca o caso normal condição; enquanto, o painel da direita mostra B-RAF cenário mutante linha de células A375. Finalmente, a simulação prevê correctamente o comportamento esperado isto é, as espécies ErkActive tem uma actividade elevada constante. Devido às não-linearidades do modelo apresentado e ao elevado número de nós e interações dentro da via, mesmo se existe uma clara relação entre bRafActive e ErkActive, não podemos dizer que existe uma relação linear entre os dois.

o painel esquerdo mostra o comportamento sob estimulação GF normal, enquanto o painel direito descreve a dinâmica com B-RAF (bRafMutated) mutação em linhas de células A375.

em particular, os níveis mais elevados de ErkActive não são observadas, provavelmente, devido ao fato de que ErkActive já está perto de seus níveis de limiar e /ou devido à contribuição de outros nós no caminho que pode influenciar o resultado final.

Além disso, simulamos o comportamento das linhas de células A375 sob diferentes concentrações de inibidor Dabrafenib. B-RAF inibição resulta na limitação da actividade vantagem. Deste modo, na Tabela 1 a percentagem de inibição da vantagem é mostrada como resultado da relação de pERK e ERK. resultados concordantes foram obtidos analisando in vitro e in silico de dados.

A dinâmica de ambos pERK e B-RAF mutada foram modelados (Fig 4). ERK na concentração de silício foi ajustado para 600.000 mmol /ml. Cinco painéis são mostrados. Cada painel apresenta a Perk, B-RAF mutada e dinâmica Dabrafenib em 48 horas de simulação em diferentes Dabrafenib dosagem ou seja, 0,125 nM (A), 0,250 nM (B), 0,500 nM (C), 1,0 nM (D) e 2,0 Nm (E). Quando o tratamento não é administrado (DMSO) concentração pERK atingiu 571950 mmol /ml no tempo de 48 h. Com diferentes doses de Dabrafenib, concentrações pERK atingiu 529602 mmol /ml (A), 368352 mmol /ml (B), 207518 mmol /ml (C), 106758 mmol /ml (D) e 53385 mmol /ml (E), que mostra , respectivamente, a percentagem de inibição apresentados na Tabela 1.

pERK concentrações diminuir durante o tratamento Dabrafenib na linha de células de melanoma A375. O comportamento da vantagem é directamente correlacionada com a concentração Dabrafenib. Diferentes doses de Dabrafenib são mostradas (1 nM = 1e-9 mmol /ml): 1,25E-10 mmol /ml (A), 2.5E-10 mmol /ml (B), 5e-10 mmol /ml (C), 1e -9 mmol /ml (D) e 2e-9 mmol /ml (e). Em todos os painéis do eixo y linhas pontilhadas direita representam concentrações bRafMutated enquanto linhas sólidas representam concentrações Dabrafenib.

A redução das concentrações de vantagem é, de acordo com o observado in vitro.

Fig 5 evidencia parcelas transferência de western. Também neste caso, obteve-se uma boa concordância com os resultados in silico. Em conclusão, tanto a partir dos resultados do modelo e dos experimentos in vivo, podemos observar que os níveis de p-ERK suspensa devido à atividade do inibidor de Dabrafenib mais de proteína B-RAFV600E. Analisou-se p-ERK, uma vez que é uma cinase de proteína da chave envolvido na sinalização de proliferação celular. Um aspecto importante relacionado com a inibição da proteína de B-RAFV600E é que uma pequena fracção de doentes com melanoma tratados desenvolve mecanismos de resistência que fazem a terapia não mais eficaz. O modelo pode ser útil analisar as complexas PI3K /AKT e MAPK vias, a fim de descobrir proteínas que podem causar estes fenómenos de resistência.

análise de Western blot de p-Erk e ERK total na linha de células de melanoma A375 após o tratamento com diferentes doses de Dabrafenib durante 48 horas (a). sinal de p-ERK foi normalizada com o sinal total de ERK (B), SD e os meios de os valores p-ERK normalizados foram relatados.

Conclusões

Foi apresentado um modelo computacional que simula tanto PI3K /AKT e MAPK e suas interações, a fim de analisar as reações em cascata responsáveis ​​pelo desenvolvimento do melanoma. Foram simulados uma intervenção terapêutica isto é, a administração de um inibidor da B-RAF bem conhecido, Dabrafenib. Este estudo mostrou como os modelos computacionais podem ser ferramentas úteis para investigar e comparar o comportamento biológico de transdução de sinal as vias como eles podem sugerir novas hipóteses para explicar os dados biológicos observados e ajudar a compreender a dinâmica de como as funções da via. Além disso, os modelos computacionais podem ser prontamente usadas para investigar diferentes estados de doença e sugerem como o tratamento de drogas podem ser melhorados para melhor combater os efeitos da doença. Acreditamos que o nosso modelo é uma boa representação da PI3K /AKT e MAPK com via ERK ativado que pode ser expandida e aplicada no futuro para investigar mais profundamente a dinâmica de mecanismos resistentes a fim de sugerir nova intervenção para sugerir novas intervenções terapêuticas.

Informações de Apoio

S1 Archive. No arquivo zip, existem três versões diferentes disponíveis do modelo: PI3K_AKT_Final_V2.1.cps arquivo, modelo fisiológico ou seja, nenhuma mutação B-RAF; PI3K_AKT_Final_V2.1_A375.cps, linha modelo de células A375 ou seja, o arquivo com a mutação B-RAF; PI3K_AKT_Final_V2.1_A375_Dabrafenib.cps de arquivos, modelo completo tanto com mutação B-RAF e Dabrafenib inibidor definido na dosagem mais baixa

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152104.s001

(ZIP)