Abstract

O câncer colorretal (CCR) é a principal causa de morte relacionada com cancro na Europa e nos EUA. Não há nenhum teste de triagem aceite universalmente eficaz não-invasivo para CRC. Guaiac baseada fecal de sangue oculto testes (gFOB) tem sido largamente ultrapassada por fecal imunoquímicos testes (FIT), mas sensibilidade continua a ser pobre. A captação da população com base testes FOBT no Reino Unido também é baixa em torno de 50%. A detecção da assinatura compostos orgânicos (VOCs) volátil (s) para diversos subtipos do cancro está a receber cada vez maior interesse usando uma variedade de instrumentos de análise de fase de gás. Um exemplo é FAIMS (Campo Asymmetric Ion Mobility Spectrometer). FAIMS é capaz de identificar a doença inflamatória do intestino (IBD) pacientes analisando mudanças nos padrões de COV na urina e fezes. Este estudo estende este conceito para determinar se os pacientes de CRC podem ser identificados através da análise não-invasiva de urina, usando FAIMS. 133 pacientes foram recrutados; 83 pacientes CRC e 50 controles saudáveis. A urina foi coletada no momento do diagnóstico CRC e análise headspace realizada utilizando um instrumento FAIMS (Owlstone, Lonestar, UK). Os dados foram processados ​​usando Fisher Análise Discriminante (FDA), após extracção recurso a partir dos dados em bruto. As análises FAIMS demonstraram que os perfis de VOC de pacientes com CCR foram fortemente agrupados e poderia ser distinguido de controlos saudáveis. Sensibilidade e especificidade para detecção de CRC com FAIMS foram de 88% e 60%, respectivamente. Este estudo sugere que as assinaturas de COV que emanam de urina podem ser detectados em pacientes com CRC utilizando a tecnologia de espectroscopia de mobilidade iônica (FAIMS) com potencial como um romance ferramenta de triagem

Citation:. Arasaradnam RP, McFarlane MJ, Ryan-Fisher C , Westenbrink E, Hodges P, Thomas MG, et al. (2014) Detecção de câncer colorretal (CRC) por análise de compostos orgânicos voláteis urinária. PLoS ONE 9 (9): e108750. doi: 10.1371 /journal.pone.0108750

editor: Keping Xie, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de junho de 2014; Aceito: 25 de agosto de 2014; Publicação: 30 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Arasaradnam et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão incluídos dentro do papel

Financiamento: O trabalho foi apoiado por Bardhan Pesquisa e Educação Charity (BRET) caridade, caridade Warwickshire Hospital Privado, Eveson confiança – desde o financiamento de materiais.. BRET foi estabelecida pelo professor Bardhan mas ele não tinha entrada na decisão de financiamento feito pela comissão de atribuição da subvenção. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de morte relacionada com câncer na Europa e nos EUA [1], [2]. No momento, há uma falta de testes de rastreio eficazes e não-invasivos para CRC. Os métodos atuais utilizam baseada sangue oculto nas fezes (gFOB) testes guaiac, no entanto, este foi em grande medida substituídos por fecal imunoquímicos Testing (FIT). Embora isto seja uma melhoria, FIT mostra ainda relativamente baixa sensibilidade para CRC, 66-88%, dependendo dos valores de corte para hemoglobina (50-200 ng /ml), com uma especificidade de 87-96% [3] – [ ,,,0],5]. A sensibilidade para o adenoma avançado é ainda mais baixa em 27-41%, com uma especificidade de 91-97% [5]. A captação de rastreio utilizando amostras fecais também é um problema, com aproximadamente 50% dos participantes convidados não aceitando com base triagem FOBT população em nossa localidade.

Não-invasiva testes de cancros, utilizando compostos orgânicos voláteis (COV) e gases que emanam de urina, respiração, fezes e sangue, tem recebido crescente interesse e tem sido uma área de expansão da pesquisa nos últimos anos. Este trabalho começou inicialmente a partir da utilização dos caninos para detectar cancros, o que mostrou uma marcada capacidade para discriminar pacientes de cancro a partir de indivíduos saudáveis, [6], [7], [8]. No entanto, mais recentemente, um número de grupos têm indicado que é possível a utilização de instrumentos de análise em fase gasosa, cromatografia especificamente gasosa e espectrometria de massa (GC-MS), selectivo de iões de espectrómetro de massa de fluxo (SIFT) e o nariz electrónico (e-nariz ), para detectar pulmão, mama, bexiga e câncer de próstata [9], [10], [11], [12]. Para uma revisão detalhada sobre biomarcadores fase gasosa em Gastroenterologia, consulte Arasaradnam et al [13].

Em relação direta com câncer colorretal (CRC), o trabalho recente tem mostrado que é possível discriminar câncer de não- pacientes com cancro, mas também pode ser usado para a discriminação de pulmão, da mama, da próstata e cancro colorectal entre si através da análise de amostras de ar [14]. Este é ainda apoiada por trabalho recente que mostrou também que CRC podem ser distinguidos dos controles com mais de 75% de precisão usando GC-MS, novamente empregando análise do hálito [15]. COV presentes na urina, também foram exibidas para distinguir pacientes de CRC a partir de grupos de controlo e outros cancros (leucemia e linfoma), com CG-EM [16]. O nariz electrónico (Cyrano 320, Sensigent, EUA), também tem sido demonstrado para discriminar entre CRC e controlos saudáveis ​​quando o perfil de COV nas fezes são analisados ​​(sensibilidade de 85% e 87% de especificidade). Além disso, o nariz eletrônico foi capaz de discriminar entre adenomas avançados e controles saudáveis ​​com 62% de sensibilidade e especificidade de 86% [5]. Estes estudos suportam a existência de biomarcadores putativos fase gasosa dentro de mídia de saída biológico para detecção de CRC e, portanto, poderia ser a base de uma ferramenta de triagem rápida.

VOCs podem existir na fase gasosa e estão presentes no ar exalado , suor, urina e fezes [17], [18]. O mecanismo para a geração de compostos orgânicos voláteis é objecto de investigação corrente, mas eles são perturbados em muitos estados fisiológicos e patológicos – afectada pela dieta e estados de doença. Acredita-se que a geração de compostos orgânicos voláteis dentro do intestino são o resultado de bactérias do cólon submetidos a fermentação de polissacáridos não amido – fibra consumidos pelo hospedeiro. Como tal, eles representam a complexa interacção de células do cólon, flora intestinal humana e patogénios invasores [19], [20]. O estudo dos produtos resultantes de fermentação que temos designado por «o fermentome ‘[17], [18], [21], [22] pode ser medido na urina. Este último é presumido possível devido à permeabilidade do intestino alterada proporcionada em certas doenças do intestino [23]. Acreditamos que VOCs representam um bio-assinatura que representa a soma das influências multifatoriais (genética, fatores ambientais, incluindo dieta e doença estados) que afetam um indivíduo. O objetivo deste estudo foi testar o potencial de FAIMS -. Uma nova tecnologia altamente sensível para diferenciar entre CRC e controles saudáveis ​​utilizando amostras de urina apenas

Materiais e Métodos

2.1 Assuntos

cento e trinta e três indivíduos foram recrutados prospectivamente para este estudo. Oitenta e três desses pacientes tinham confirmado histologicamente câncer colorretal e cinquenta eram indivíduos saudáveis ​​que tiveram uma colonoscopia normal, recente. A média de idade dos pacientes com CCR foi de 60 anos (DP 17 anos), 53 (64%) eram do sexo masculino. Os dados demográficos dos sujeitos são apresentados na Tabela 1.

2.2 Estudo Design by

Este foi um estudo de caso-controle onde os pacientes foram recrutados de ambulatórios do Hospital Universitário de Coventry Warwickshire, Reino Unido. A urina foi depois recolhido por contentores normais universais Sterilin amostra (Newport, Reino Unido) e imediatamente congelado a -80 ° C, para análise em lote subsequente.

2.3 Análise

As amostras foram descongeladas à temperatura ambiente durante a noite , divididas em alíquotas em frascos de amostras adequadas e analisados ​​utilizando os FAIMS métodos experimentais descritos abaixo.

2.3.1 FAIMS.

Para a análise FAIMS, um instrumento comercial foi utilizada (Lonestar, Owlstone, Reino Unido, empregando um sistema de amostragem ATLAS e caixa de fluxo split). Este sistema consegue a separação dos componentes químicos com base em diferenças na dependência campo eléctrico de mobilidades químicos ionizados. FAIMS permite que as moléculas de gás a ser separado e analisado à pressão atmosférica e temperatura ambiente, ao contrário de técnicas analíticas tradicionais semelhantes. Depois de uma amostra é ionizado, que é composto por iões de vários tamanhos e tipos. Estes são introduzidos entre duas placas de metal e uma forma de onda assimétrica alta tensão é aplicada a estas placas, sujeitando as moléculas ionizadas a campos eléctricos elevados. A diferença em circulação destas moléculas dentro deste campo eléctrico de alta pode ser medida, resultando assim em uma separação da mistura complexa.

Uma amostra de 5 ml de urina é separado em alíquotas para um frasco de vidro de 20 ml e colocado dentro o amostrador ATLAS. O amostrador aquece a amostra (no nosso caso) 40 ± 0,1 ° C, quando a amostra atinge a temperatura correcta (tipicamente 10 minutos), o ar limpo sintético é passado através da amostra e no instrumento Lonestar FAIMS. A taxa de fluxo através da amostra é de 500 ml /min e aumentado para 2 L /min de ar limpo, antes de ser passado para o instrumento. O Lonestar é configurado para digitalizar entre o campo de dispersão 0 e 90% (o campo de dispersão representa a magnitude do campo elétrico) em 51 etapas e uma tensão de compensação entre -6 V e 6 V em 512 etapas. A tensão de compensação é usado para remover o efeito da deriva produzido pelo elevado campo eléctrico, assim, apenas as moléculas que têm uma saída específica mobilidade das placas a esse ponto. A Figura 1 mostra um típico FAIMS ‘pluma’ produzido a partir de amostra de urina de um paciente CRC plotados em uma escala log.

A intensidade é em unidades arbitrárias de contagem de iões.

2,3.2 GC -MS.

para a análise GC-MS, alíquotas separadas de 5 ml são colhidas de cada amostra para executar através de um instrumento Bruker Scion SQ GC-MS. Cada alíquota foi agitada e aquecida a 60 ° C durante 5 minutos, antes de o conteúdo da câmara de expansão são extraídos usando um sistema de pré-concentrador automatizado Combi-PAL ITEX. Os voláteis contidos na ITEX foram então libertados por aquecimento a 250 ° C, e injectada no instrumento a uma razão de divisão de 1:20 com gás transportador de hélio. A coluna Restek Rxi-624Sil (20 m de comprimento, 0,18 mm Dl, 1,0 hum DF) montado no GC foi mantida a uma constante de 50 ° C durante 1 minuto antes de ser aumentada até 280 ° C a uma velocidade de 20 ° C /min, separando os VOCs constituintes em termos de peso molecular e polaridade. Após uma detecção inicial para produzir um cromatograma, as moléculas de COV são fragmentados pelo espectrômetro de massa e detectados para produzir espectros de massa correspondente. Estes são correlacionados com os picos GC cromatográficos, e comparados com um Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia biblioteca (NIST 2013) de compostos químicos. Este foi perfrimed a fim de obter esclarecimentos adicionais sobre os grupos químicos específicos que compõem o headspace voláteis das amostras de urina em pacientes com CRC.

2.4 Métodos Estatísticos

A análise dos dados para FAIMS resulta é realizada utilizando Fisher Análise discriminante. Isto permite a simples interpretação de dados complexos ao determinar se as diferenças em grupos pode ser detectada. Os dados foram processados ​​em Matlab (Mathworks Inc., EUA, R2013b). Para a análise, tanto as matrizes contagem de iões positivos e negativos de cada amostra foram concatenados em um único elemento do vetor 52224 (ou matriz 1D). Estes foram, em seguida, transformada wavelet usando uma wavelet daubechies D4, uma técnica habitualmente utilizada na compressão de dados e tem a capacidade de separar os sinais subtis dentro de um conjunto de dados. Os pontos de dados dentro dos 52,224 elementos susceptíveis de discriminação são então identificados. Isto é conseguido através do cálculo do prazo de dispersão de classe (Σσ

i) eo entre dispersão classe [(σ

μ)

2 /(Σσ

i)

2] para cada ponto dentro o vector (assim, os mesmos pontos de dados (ou variável) de todos os conjuntos de dados de amostras são examinadas e a classe de dentro, bem como entre a classe de dispersão calculado em todas as amostras), para gerar mais duas matrizes formadas de novo 1D, de 52,224 pontos de dados. limiares diferentes são então definido para dentro da classe e entre dispersão classe e as variáveis ​​que estão dentro desses limites são então utilizados para o processamento de dados por Fisher análise discriminante (FDA; uma técnica linear pré-classificada). Para testar a validade da FDA, cinco amostras de cada grupo (CRC e controlos) foram removidos antes da FDA foi realizada. Em seguida, com base nos resultados da FDA do remanescente, uma predição é feita sobre o grupo de amostras desconhecidas. Esta previsão é baseada em um (k-vizinho mais próximo) KNN método. Este processo é repetido dez vezes para cada par de valores de limiar, até limites óptimos, e, assim, um conjunto de variáveis, são identificados. Este grupo de variáveis ​​é então utilizado para o restante do processo de análise para o cálculo de sensibilidade e especificidade. Para mais detalhes sobre análises descritas em detalhes, consulte Covington et al [23]

2,5 Ética

Ciência e aprovação ética foi obtida a partir Research Departamento de Desenvolvimento e Comissão 09 /H1211 /38 Ética Warwickshire. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes que participaram do estudo.

Resultados

Os dados demográficos do câncer e grupo não-câncer são descritas na Tabela 1. Nenhuma diferença estatisticamente significativa entre a grupos foi observada no entanto, como esperado, houve predomínio de sexo masculino. Detalhes do tumor encenação para os 83 pacientes de CRC são mostrados na Tabela 2.

A análise dos dados FAIMS para os pacientes e controles CRC foi levada a cabo utilizando análise discriminante de Fisher, como descrito acima, e o resultados das variáveis ​​identificadas são mostrados na Figura 2. a reclassificação para CRC foi correcta em 74% dos casos (p 0,001). A sensibilidade e especificidade da análise FAIMS para detectar CRC foram de 88% e 60%, respectivamente.

urina dos pacientes de CRC também foi analisado por GC-MS, os resultados podem ser encontrados na tabela 3, juntamente com uma lista de produtos químicos correspondentes do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia de banco de dados (NIST). Sem química única foi identificado em pacientes com CRC comparados com os controles.

Discussão

Este estudo é o primeiro a nosso conhecimento para relatar o utilitário analisa FAIMS para detecção CRC na urina e suportes trabalho anterior por outros usando nariz eletrônico [5] e GCMS [16]. Isto foi conseguido por meio da investigação como gases e vapores (COV) que emanam a partir de amostras de urina são diferentes quanto ao aqueles com CRC em comparação com os controlos. Nossos achados também apoiar o trabalho anterior, onde, as diferenças de assinatura de VOC foram observadas em pacientes com CCR dentro de diferentes materiais biológicos (fezes, respiração e urina) [5], [15], [16]. Nossa coorte CRC, houve um predomínio do sexo masculino, como seria de esperar para uma população de pacientes com CCR, enquanto o nosso grupo de controle teve uma predominância do sexo feminino ligeiro. Isto poderia aumentar a possibilidade de viés de sexo dentro da coorte, no entanto, enquanto o padrão de compostos orgânicos voláteis e, por associação, o fermentome, poderia, teoricamente, ser afetada por sexo e idade, os dados de nossos estudos publicados anteriores do IBD, má absorção de ácidos biliares, câncer pélvico e doença celíaca não mostraram qualquer propensão para a idade e sexo que afeta os sinais de COV [23], [24], [25], [26], [27].

de Meij et al mostrou que o e -nose poderia discriminar CRC dos controles saudáveis, com sensibilidade de 85% e 87% de especificidade, e também pode distinguir adenomas avançados de controles saudáveis ​​com 62% de sensibilidade e especificidade de 86% [5]. Nosso estudo mostrou usando amostras de urina em vez de fezes – com FAIMS demonstrando uma sensibilidade de 88% e uma especificidade de 60%. Isso tem importância, especialmente em nossa população local, cuja implantação da triagem é pobre devido à exigência para produzir amostras fecais

mobilidade Ion tem uma série de vantagens em relação a ambos GCMS e nariz eletrônico:., Por exemplo, que está a realizar uma medição física de moléculas, em vez de uma interacção química (tal como o faria um e-nariz tradicional) e em segundo lugar, a sensibilidade é de partes ou seja, muito mais elevadas por bilião até partes por trilião. Isso torna a plataforma ideal para um futuro ferramenta de triagem especialmente porque a sensibilidade é alta. Nossas descobertas expandir em pesquisas anteriores descrevendo como tanto e-nariz e tecnologias FAIMS pode ser usado para distinguir efeitos da radiação em cancros pélvicos [25] e condições inflamatórias, por exemplo, entre a doença de Crohn e colite ulcerativa [26], além de má absorção de ácidos biliares e doença celíaca [23], [27].

marcadores genéticos de fezes ter recebido interesse como um potencial alvo de rastreio não-invasivo para CRC. Lidgard et al [28] realizaram um estudo de análise automatizada de DNA de fezes para a β-actina, mutantes

Kras

, aberrante metilado

BMP3

e

NDRG4

, e hemoglobina fecal. Isto demonstrou uma sensibilidade de 98% e 90% de especificidade e sensibilidade para CRC 57-83% para adenomas avançados dependendo do tamanho. Nosso estudo mostra resultados de sensibilidade comparáveis, mas a um custo muito menor do processo, e com urina em vez de amostragem fecal.

A única impressão digital química ou ‘impressão digital bio-odorante “produzido pelos diferentes estados de doença, e indivíduos saudáveis , mostra o potencial desta tecnologia para rastrear e ajudar, no diagnóstico da CRC. Ele também tem o potencial para ajudar na investigação adicional de indivíduos com outras doenças gastrointestinais. Os gases e vapores são pensados ​​para ser produzido pelo processo de fermentação colónica que envolve uma interacção complexa entre as células colonocyte, flora fecal humana, a integridade da mucosa e patogénios invasores [17], [18]. COV emitidos a partir de fluidos corporais têm, assim, um enorme potencial como biomarcadores putativos para utilização na avaliação de doenças gastrointestinais. Alterações no padrão de VOCs são pensados ​​para refletir as mudanças no ambiente gastrointestinal. Isso sugere um possível papel para disbiose intestinal microflora na fisiopatologia da CRC [29].

Conclusões

Este estudo mostrou que a assinatura VOC presente na urina de pacientes com CRC, pode ser distinguidos dos controles saudáveis, utilizando FAIMS. A sensibilidade e especificidade de FAIMS é de 88% e 60%, respectivamente, para CRC. Ainda que esta seja menor do que o padrão-ouro da colonoscopia é comparável com o teste de fezes fecal atual, incluindo o guaiac e métodos imuno-histoquímica. A captação do Reino Unido para o rastreio é baixa; 62%, 57% e% a absorção de 59 nas primeira, segunda e terceira rodadas do Programa Nacional de Triagem [30], e cerca de 50% atualmente na população local. Uma das razões para isso é a natureza da amostra biológica necessária. Oferecendo uma alternativa e opção menos intrusiva, como urina em vez de fezes, é provável que seja muito mais aceitável para os pacientes, e pode ser incorporado em vias de triagem para o futuro.

Reconhecimentos

gostaria de agradecer WPH, BRET ea confiança Eveson que financiou esta pesquisa.