Abstract

nuclear (AR) e genes andrógeno regulado. Recentemente, relataram que o C-terminal truncado variantes de splicing AR constitutivamente activas contribuir para o desenvolvimento CRPC. Desde anticorpos específicos que detectam todas as variantes AR truncada no terminal C não estão disponíveis, o nosso objectivo foi desenvolver uma abordagem para avaliar a prevalência ea função de variantes AR no câncer de próstata (PCA).

Metodologia /Principais Conclusões

2 Utilizando anticorpos contra diferentes regiões da proteína AR (N- ou C-terminal), que mostrou a existência de sucesso variante AR no xenoenxerto LuCaP 86,2. Para avaliar a prevalência de variantes AR no tecido CaP humana, usamos este método em microarrays de tecido incluindo 50 CaP primário e 162 tecidos CRPC metastático. RT-PCR foi utilizada para confirmar variantes de AR. Observou-se uma diminuição significativa na coloração AR C-terminal nuclear no CRPC, mas nenhuma diferença entre N e coloração nuclear AR C-terminal em CaP primário. A expressão do AR proteínas reguladas PSA e PSMA foram marginalmente afectada pela diminuição na coloração do terminal C em amostras CRPC. Estes dados sugerem que há um aumento da prevalência de AR em variantes CRPC com base na nossa capacidade de diferenciar AR expressão nuclear utilizando N- e anticorpos AR C-terminais. Estes resultados foram validados utilizando RT-PCR. Importante, a perda de imunorreactividade C-terminal e a identificação de variantes de AR eram diferentes dependendo do local de metástases no mesmo paciente.

Conclusões

desenvolvido com sucesso uma nova abordagem que foi imuno-histoquímica usada para determinar a prevalência de AR variantes em um grande número de CaP primário e metastático CRPC. Nossos resultados mostraram um instantâneo de alta frequência global de variantes AR emenda truncada no terminal C e site de perda AR específico em CRPC, o que pode ter utilidade para estratificar pacientes para a terapêutica AR direcionados

Citation:. Zhang X, Morrissey C , Sun S, Ketchandji M, Nelson PS, True LD, et al. (2011) receptor andrógeno variantes ocorrem frequentemente em Castração Resistente Prostate Cancer metástases. PLoS ONE 6 (11): e27970. doi: 10.1371 /journal.pone.0027970

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de junho de 2011; Aceito: 29 de outubro de 2011; Publicação: 17 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa é baseado no trabalho apoiado em parte por uma PO1 National Institutes of Health subvenção (PO1CA085859), a concessão Pacific Northwest do cancro da próstata SPORE (P50CA097186), a Fundação do Câncer de próstata e do Lucas Fundação Richard M.. CM recebeu um prêmio de desenvolvimento de carreira da concessão Pacific Northwest do cancro da próstata SPORE (P50CA097186). Esta pesquisa é o resultado do trabalho apoiado por recursos do Sistema Único de Saúde VA Puget Sound, Seattle, Washington. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro da próstata metastático (PCA) que se repete após a terapia de castração ou da privação do andrógeno (ADT), denominado câncer de próstata resistente à castração (CRPC), prenuncia um mau resultado com alta letalidade. Embora os níveis circulantes de androgénios estão esgotados em CRPC, a progressão do tumor é muitas vezes concomitante com níveis elevados do receptor de androgénio (AR), a activação de AR, e a expressão de genes regulados-AR. No entanto, um aumento na expressão de AR, por si só não é geralmente suficiente para envolver o programa transcricional AR [1]. Vários mecanismos têm sido mostrado para levar a transactivação AR e envolver o seguinte programa de AR castração. Estes incluem a persistência de androgénios intratumorais, síntese de androgénio ectópica pelo tumor, quer a partir de androgénios supra-renais ou intratumoral

de novo

síntese, e aumentada de transporte de androgénio no tumor por proteínas transportadoras orgânicas anião transportadora de soluto [2] – [6] . Várias citoquinas e factores de crescimento vias foram mostrados para ser capaz de ativar o AR através de mecanismos de ligação ou cross-talk directos [7] – [13]. Alterações na AR co-reguladores podem também modular a atividade AR quando os níveis de andrógenos são diminuídas [14] – [18]. Funcionalmente, cada um destes mecanismos que promovem a activação de AR em CRPC requer a região carboxi-terminal da proteína madura que contém o domínio de ligação ao ligando (LBD).

Para além de mecanismos que conduzem à activação de AR em CRPC que requerem ligando, recentes evidências apontam para a existência de formas de splicing alternativo de mRNAs AR que codificam receptores desprovidas da LBD, mas mantendo a capacidade de envolver maquinaria transcricional e promover a regulação do conhecido — e potencialmente nova — conjuntos de alvos de transcrição [19] – [26]. Não são apenas estes AR truncada no terminal C variantes constitutivamente activo, mas a sua estrutura prevê uma resistência geral à terapêutica como antagonistas de AR-que requerem ligação com o LBD para a actividade. Até à data, nós e outros identificaram três variantes AR emenda em amostras de tecidos humanos [22], [25] – [27]. AR-V1 codifica uma variante de splicing composto de exões 1-3 e terminando num exão críptico (EC1), AR-V7 (também chamado AR3) codifica uma proteína com exões 1-3 e um exão críptica terminal (CE3), e AR

v567es codifica uma proteína composta por exões 1-4, e por causa de uma armação de desvio devido à perda de exões 5-7, exões 8 possui um codão de paragem gerado após os primeiros 10 aminoácidos, resultando numa exon8 encurtado. [22], [25] – [27]. variantes de splicing AR adicionais foram detectados em linhas de células humanas de CaP [21], [24], [26] – [28]

Vários estudos que avaliaram a expressão de formas de splicing AR em um pequeno número de cancros da próstata. sugerem que as variantes de AR são detectados mais facilmente em comparação com CRPC cancros hormona-naïve, e pode surgir devido à pressão selectiva de AR terapia-alvo [22], [25], [26]. Um estudo recente usado qRT-PCR para identificar transcritos variantes AR em 40 metástase óssea, dos quais 30 eram da CRPC, e encontraram uma associação entre a expressão de variantes de AR e de sobrevivência [29]. Determinar a prevalência de variantes AR em diferentes estados clínicos de cancro da próstata tem sido desafiada por requisitos para amostras bem preservadas congeladas de tecidos para análises baseadas em transcrição, ea falta de anticorpos capazes de detectar especificamente a maioria das proteínas variantes AR. Para superar esta limitação, procurou-se tirar proveito do facto de novo AR carboxi-terminais codificados por formas de splicing alternativo do ARNm de AR não pode ser reconhecida por anticorpos dirigidos contra a extremidade C-terminal normal do AR de comprimento completo (AR

FL). Colocámos a hipótese de que esta característica de AR variantes proporcionou a oportunidade de identificar variantes da proteína AR em tecidos fixados em formalina e comparando a coloração diferencial de anticorpos que reconhecem quer N- ou C-terminal da AR. Portanto, no presente estudo, utilizou-se anticorpos contra a N- ou C-terminal da proteína AR para interrogar um grande número de tecido da próstata benigna, hormona primária CaP ingénuos e uma série de CRPC metastático para determinar a prevalência de C-terminal variantes AR truncado.

Materiais e Métodos

Reagentes

os anticorpos utilizados neste estudo e as condições de trabalho estão listadas na Tabela 1.

Tissue

principal e tecidos humanos CaP metastático foram obtidos como parte do programa de pesquisa e CaP Donor Universidade de Washington Medical Center Câncer de próstata rápida programa autópsia, que é aprovado pela Universidade de Washington Institutional Review Board. O Conselho de Revisão Institucional do Centro Médico da Universidade de Washington aprovou todos os procedimentos que envolvem seres humanos, e todos os participantes assinaram termo de consentimento informado. microarrays de tecido humano (TMAs) consiste em 42 pacientes do dador do cancro da próstata rápida Programa Autópsia (incluindo 65 metástases de tecido mole e 120 metástases ósseas) [30], 55 pacientes submetidos a prostatectomia radical (incluindo 28 de próstata normal, 24 próstata hiperplásica, e 50 da próstata primário foram utilizados tecidos de câncer). O LuCaP de xenoenxerto de cancro da próstata 86,2 é um adenocarcinoma que não responde à castração e foi derivado a partir de uma metástase CaP bexiga humana. O LuCaP 35 de xenoenxerto de cancro da próstata é um adenocarcinoma que responde à castração e foi derivada de um nódulo linfático CaP metástase. Estes xenoenxertos não conseguem crescer como linhas de células, assim, eles são mantidos por passagem em série em murganhos SCID. O LuCaP 86,2 xenotransplante expressa um conhecido C-terminal variante AR truncada AR

v567es que é constitutivamente ativo. O LuCaP 35 xenotransplante só expressa tipo ampla AR [25]. LuCaP fresca 35 e 86,2 tecidos de xenoenxerto foram usadas para análise de Western. Vinte e dois tecidos metastáticos CRPC de pacientes autópsias rápidas correspondentes aos tecidos na TMA humana tinham sido congelados rapidamente em azoto líquido após a ressecção e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Os dados clínicos referentes aos 42 pacientes de autópsia são apresentados na Tabela 2.

transcrição reversa-PCR (RT-PCR) e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)

tecido total o ARN foi isolado a partir de tecido fresco picada usando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Dois microgramas de RNA total foi digerido com ADNase I, e transcrito de forma inversa utilizando Superscript First-Strand Synthesis System (Invitrogen). A PCR foi realizada utilizando AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems). Os produtos de PCR foram corridos em gel de agarose a 2% e imagem imagens foram tiradas utilizando sistema de imagem Pro AlphaDigiDoc de Alpha Innotech (San Leandro, CA). reações qRT-PCR foram realizadas utilizando um detector Applied Biosystems 7900 sequência com 5 ng de cDNA, 200 nM de cada par de primers e Poder SYBR PCR Verde Mix Master ou TaqMan Mix Master Universal PCR da Applied Biosystems.

A expressão genética foram medidos por quantificação relativa entre as amostras de ARN, e dobre as mudanças de expressão foram determinados pelo método 2-ΔΔCT [31]. Todas as experiências de qRT-PCR foram realizadas em triplicado, e o gene de manutenção RPL13A foi usado como um controle endógeno.

As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela 3.

Cultura celular e estimulação

células VCaP que expressavam tanto variante AR

FL e AR

v567es foram cultivadas a 80% de confluência em placas de 30 mm em meio RPMI 1640 com 5% de soro, e depois passou para o meio RPMI-1640 com 5% de carvão despojado de soro durante 24 h. A di-hidrotestosterona (DHT) 10

-9 M, MDV-3100 50 nM, ou MDV-3100 acrescido de DHT foram adicionados às culturas. Após 24 h, o RNA total foi coletado de poços duplicados para qRT-PCR para detectar AR

FL, AR

v567es e transcrições AR-V7. A experiência foi repetida 6 vezes com triplicados de cada vez, e os resultados qRT-PCR foram normalizados para o grupo de tratamento de DHT.

Western Blotting

O tecido fresco foi homogeneizado e lisadas com tampão de lise frio (50 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM de EGTA, 1% de Triton X-100) contendo Halt ™ inibidores de protease e fosfatase Cocktail Inibidor (Thermoscientific). Completar lisados ​​foram separados em SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de nitrocelulose, bloqueados em 5% de leite-PBS-Tween e sondadas com a respectiva durante a noite a 4 ° C. As membranas foram incubadas com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Cell Signaling), e desenvolvida com ECL (Pharmacia Biotech). As membranas foram retirados durante 30 min em tampão de decapagem (Thermoscientific) e re-sondadas com anticorpo anti-actina β como um controlo de carga (Sigma-Aldrich). experimentos independentes validados que este procedimento de extracção não levar à perda de sinal.

Imunohistoquímica

secções de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina (5m) foram desparafinados e reidratadas. Antigénio de recuperação foi realizado com 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0) numa panela de pressão (20 psi durante 10 min). peróxido endógeno e biotina /avidina foi bloqueada durante 15 minutos com os respectivos agentes (Vector Laboratories). Depois da incubação com soro de cabra-cavalo-galinha normal de 5% à temperatura ambiente durante 1 h, as secções foram incubadas com anticorpos primários (Tabela 1), a 4 ° C durante a noite seguido de anticorpos secundários biotinilados e reagente SabC (Vector Laboratories). DAB (Invitrogen) foi utilizado como o cromogénio, e hematoxilina como contrastante. Mouse ou IgG de coelho, conforme o caso, na mesma concentração que o anticorpo primário foi utilizada como controle negativo e não mostrou coloração inespecífica [32].

imuno-histoquímica avaliação

Alguns núcleos inutilizáveis Não foram encontrados nas TMA devido à falta de núcleo tecido, necrose do cancro, ou células cancerosas insuficientes. Estes núcleos foram excluídos dos resultados.

A imunocoloração foi avaliada utilizando uma pontuação quase contínua AR nuclear, criada pela multiplicação de cada nível de intensidade (0 para nenhuma mancha, 1 para mancha fraca, e 2 para intensa mancha) por a percentagem correspondente de células positivas, e, em seguida, somando os resultados.

Ki-67 coloração foi medida por escolher aleatoriamente até 4 campos de 250 mm

2 em cada local de tecido. número total de células e o número de células positivas de Ki67 foram contados, e o final do Índice Ki-67 foi calculada usando o número de células positivas dividido pelo número total de células.

AR anticorpos utilizados neste estudo alvo três regiões distintas da AR humana proteína. Os imunogénios de F39.4.1 AR (contra aa301-320) e AR441 (contra aa299-315) foram localizado no N-terminal de AR, enquanto AR C-19 (contra aa900-919) no C-terminal. Por isso, nós descrevemos AR F39.4.1 e AR441 como anticorpos de AR N-terminal de AR e C-19 como um anticorpo AR C-terminal. padrões específicos de imunomarcação nuclear AR foram avaliadas como: N + C + (coloração positiva AR semelhante N-terminal e C-terminal no núcleo); N + C ↓ (pontuação AR C-terminal caiu mais do que 50% em relação ao N-terminal no núcleo) e N-C- (N- negativa similar e C-terminal de AR em coloração núcleo). Os tecidos no grupo N ↓ C + não foram incluídos porque eles eram raros, e não em relação às variantes AR truncada no terminal C.

A análise estatística

A análise estatística dos resultados foram realizadas utilizando software Prism (Prism Graphpad), onde foi utilizado o teste de Mann-Whitney, e

p

valoriza ≤0.05 foram escolhidos como estatisticamente significante.

Resultados

formas de splicing alternativo de AR poderia ser identificados utilizando anticorpos N- e C-terminais

Várias variantes de transcritos Ar têm sido descritos que codificam polipéptidos AR desprovido do LBD C-terminal devido a splicing exão alternativo [21], [24] – [28] . No entanto, os anticorpos específicos que não estão disponíveis para detectar todas estas variantes no tecido. Como os anticorpos têm sido desenvolvidos para domínios N-terminais e C-terminais específicas de proteína AR, procurou-se determinar se estes reagentes podem ser utilizados para distinguir diferentes formas CaP expressar AR. Para validar esta abordagem, primeiro avaliado duas linhas CaP xenoenxerto derivados em laboratório de um dos autores (RLV) e conhecidos para expressar diferentes mRNAs codificadores de AR. O LuCaP 86,2 xenoenxerto, derivadas de uma metástase de bexiga humana CaP e mantido por passagem em série em murganhos SCID não castrados, tem sido demonstrado que possuem uma variante truncada AR splicing C-terminal que ignorada exões 5-7 e codifica um quadro de leitura alternativo do exon 8 , designado AR

v567es. O xenoenxerto LuCaP 35 foi derivada de um nódulo linfático CaP metástase e expressa de comprimento completo AR (AR

FL) codificando ARNm incluem 8 exões e uma proteína de tamanho apropriado para este transcrito [25].

Foram analisados ​​derivados de proteínas e 86,2 LuCaP LuCaP 35 xenoenxertos por Western blot utilizando anticorpos que reconhecem N-terminal (AR 441) ou C-terminal (C-19 RA) de AR

FL. No tumor LuCaP 35, ambos os anticorpos de AR detectado um semelhante de 110 kDa AR polipéptido que correspondia ao tamanho de AR

FL. No tumor LuCaP 86,2, ao lado de uma fraco banda de 110 kDa, o anticorpo AR N-terminal identificou também uma isoforma de 80 kDa AR que correspondia ao tamanho previsto do C-terminal de AR truncada splice variante-AR

v567es enquanto o C-terminal anticorpo AR não (Figura 1A).

(a) análise de Western blot de expressão AR em LuCaP 86,2 e LuCaP 35 tumores de xenoenxerto. (B) coloração IHC para a AR N- e C-terminal em LuCaP 86,2 (a e b) e LuCaP 35 (C e D) tumores de xenoenxerto. (C) coloração IHC para a PSA (e), PSMA (f), cromogranina A (g), sinaptofisina (h), Ki67 (i) e controlo negativo (j) em 86,2 LuCaP xenoenxerto. (D) coloração IHC para a PSA (k), PSMA (l), cromogranina A (m), sinaptofisina (N), Ki67 (O) e controlo negativo (p) em 35 LuCaP xenoenxerto. (Original x200 ampliação, insira x400).

semelhante ao resultado de Western blot, análise imuno-histoquímica (IHQ) de LuCaP 86,2 mostraram coloração nuclear muito fraco usando o AR C-terminal (AR c-19) anticorpo, mas intensa coloração nuclear na secção de série com o anticorpo contra a AR N-terminal (F39.4.1 AR). O tumor LuCaP 35, mostrado para expressar única AR

FL por análise de Western, não mostraram qualquer diferença entre N e coloração AR C-terminal por IHC (Figura 1B). Estes dados confirmaram que comparando a AR N-terminal com expressão de RA C-terminal poderia identificar C-terminais truncados variantes Ar /mutações no tecido CaP.

AR

v567es tem sido mostrado para ser constitutivamente activa [25 ], isto é consistente com o facto de que diferentes AR imunorreactividade com anticorpos N- e C-terminal foi observada no núcleo. Para confirmar ainda mais a actividade AR nuclear, nós manchado pela PSA regulada-AR e proteínas de PSMA. LuCaP 86,2 era imunorreactivo tanto para PSA e PSMA. Para confirmar que LuCaP 86,2 não era uma linha neuroendócrino xenoenxerto, que coradas com biomarcadores neuroendócrinos cromogranina A (CHG-A) e sinaptofisina (SYN). LuCaP mostrou 86,2 CHG-A imunorreactividade negativo, e fraca a moderada SYN imunorreactividade como um produto da reacção de finos, granulados que foi predominantemente localizadas no citoplasma periférico de células. Além disso, aproximadamente 20% das células tumorais foram positivas, indicando Ki67 LuCaP 86,2 teve um índice de proliferação moderada (Figura 1C). Correspondentes resultados IHC para LuCaP 35 também são mostrados na Figura 1D.

Variações na expressão AR N-terminal e C-terminal ocorreu raramente em epitélio benigno e primário não tratado CaP

Para determinar a frequência de variantes AR truncada no terminal C no epitélio benigno e não tratada localizada APC, que marcou coloração IHC de espécimes de prostatectomia radical. Todos os 28 espécimes da próstata normais apresentaram expressão concordante N-terminal e C-terminal de AR nuclear (N + C +) (Figura 2A a e b). Entre as amostras de próstata hiperplásicas 24, 21 casos (87,5%) mostraram consistentes N + C + expressão (Figura 2A c e d), apenas 1 (4,2%) tinham diminuído C-terminal de AR coloração (N + C ↓) e 2 (8,3 %) não tem qualquer imunorreactividade AR (NC-). Em 50 amostras primárias APC, 46 casos (92%) expressaram N + C + AR (Figura 2A e-h), 2 casos (4%) tinha diminuído nuclear do C-terminal vs. coloração AR N-terminal (N + C ↓) , enquanto 2 casos (4%) foram negativos AR (NC-). No geral, não houve diferença significativa na proporção de N- vs. C-terminal intensidade de coloração nuclear entre próstata normal e amostras de próstata hiperplásicas (

p

= 0,5756), próstata normal e amostras de CaP (

p

= 0,7428), e próstata hiperplásica e amostras de CaP (

p

= 0,7508) (Figura 2B).

(a) IHC coloração para N- e C-terminal AR em condições normais próstata (NP) (a e b), da próstata hiperplásica (HP) (c e d) e CaP primário (eh) (x200 ampliação). (B) Comparação dos perfis de coloração entre AR da próstata normal, hiperplasia da próstata e CaP primária. (C) Comparação de perfis de coloração AR entre CaP primário e CRPC metastático.

Variações na expressão AR N-terminal e C-terminal ocorreu frequentemente em CRPC

Para determinar a frequência de expressão variante AR em CaP metastático, que marcou coloração IHC de sítios metastáticos de 42 pacientes que morreram de CRPC avançado.

Entre 162 sítios metastáticos, 103 (63,6%) sites, mostraram expressão AR nuclear consistente com ambos os anticorpos (N + C +). No entanto, 39 (24,1%) locais tiveram uma pontuação nuclear C-terminal AR (N + C ↓), que foi, pelo menos, 50% menos do que a pontuação AR N-terminal correspondente, e 20 (12,3%) sítios de metástases não tinha nuclear expressão do AR (NC-) (Figura 2C). Estes resultados IHC estavam de acordo com a frequência de variantes de splicing AR em CaP metastático determinados utilizando métodos de PCR para detectar AR-V7 /AR3 e AR

v567es transcrições [25]. Não houve diferença na coloração de AR N-terminal de CaP entre primário e metastático (

P

= 0,38, dados não mostram), mas a frequência de diminuição da expressão de AR C-terminal nuclear em CRPC metastático foi significativamente mais elevada do que na CaP primário (

p

= 0,0027). A comparação da expressão de AR nuclear entre CaP primário e metastático CRPC é mostrado na Figura 2C.

expressão do gene AR-regulada foi alterada em CRPC metastático com diminuída nuclear C-terminal de AR

Para determinar se a diminuição na expressão de AR nuclear C-terminal foi associada a uma alteração na expressão de proteínas reguladas AR, o que representa uma perda de actividade de AR, examinámos AR proteínas reguladas PSA, expressão de PSMA, e TMPRSS2 em amostras CRPC metastáticas (Figura 3A) . Enquanto apenas faltando significado, a expressão de PSA em locais metastáticos N + C ↓ foi inferior + C + sítios metastáticos N (

p

= 0,0505). expressão do PSA em sítios metastáticos N-C- foi significativamente mais baixo do que ambos os sítios metastáticos N + C + e N + C ↓ (

P

0,001) (Figura 3B). Além disso, a expressão de PSMA em + C + metástases N foi maior do que em N + C metástases ↓ (

P

= 0,0097), mas o PSMA em sítios metastáticos NC- foi significativamente mais baixo do que ambos N e + C + metástases N + C ↓ (

P

0,0001) (Figura 3B). Finalmente, a expressão de TMPRSS2 em N + C + sítios metastáticos era significativamente maior do que os locais metastáticos N + C ↓ (

P

= 0,045). TMPRSS2 em sítios metastáticos N-C- foi significativamente mais baixo do que ambos os sítios metastáticos N + C + e N + C ↓ (

P

0,01) (Figura 3B). A perda de expressão TMPRSS2 em N + C ↓ NC- e metástases não foi tão acentuada como a perda de PSA e PSMA expressão, o que sugere que não TMPRSS2 pode ser regulado pelo AR, ao mesmo nível que o PSA e PSMA no CRPC.

(a) coloração IHC para a AR N-terminal (a) AR, C-terminal (b), PSA (c), PSMA (d), TMPRSS2 (e), AKT-1 (F), Ki -67 (g), controlo negativo (h) em um tecido CRPC metastático (x200 ampliação, inserir X400). (B) PSA, PSMA, TMPRSS2 e AKT-1 perfis de coloração de CRPC.

A seguir, examinou os genes que foram identificados como tendo a sua expressão aumentada em resposta a AR C-terminal variantes truncadas [ ,,,0],26], [29], incluindo AKT1, CDC20, CDK1, C-MYC, CyclinA2, UGT2B17 e UBE2C. Quantitativas resultados de RT-PCR mostrou que AKT1, CDC20, CDK1 e expressão UGT2B17 foram significativamente maiores nos ↓ N + C (n = 11) comparado a N + C As amostras + (n = 7), (P 0,05) (Figura 4A) . UBE2C também tenderam a ser maiores, mas não atingiu significância (p 0,10). Foram detectadas mais de AKT-1 a expressão da proteína por IHQ. No entanto, o número relativamente baixo ciclo indicaram níveis relativamente elevados de expressão do gene em todos os casos. Portanto, quando também coradas TMA para AKT1, sinal relativamente forte estava presente na maioria das amostras tumorais na TMA e tendo em conta as medições semi quantitativas, não foram detectadas diferenças entre os grupos por IHC (Figura 3B). Assim, os cancros com N + C ↓ AR expressaram níveis AKT1 mais elevadas, mas esta diferença não pôde ser detectado no IHC devido à abundante proteína em todos os grupos.

(A) Perfil de sete AR expressão variantes associadas genes em humanos tecidos metastáticos. (B) Os mesmos genes foram medidos em LuCaP 86,2 e LuCaP 35 xenotransplantes. O RPL13A gene housekeeping foi usado como um controle endógeno.

A perda de imunorreactividade nuclear AR C-terminal foi associada com a expressão de variantes AR em metastático

CRPC

Nós determinamos que a perda de imuno AR C-terminal ocorreu frequentemente em CRPC metastático. Esta perda de imunorreactividade do terminal C pode ser devido à expressão de um número de conhecidas (por exemplo, AR-V7 /AR3, ou AR

v567es) e variantes de splicing AR desconhecidos. Para determinar se a imunorreactividade N- e C-terminal foi associada com variantes de transcritos de AR, foi realizada RT-PCR em um subconjunto de tecidos metastáticos CRPC e comparados os resultados de RT-PCR para IHC resultados (Tabela 4). De 4 N + C + metastáticos amostras examinadas por RT-PCR, todos expressos AR

FL (um tinha também expressão limitada de AR-V7). De 8 amostras metastáticos classificadas como N + C ↓ por análise IHC, todos expressaram a AR

FL e 6 (75%) também expressou pelo menos uma variante AR conhecido (AR-V7 /AR3 e /ou AR

v567es ) por RT-PCR. Estas amostras metastáticos N + C ↓ também exibiram níveis menores de PSA e PSMA imunorreactividade. Nenhum dos quatro amostras metastáticos NC- expressou a AR

FL examinada por RT-PCR, embora se mostrou muito baixo nível de AR

v567es expressão.

Estes dados demonstram que a análise IHC utilizando anticorpos que reconhecem AR diferentes regiões da proteína AR distinta foi altamente concordantes com transcritos que codificam AR

FL e variantes de splicing de AR que não possuem os exões C-terminais.

AR ARNm variante foi sensível até à concentração de androgénio in vitro

VCaP células foram cultivadas em soro carvão listrado (CSS), e, em seguida, tratado com di-hidrotestosterona (DHT), MDV-3100 ou MDV-3100 com DHT, separadamente. qRT-PCR mostrou que a RA

ARNm FL foi suprimida por adição de DHT, MDV-3100 e DHT + MDV (Figura 5A). A variante AR

v567es mRNA também foi suprimido por DHT; No entanto, pode ser aumentada por adição de antagonista do receptor de androgénio MDV-3100 sozinho, e suprimiu o nível de DHT CSS quando foi adicionado com MDV-3100 (Figura 5B). AR-V7 ARNm responderam de um modo semelhante como AR

FL (Figura 5C).

(A) AR

FL ARNm foi suprimida por DHT, MDV-3100 e MDV-3100 + DHT mas não ao nível observado por DHT sozinha. (B) AR

v567es ARNm foi suprimida na presença de DHT, ainda mais aumentada por adição de MDV-3100 e suprimido para o nível de DHT CSS quando foi adicionado juntamente com MDV-3100. (C) AR-V7 mRNA respondeu de forma semelhante como AR

FL.

foi observada expressão heterogênea de AR em pacientes individuais

Foram identificados C-terminal AR truncada proteínas em vários sítios metastáticos de cada um dos 42 pacientes CRPC (Figura 6). Dos 42 pacientes, 16 (38%) não tinha nenhuma perda de expressão AR C-terminal, 23 (55%) tiveram pelo menos um local metastático com diminuição nuclear imunorreatividade AR C-terminal, e 6 (14,3%) tiveram pelo menos um site com nenhuma expressão AR. Esses dados destacam a heterogeneidade de expressão AR entre os diferentes sítios metastáticos dentro do mesmo paciente.

Vários sítios metastáticos de 42 pacientes CRPC tinha sido analisada por IHC utilizando 2 AR anticorpos. Os resultados da coloração estão resumidos como a N + C + (azul), N + C ↓ (alaranjado) e N-C- (vermelho). LN nó = linfático; L = vértebra lombar; R. = direita; L. = left; T = vértebra torácica

Além disso, para determinar se o estado AR promovido a taxa de crescimento do tumor, dividimos as amostras metástase óssea CRPC em três grupos:. N + C + (n = 93), N + ↓ C (n = 39), e NC- (n = 18). O Índice de Ki67 para os locais de N + C + foi de 18%. Este não foi significativamente diferente dos locais de N + C ↓ (20,8%) (p = 0,4225), ou os locais NC- (17,8%) (p = 0,95).

Discussão

Traditional conceitos de AR translocação para o núcleo que envolvem ligando de ligação, a dissociação de acompanhantes e a translocação nuclear implica que, sem o ligando de androgénio, AR poderia ser encontrado principalmente no citoplasma e a progressão do tumor CRPC iria ser accionado por outros que não os que envolvem mecanismos AR. No entanto, este não é o caso, exceptuando a maioria dos tumores neuroendócrinos. CRPC possuem normalmente um AR transcricionalmente activo que modula a expressão de RNAs mensageiros regulamentados AR [1], [33]. Além disso, na maioria dos estudos sobre os tecidos CRPC, a AR foi encontrado no núcleo.

Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a localização nuclear AR e alguns ou todos podem ser responsáveis ​​para que visto em CRPC [34], [35]. A maioria dos mecanismos propostos seria capaz de translocar a AR para o núcleo, uma vez que requerem a ligação do ligando ao LBD. Se este era o caso, assumindo que não há diferenças nas estruturas AR, seria de esperar para ver nenhuma diferença na imunocoloração AR com N- ou anticorpos dirigidos C-terminais em CRPC metastático. No entanto, como mostramos neste estudo, há uma diferença significativa entre N- nuclear e anticorpos terminal de AR C- nos tecidos metastáticos. Isto sugere que o mecanismo (s) que os mencionados acima, também podem estar envolvidos durante AR translocação para o núcleo sem o ligando em CRPC.

Embora os anticorpos têm sido desenvolvidos para o AR-V7 /AR3 e AR

variantes v567es emenda, pelo menos 20 variantes AR emendas foram reportados à data. Com anticorpos específicos disponíveis para apenas 2 das variantes, a utilização da coloração com anticorpos específicos em tecidos para detectar variantes de AR truncada induzida por castração C-terminal não é viável [20] – [25]. Aqui, nós desenvolvemos um método novo e rápido imuno-histoquímica que compara N- e C-terminal de AR imunorreactividade, o que pode mostrar com sucesso a frequência global de variantes de splicing AR truncada no terminal C em pacientes.

Os dados aqui relatados correlacionando a expressão da proteína AR por IHC com anticorpos 2 e validação da expressão de variantes de splicing AR por RT-PCR, sugerem fortemente que a variação entre a RA N- e C-terminal resultados de imunorreactividade a partir da expressão de ARNm de AR alternativos. No entanto, explicações alternativas devem ser entretido. Os tumores primários e metástases tecidos moles foram fixados em formalina e embebidos em parafina, enquanto as lesões metastáticas dos ossos foram fixados em formalina e descalcificados com ácido fórmico a 10% antes da inclusão em parafina. Não se observou diferença significativa na coloração de AR em tecido mole contra metástases ósseas (p 0,05, dados não apresentados). Além disso, nós não vimos diferenças com outros anticorpos entre o osso e métodos de preparação de tecidos moles usando os mesmos tecidos e métodos [36], [37]. Portanto, não temos sido capazes de identificar uma razão técnica para as diferenças na coloração.