Abstract

biomarcadores inovadores para diagnóstico de câncer e seleção de terapia para facilitar a detecção precoce e melhorar os resultados de terapia. Foi anteriormente identificado um novo local de fosforilação em serina 506 (PS506) em topoisomerase-I (Topo-I) e demonstraram que é amplamente expresso em linhas celulares derivadas de vários cancros, incluindo o cancro do pulmão, mas é baixa em linhas celulares derivadas a partir de tecidos não-cancerosas. Aqui nós investigamos como a expressão PS506 em amostras de tecido pulmonar correlaciona-se com o seu estado maligno. Descobrimos que a expressão PS506 é significativamente elevada em tumores malignos do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) em relação ao tecido pulmonar adjacente, não-cancerosas e de tumores benignos do pulmão. PS506 expressão era até 6 vezes mais elevada em amostras malignas do que em tecido não maligno emparelhado. Utilizando o painel de linha celular NIH-60 /NCI bem caracterizada, que se correlacionam os níveis de expressão mais elevados de PS506 no pulmão, do ovário, cancro do cólon e células de linhas com o aumento da sensibilidade à camptotecina, um alcalóide de planta que tem como alvo Topo-I. Isto é consistente com nossos estudos anteriores em uma amostra menor de linhas de células e com a nossa constatação de que PS506 aumenta vinculativo topo-I DNA. Dois medicamentos quimioterápicos amplamente utilizado para ovário e cancro do cólon, topotecano e irinotecano, respectivamente, são derivados de camptotecina. Irinotecano também demonstrou eficácia em ensaios clínicos de NSCLC. Os nossos resultados sugerem que a expressão elevada PS506 pode correlacionar com a quimio-sensibilidade clínica destes agentes no ovário, cólon, e NSCLC. PS506 pode, portanto, servir como um biomarcador para o diagnóstico ou terapia selecção

Citation:. Zhao M, Gjerset RA (2015) Topoisomerase-I PS506 como um Dupla Função Cancer Biomarcador. PLoS ONE 10 (8): e0134929. doi: 10.1371 /journal.pone.0134929

editor: Zhiqian Zhang, Pequim Hospital Institute, CHINA

Recebido: 04 de outubro de 2014; Aceito: 15 de julho de 2015; Publicação: 06 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhao, Gjerset. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. RG Biopharma forneceu apoio sob a forma de salários para os autores (RAG, MZ), mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. As funções específicas dos autores são articuladas na seção “autor contribuições”

Conflito de interesses:. MZ e RAG são filiados com RG Biopharma, onde esta pesquisa foi conduzida. Esta filiação empresa não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. RG é inventor na patente US # 8431353 e Patente dos Estados Unidos Provisória aplicação 62054242.

Introdução

Novos biomarcadores moleculares para o câncer, particularmente aqueles relevantes para o mecanismo de câncer ou para a terapia do cancro, poderia aumentar o poder de abordagens diagnósticos atualmente utilizados, reduzir o risco de sobre diagnóstico, facilitar a seleção do tratamento e melhorar significativamente a sobrevivência de câncer. Foi anteriormente identificado um sítio de fosforilação novo em topoisomerase I (topo I) no resíduo serina 506 (PS506) que é altamente expressa em linhas celulares derivadas-cancerosas, mas é baixa à indetectável nas linhas celulares derivadas de tecidos normais, tornando-se um possível candidato como um biomarcador associado com malignidades para diagnóstico [1].

Topo I desempenha um papel essencial no metabolismo de ADN, e é o alvo celular único para irinotecano e topotecano, dois fármacos quimioterapêuticos amplamente utilizados derivado da camptotecina planta alcalóide (CPT) [2, 3]. Ao relaxar supercoils de ADN que se formam durante a replicação do ADN e a transcrição, a topo I alivia a tensão de torção no ADN e permite a progressão da forquilha de replicação e complexo de transcrição, respectivamente [4-6]. Um nível basal da fosforilação, principalmente em resíduos de serina no seu domínio N-terminal distinto do PS506 é necessário para a topo I de ADN de ligação e actividade [7]. O aumento da topo I fosforilação ocorre em muitas linhas celulares de cancro derivadas de e se correlaciona com a expressão de PS506 no domínio do núcleo da proteína [8, 9]. Descobrimos que a expressão PS506 também se correlaciona com o aumento dos níveis de serina-treonina proteína quinase, CK2, e que topo I recombinante pode ser fosforilado na serina 506 por CK2 [1] purificada. CK2, que é constitutivamente expressa em níveis baixos em células normais [10], tende a aumentar no cancro, e os níveis elevados são indicativos de prognóstico pobre [11-15]. Em camundongos, CK2 elevada potencializa vias de sinalização pró-oncogênicos e colabora com oncogenes para promover tumores [16-22], sugerindo que CK2 pode desempenhar um papel fundamental no câncer através da criação de um ambiente propício para novas mudanças oncogênicos. Assim, a expressão aberrante de PS506 pode ser sintomático do ambiente pró-oncogênico criado por CK2 elevada.

A relevância terapêutica de topo I também faz PS506 um biomarcador potencial para a seleção do tratamento. mediada por CK2 S506 fosforilação de topo recombinante fosforilada basal que gera uma topo I com aumento da actividade de ligação do ADN e um aumento da actividade de relaxamento do ADN em plasmídeos super-enrolados [1, 8]. Observou-se que linhas de células que expressam níveis elevados PS506 eram muitas vezes mais sensível para a CPT, consistente com o mecanismo de acção da droga, que utiliza a actividade enzimática da topo I para criar o seu efeito letal [1]. Porque CPT e afins drogas permitir topo DNA nicking I-mediada, mas inibir a topo I-mediada religação DNA, eles causam a vertente quebra de DNA para persistir e, finalmente, para formar uma rotura da dupla cadeia de DNA letal. Este mecanismo é acreditado para contabilizar os efeitos terapêuticos do irinotecano e topotecano [2, 23, 24]. a ligação do DNA melhorada e actividade de relaxamento DNA que observamos com a forma PS506 de topo I pode, portanto, contribuir para respostas clínicas para irinotecano e topotecano, promovendo a formação de DNA quebras de cadeia dupla.

Neste estudo temos explorado a hipótese de que a expressão PS506 é uma característica de malignidade, e que os mais elevados níveis de expressão se correlacionam com as respostas celulares a drogas baseadas-CPT. Para avaliar a relação de PS506 à malignidade examinamos amostras de tecido de tumores pulmonares malignos, emparelhado epitélio pulmonar adjacente não-malignas e tumores benignos do pulmão. Para avaliar a utilidade das PS506 como um indicador da capacidade de resposta a medicamentos à base de CPT, nós examinamos a sua expressão em linhas celulares no painel de linha celular NCI-60 para o qual os perfis de sensibilidade de CPT estavam disponíveis a partir do /Programa de Terapêutica de Desenvolvimento do National Cancer Institute ( NCI /DTP) base de dados. Os resultados indicam uma sobre-expressão altamente selectiva de PS506 em todos os espécimes pulmonares malignas examinados, em comparação com o tecido não maligno adjacente e espécimes de tumor benigno. Em linhas celulares derivadas de pulmão, cólon e cancro do ovário, descobrimos que os níveis mais altos de expressão PS506 se correlacionam com maior sensibilidade CPT.

Materiais e Métodos

Os anticorpos

a IgG de coelho pAb506P foi gerado para um fosfopéptido 21-amino ácido (TVGCCS * LRVEHINLHPELKKC, em que fosfoserina 506 é indicada por *), como previamente descrito [1]. De cabra anti-IgG de topo I, que reconhece a topo I C-terminal, e anticorpo monoclonal de ratinho anti-actina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Monoclonal de rato anti-tubulina foi comprado de Novus Biologicals (Littleton, CO). Os anticorpos secundários foram de cabra anti-coelho-peroxidase de rábano (HRP), anti-ratinho de cabra-HRP, e de burro anti-cabra-HRP (Santa Cruz Biotechnology). Para pós-imunoprecipitação Westerns, o anticorpo primário foi detectada usando Pierce Clean-Blot IP reagente de detecção (Thermo Scientific, Waltham, MA), que reconhece apenas todo, IgG intacta e não os cadeia leve ou pesada subunidades dissociadas.

linha celular

NCI-H358 células de carcinoma de células humanas broncoalveolar não-pequenas (H358), número de catálogo CRL-5907, foram adquiridas em Maio de 2011 a partir da American Type Culture Collection e estavam livres de micoplasma. As células foram cultivadas a 37 ° C em 10% de CO

2 em meio de Eagle modificação de Dulbecco suplementado com 10% de soro de vitelo recém-nascido e aditivos, tal como previamente descrito [8]. Para o tratamento de camptotecina, as células foram incubadas durante 24 horas na presença de 0,1 uM ou uma camptotecina (Sigma, St. Louis, MO), seguida de colheita e análise de Western conforme descrito abaixo.

peletes de células

peletes de células congeladas a partir de painel de linha de 60 células do NCI foram obtidos a partir da Division of Câncer Treatment e repositório Diagnóstico (DCTD) Tumor do National Cancer Institute (NCI), e foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. As linhas de células para as quais foram recebidos pelotas celulares estão listados no (S3 Tabela).

Os espécimes de tecido

Todos os espécimes de tecido utilizados neste estudo foram congelados, anónimo, espécimes de arquivamento público de não- câncer de pequenas células do pulmão com o tecido de controle não-malignas emparelhado, ou amostras de tumores benignos do pulmão. Todos os espécimes foram recebidos da Divisão Oeste da Rede Cooperativa de Tecidos Humanos (CHTN), da Universidade Vanderbilt, Nashville, TN. Nenhuma informação do paciente ou doador privado identificável foi fornecido com as amostras. Uma vez que nenhum dados foram obtidos através de intervenção ou interação com o indivíduo e uma vez que nenhuma informação privada identificável foi fornecido para nós, esta pesquisa não constituía pesquisa seres humanos, conforme definido pelo CFR 46.102f eo OHRP Orientação em Pesquisa Envolvendo Codificado informação confidencial ou espécimes biológicos e foi concedida isenção de análise pelo Instituto Torrey Pines para estudos moleculares IRB.

analisa Ocidental

as pelotas de células (equivalente a ~ 10

7 células /pelota) ou duas quase- confluentes placas de 10 cm de células H358 PBS-lavado (equivalentes a ~ 2 x 10

7 células) foram lisadas pela adição de 350 ul por pelete ou 700 uL por placa de tampão RIPA (Tris 10 mM, pH 8, 0,15 M de NaCl, 0,1% de SDS, 1% de NP40, 1% de desoxicolato) para os quais os inibidores de protease e fosfatase completo (Roche, Nutley, NJ) foram adicionados imediatamente antes da utilização, e processados ​​como anteriormente descrito [8]. amostras de tecido congeladas (peso médio de ~ 0,3-0,5 g) foram homogeneizadas em 3 ml de tampão RIPA em gelo utilizando um moinho de tecido e depois centrifugou-se para remover os detritos. Os lisados ​​celulares e de tecido foram divididos em alíquotas e congeladas a -80 ° C até à sua utilização. Um lisado descongelado de fresco foram utilizados para cada corrida de gel.

Os lisados ​​(70 ug de proteína, excepto quando indicado) foram resolvidas por SDS-PAGE utilizando Critério de 10-20% géis pré-fabricados de Tris-HCl (Bio-Rad Laboratories , Hercules, CA). Uma quantidade equivalente de uma alíquota de recém-descongelado do estoque de referência H358 ligado foi incluídos em cada série como um controle comum. Após electroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF e imunocoradas por incubação com anticorpo primário (1: 500 para tubulina; todos os outros em 1: 100), seguido de anticorpo apropriado conjugado com HRP secundário (1: 1000), e o reagente de Pierce ECL ( Thermo Scientific), seguido pela exposição ao filme. Os filmes foram digitalizados usando um Imager Alpha e bandas foram quantificados utilizando o software que o acompanha. PS506 intensidades de bandas foram normalizados para o controlo H358 referência.

A imunoprecipitação /transferência de Western

As imunoprecipitações foram realizadas essencialmente como descrito [25]. Em resumo, os lisados ​​celulares a partir de células H358 em crescimento exponencial foram preparados em tampão RIPA, como descrito acima. As proteínas celulares (1-2 mg) foram imunoprecipitados por balanço durante a noite com 50 ul de anticorpo de cabra anti-topo I (~ 10 ug). Os imunocomplexos foram recolhidos por adição de 20 ul de proteína AG de agarose seguido de centrifugação. Os complexos imunitários foram dissociados a um pH baixo na ausência de ditiotreitol ou β-mercaptoetanol para evitar a dissociação da IgG. de tampão de amostra de electroforese foi adicionado e as amostras foram submetidas a SDS-PAGE como descrito para Westerns, sem ebulição antes de assegurar ainda que a IgG permaneceu intacta. O ocidental foi processado tal como descrito acima, excepto que limpa-Blot IP Reagente de Detecção (Thermo Scientific) foi utilizado para detectar o anticorpo primário.

análise ELISA

formas de Serina-506 fosforilada e não fosforilada Topo do ácido 21-amino eu péptido descrito acima (ver secção anticorpos) foram sintetizados por Biopeptide Co., Inc., (San Diego, CA). placas Immulon H2B ELISA (Thermo Scientific) foram revestidas durante a noite a 4 ° C com 100 uL de péptidos ressuspensas a 2 ug /ml em tampão de revestimento (50 mM de NaHCO

3, pH 9). As placas foram lavadas com tampão de lavagem (solução salina tamponada com Tris [TBS] pH 7,5, 0,5% de Tween) e bloqueadas com TBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA). As placas foram lavadas uma vez com tampão de lavagem e, em seguida, incubadas durante 1 h com diluies em sie (em duplicado) de pAb506P em TBS /BSA a 1%, lavou-se novamente, e incubados durante 1 h com anticorpo de cabra anti-coelho-HRP. Seguindo um outro passo de lavagem, as placas foram incubadas com substrato de HRP 3,3 ‘, 5,5’-tetrametilbenzidina (1-passo LENTO TMB ELISA, Thermo Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. A absorvância a 450 nm foi lida.

Fosfatase Alcalina tratamento

300 ug de lisado celular preparado em tampão RIPA, na ausência de inibidores de fosfatase, foi tratada durante 1 h a 37 ° C com 300 unidades de vitelo fosfatase alcalina de intestino (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) em tampão ajustado para NaCl 0,1 M, 0,01 M MgCl

2, 0,001 M de DTT, tal como sugerido pelo fabricante. Um ligado controle paralelo preparado na presença de inibidores de fosfatase foi incubado em tampão falta fosfatase alcalina.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad® Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

resultados

Características de pAb506P

O IgG policlonal de coelho, pAb506P, elevado a um peptídeo contendo PS506 única de topo I, tenha sido previamente mostrou reconhecer o topo celular de 90 kDa I em linhas celulares derivadas de cancro assim como a forma contendo PS506 de topo recombinante tratada com CK2 proteína quinase [1]. O antisoro é altamente específico para a forma fosforilada do ptido imunizante, conforme mostrado pelas curvas de titulação comparativos em ensaios ELISA péptido (Fig 1A). Uma espécie pAb506P-reactivo mais proeminentes adicionais que migra a aproximadamente 45 kDa em SDS-PAGE /Westerns também está presente (Fig 1B, pista 1, as setas indicam as posições de 45 kDa e espécies de topo comprimento completo I em lisados ​​de células NSCLC H358). Um topo I espécies de tamanho semelhante foi descrita em células de leucemia Jurkat [26]. O kDa espécies 45 aparece como uma banda menor em blots sondados com um anticorpo de cabra anti-topo I (Fig 1B, pista 2), e pode ser imunoprecipitada a partir de lisados ​​de células H358 com anticorpo de cabra anti-topo I (Figura 1C), indicando que partilha imunorreactividade com de comprimento completo a topo I, mas é susceptível de ser uma espécie menor. A reatividade mais fraca de topo de corpo inteiro I com pAb506P pode indicar que ele não está totalmente fosforilada neste site. pAb506P reactividade é reduzido após o tratamento de lisados ​​de células H358 com fosfatase alcalina, confirmando que representa uma espécie fosforilada (Figura 1D). Ambos de comprimento completo da topo I e os 45 kDa espécies PS506-positivos são selectivamente regulados negativamente após o tratamento com camptotecina (CPT), sob condições em que o controlo da tubulina permanece inalterada, indicando que o topo de comprimento total I e ​​as 45 espécies kDa são reguladas de forma semelhante em resposta a CPT (Figura 1E). Topo I é o único objectivo de CPT, e foi previamente demonstrado ser especificamente regulada negativamente em células tratadas com CPT [27]. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que a espécie kDa 45 é susceptível de ser um produto de degradação fosforilada de topo I. Uma vez que é a espécie primária detectadas em lisados ​​de células, foi avaliada a sua expressão em amostras de tecido.

(A ) curvas comparativas de titulação de pAb506P em placas de ELISA revestidas com um péptido da topo I em torno do local de serina 506, quer na sua forma fosforilada ou não-fosforilado. analisa (B) de Western de lisados ​​de células H358 (100 ug /pista) sondados com pAb506P (pista 1) ou com anticorpo de cabra anti-topo I (pista 2). As setas indicam as posições do 45 kDa espécies e comprimento total topo I. (C) Topo I imunoprecipitação (cabra anti-topo I C-terminal), seguido por pAb506P ocidental de lisados ​​de células H358. Pista representa 200 ug material de partida. (D) Análise de Western de PS506 e actina em lisados ​​de células H358 antes (center c) e depois do tratamento com fosfatase alcalina (AP). (E) análise de Western de PS506 (usando pAb506P), topo I de comprimento completo (utilizando anticorpo de cabra anti-topo I) e tubulina em células H358 antes e após um tratamento de 24 horas das células com CPT 0,1 ou 1 uM.

expressão PS506 no tecido pulmonar maligno, benigno, e normal

pAb506P foi usada para expressão PS506 tela em amostras anónimas de tecido do pulmão de não-pequenas tumores de pulmão de células (carcinomas, adenomas) e não-malignas ( como amostras emparelhadas do mesmo paciente), assim como os tumores benignos do pulmão. As amostras foram obtidas a partir da Divisão Oeste da Rede Cooperativa de Tecidos Humanos (CHTN) e são listados com suas descrições em (S1 Tabela Características de pares de tumor /não-tumorais (fornecidos pelo CHTN);.. S2 Tabela Características de tumores benignos (fornecida pela CHTN)). Os homogenatos de tecido preparadas a partir do tumor emparelhado pulmão de não pequenas células do pulmão e no tecido não maligno, e amostras de tumor de pulmão benignas foram analisadas por SDS-PAGE /Western para detectar a presença de PS506, e os níveis foram quantificadas por análise de intensidades de bandas digitais. Para garantir a normalização em diferentes géis, preparamos um único ligado de células H358, que foi congelado em alíquotas. Uma alíquota descongelada recentemente deste ligado foi incluído em cada gel executado como um padrão de referência.

Figura 2A mostra uma mancha de Western representativa para PS506 /em pares de amostras emparelhadas malignos não-malignas 8-13, em conjunto com o H358 padrão de referência. níveis PS506 relação ao H358 foram igualmente avaliada para todos os 21 pares combinados mais 8 tumores benignos e os resultados foram verificados em um segundo experimento independente. As médias e desvios-padrão para as duas experiências estão listadas na Tabela 1 (pares combinados) e Tabela 2 (tumores benignos) e plotados na figura 2B. Em todos os 21 pares de amostras malignas /não malignas, expressão PS506 foi elevado na amostra malignas. Dezasseis dos 21 (76%) espécimes malignas expresso cerca de 2-6 vezes mais do que os PS506 espécime emparelhados não malignas, com o ser ~ média de 3 vezes superior. Quinze dos 21 (71%) amostras malignas expressa PS506 em níveis acima da média global de 0,39 para todas as amostras (linha vermelha pontilhada na figura 2B). Mais importante, nenhum dos espécimes 8 benignas e apenas 2 das 21 amostras emparelhadas não malignos (para um total de 29/02 [7%]) expressa PS506 acima deste nível médio. Assim, um espécime maligna foi . 10 vezes mais provável do que um espécime não malignas para expressar PS506 em maior do que o nível médio para todos os espécimes

(A) blot Representante PS506 ocidental de espécimes das NSCLC e sua emparelhados espécimes não-malignas (espécime pares 8-13). H358 é o controle de referência para a quantificação de todos os borrões PS506. As Tabelas 1 e 2 listam os espécimes analisados ​​e quantificação dos níveis de PS506 relação ao H358. gráfico (B) de barras dos níveis PS506 mostrados nas Tabelas 1 e 2, agrupados como amostras emparelhadas /malignos não-malignos e tumores benignos. (C) Gráfico de dispersão dos níveis PS506 das Tabelas 1 e 2, agrupados como malignos (M), não-malignas (n), e tumores benignos (B). Os valores de p foram calculados por um teste t não pareado

O gráfico de dispersão na figura 2C mostra níveis PS506 nos três conjuntos de amostras:. A 21 emparelhado maligna (M) e não-malignas (N), os tecidos e os tecidos tumorais benignas 8 (b). Os níveis PS506 médios (indicadas pelas linhas pretas em cada conjunto) são 0,60 (maligno), 0,24 (emparelhado não-malignas) e 0,24 (benigno). As diferenças nos níveis médios PS506 entre conjuntos de amostras foram avaliadas por um teste-t não emparelhado de duas caudas. Tal como indicado na figura 2C, a diferença entre o tecido maligno e tecidos emparelhados não-maligno estava altamente significativa (

P

0,0001), e a diferença entre o tecido maligno e tecido de tumor benigno foi significativa (

P

= 0,0115). Não foi observada diferença significativa entre os níveis PS506 em tecidos benignos e não malignas (

p

= 0,86). Estes resultados indicam que a expressão PS506 está fortemente associada à malignidade.

expressão PS506 e CPT sensibilidade

Em um estudo anterior examinando níveis PS506 em uma variedade de linhas celulares de cancro, descobrimos que a maior PS506 níveis estavam presentes em linhas de células com a maior sensibilidade ao topo I-alvo alcalóide vegetal, CPT, com diferenças de cerca de 2-3 vezes entre linhas de células sensíveis à CPT e resistente [1]. Para estender essas observações, foram avaliados os níveis PS506 relativos entre o painel linha 60-cell do NCI, disponível como pelotas de células congeladas da Divisão de Tratamento do Câncer e Diagnóstico repositório Tumor do NCI. O painel inclui linhas celulares derivadas de uma variedade de tipos de tumores, incluindo leucemia, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro do cólon, melanoma, cancro do ovário, carcinoma renal, cancro da próstata, cancro da mama, e cancros do sistema nervoso central. Uma vez que as linhas de células têm sido extensivamente caracterizados pela NCI para a sensibilidade a CPT e outros fármacos quimioterapêuticos estabelecidos e experimentais, eles fornecem um recurso altamente normalizado com o qual correlacionar um biomarcador potencial com quimiossensibilidade [28].

Os lisados ​​celulares a partir dos sedimentos celulares congelados foram avaliados quanto à expressão PS506 por SDS-PAGE /Western da mesma maneira que as amostras de tecidos. Bandas foram quantificados digitalmente e níveis PS506 em relação ao valor de controle H358 foram verificadas em um segundo experimento independente e média. Para as linhas de células 42 para os quais existem dados de sensibilidade CPT, descobrimos que os níveis PS506 foram distribuídos em uma ampla gama, como foi observado para as amostras de tecido do tumor. O nível médio de PS506 em todas as linhas de células de 42 foi de 0,37 em relação ao controlo comum H358; um valor consideravelmente mais elevado do que o valor médio de 0,24 observada para não-tecidos malignos ou benignos emparelhado tumores (Figura 2). A seguir, os valores comparados PS506 relativas das 42 linhas de células com a sua sensibilidade a CPT usando os valores de% de crescimento NCI /Developmental Therapeutics Program (DTP) estabelecidos com um ensaio de dose única elevada (10 pM) CPT [29]. Neste ensaio, um valor de percentagem de crescimento negativa indica a perda de massa a partir de células devido à morte das células, ao passo que um valor positivo indica a percentagem de crescimento das células não tratadas, conforme descrito no site da DTP [28].

Observamos uma correlação entre a expressão PS506 e sensibilidade CPT num agrupamento de 20 pulmão de não-pequenas células, do cólon, e linhas celulares de cancro do ovário, o que representa três tipos de cancro para os quais são ou aprovado pela FDA terapias à base de CPT (cólon, ovário) ou estão a ser avaliados em ensaios clínicos em curso (cancro do pulmão de células não-pequenas) [30, 31]. A Tabela 3 lista essas linhas celulares, o nível médio PS506 dos dois experimentos (em relação às células H358), e os dados de sensibilidade CPT disponíveis no site do NCI /DTP [28]. Figura 3 mostra um diagrama de dispersão dos valores PS506 relativas para os três subgrupos definidos pela sua sensibilidade CPT: a 8 mais sensível (40%), a 8 mais resistente (40%), e os restantes 4 com sensibilidade intermediária (20%) . O nível PS506 relativa diminuída de acordo com a sensibilidade CPT de 0,39 (mais sensível) para 0,21 (sensibilidade intermediária) a 0,18 (resistente). Um, bicaudal teste t não pareado revelou uma diferença significativa (

p =

0,028) do nível médio PS506 entre a as linhas de células mais resistentes mais sensível e, de acordo com os nossos estudos anteriores com uma amostra menor de linhas de células [1]. Estes dados sugerem que respeita ao pulmão, cólon, e cancros do ovário, da expressão PS506 é um determinante da sensibilidade aos fármacos à base de CPT. Importante, a metade das linhas de células designada como CPT-sensível, mas nenhum deles com sensibilidade CPT intermediário ou CPT-PS506 expressa resistência a um nível superior à média de 0,37 para todas as linhas celulares 42.

Gráfico de dispersão dos relativa níveis PS506 em linhas de células que representam o 40% mais CPT sensível, os 40% mais resistentes CPT, e os 20%, com sensibilidade intermediária entre o conjunto de câncer de ovário, câncer de cólon, e linhas celulares de NSCLC. A linha pontilhada vermelha em 0,37 mostra o nível médio PS506 nas linhas celulares para os quais existem dados de sensibilidade CPT. O valor de p foi calculada por um teste t não pareado

Nós níveis PS506 também comparados com sensibilidade CPT para o maior grupo de 42 linhas de células que representam uma ampla gama de tipos de câncer (veja.: S3 Tabela. níveis de sensibilidade CPT e PS506 em linhas celulares a partir do painel linha 60 celular NCI). Aqui, também, observou-se uma associação positiva entre os níveis de PS506 e sensibilidade CPT, com as linhas de células mais resistentes que expressam níveis PS506 baixas (40% das linhas, o nível médio do PS506 = 0,34) e as linhas de células mais sensíveis que expressam níveis PS506 mais elevadas (40 % das linhas, o nível médio do PS506 = 0,41), de acordo com um modelo no qual PS506 contribui para CPT sensibilidade. Na análise deste grupo maior, as diferenças nos valores médios não atingiu significância estatística, no entanto (

p

= 0,43), possivelmente devido à contribuição de factores celulares independentes de topo I, tais como a absorção de CPT, metabolismo intracelular CPT e de distribuição, e a resposta celular a danos no ADN, todos os quais podem afectar o resultado de tratamentos de CPT [32]. No entanto, os resultados deste rastreio suportam a noção de que pode ser utilizado para selecção níveis PS506 terapia para certos tipos de cancro.

Discussão

Este estudo demonstra que a expressão de PS506 é específico de malignidade, e que os mais elevados níveis de expressão PS506 em linhas celulares de cancro de pulmão, do cólon, do ovário e do cancro origem correlacionam com o aumento da sensibilidade à CPT. PS506 níveis foram elevados em todos os 21 espécimes malignas de cancro do pulmão de células não-pequenas em comparação com o tecido não maligno emparelhado e 8 amostras de tumor de pulmão benignos. Na maioria dos pares de amostras, o aumento da expressão em PS506 maligna contra o tecido não maligno variou de 2 vezes a 6 vezes. Os dois grupos não-malignas de espécimes (21 tecidos não malignos e 8 tecidos tumorais benignas), não foram significativamente diferentes na expressão PS506. Enquanto os níveis absolutos de expressão PS506 em espécimes de tumor maligno foi variável, 71% dos tumores malignos apresentaram níveis PS506 acima da média da população (todas as amostras combinadas, ou seja, maligna + não-maligna), enquanto que apenas 7% das amostras não malignas expressa PS506 acima da média da população.

Quando avaliamos o painel de linha celular NCI-60, também descobrimos que o nível médio de expressão PS506 entre as linhas de células foi maior do que a das amostras de tecido não-malignas (0,37 em linhas de células versus 0,24 em espécimes não malignas). Foi analisada a correlação entre a expressão PS506 com sensibilidade celular ao topo I-alvo CPT de drogas, usando os dados de sensibilidade CPT disponíveis no site do NCI /DTP. No pulmão, cólon, e linhas celulares de cancro do ovário, o que representa três tipos de cancro para os quais as drogas quimioterapêuticos derivados de CPT são aprovados ou estão sob ensaios clínicos, verificou-se que a maioria das linhas de células CPT-sensíveis 40% expressaram níveis significativamente mais elevados de PS506 do que o 40% de linhas de células mais resistentes, de acordo com nossas observações anteriores em uma amostra menor de linhas celulares disponíveis [1]. Níveis intermediários de expressão PS506 foram observados em 20% das linhas celulares com sensibilidade CPT intermediário. Estes resultados sugerem que PS506 pode servir, em combinação com outros fatores clínicos, a fim de facilitar a tomada de decisões para o tratamento de pacientes com as drogas derivadas da CPT, irinotecano e topotecano. A escolha correcta de medicamento é crucial para o sucesso da terapia. Isto é particularmente verdadeiro para terapia de segunda linha, tal como um tratamento não pode resultar numa condição física declínio do paciente e aumenta a probabilidade de que mais tratamentos não será bem sucedida. Existem atualmente não há testes preditivos confiáveis ​​de sensibilidade às drogas CPT-derivados. A aplicação de PS506 como uma ajuda para a seleção terapia constituiria um passo fundamental para alcançar os regimes de tratamento mais individualizadas.

O desenvolvimento de ensaios baseados em derivados de sangue para PS506 poderia fornecer um teste de diagnóstico para a detecção ou monitorização de pulmão precoce câncer ou outros tipos de câncer. Vários marcadores proteicos circulantes estão atualmente em uso clínico para certos tipos de câncer, principalmente para follow-up. Estes incluem CA125 de câncer de ovário, CA19-9 para câncer de pâncreas, CEA para o câncer de cólon, e PSA para câncer de próstata (revisto em [33]). CYFRA21-1, um marcador citoqueratina para as células epiteliais no plasma ou no sangue, tem sido associado com o cancro do pulmão de células não pequenas e outros cancros epiteliais, mas tem uma sensibilidade muito variável ou especificidade para malignidade. Um recente relatório descreve um ensaio ELISA para a timidina-quinase em amostras de sangue para a detecção de câncer de pulmão, [34]. Dado que é uma topo I de 10-25% mais abundante de proteínas celulares em células e no plasma [35], um teste semelhante para PS506 é provável que seja exequível e sensível. No caso de cancro do pulmão, um ensaio baseado em expectoração pode também ser possível, como células cancerosas estão presentes na expectoração de doentes com cancro de pulmão. Vários outros marcadores candidatos foram identificados [36, 37]. No entanto, nenhum biomarcador foi ainda demonstrado que têm a necessária sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade para ser validado para uso clínico de rotina, e biomarcadores adicionais são necessários.

A possibilidade de que PS506 pode ser causalmente associada ao câncer aumenta enormemente sua participação como um biomarcador. Porque topo I possui nicking DNA /atividade religando, a sua regulamentação rigorosa é essencial para evitar nicking DNA aberrante que poderia desestabilizar o genoma e promover a progressão maligna [38]. Ectopicamente sobreexpressa topo I é recombinagênico em leveduras e bactérias e pode, por conseguinte, promover a rearranjos de DNA e de outras formas de instabilidade do genoma nas células de mamíferos bem como [39, 40]. Esta possibilidade é apoiada pela evidência de que topo I é essencial para quebras cromossômicas em locais comuns frágeis (QCA), onde rearranjos de DNA ocorrem geralmente no câncer [41, 42]. Um CFS bem caracterizados, FRA3B, é freqüentemente reorganizados no cancro do pulmão [43].