Abstract
Fundo
receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) activação desempenha um papel no cancro colorectal (CRC) carcinogênese, e as drogas anti-EGFR são utilizados no tratamento da CRC avançado. Um dos ligantes de EGFR é associado a um tumor inibidor trypsinogen TATI, também chamado de inibidor de serina-protease Kazal tipo1 (SPINK 1), que, recentemente, mostrou ser um marcador prognóstico independente em CRC.
Métodos
Nós estudamos o valor prognóstico da expressão imunoistoquímica de EGFR e expressão concomitante de EGFR e TATI /SPINK1 em uma série de 619 pacientes com câncer colorretal.
resultados
das amostras analisadas, 92% foram positivos para EGFR. EGFR + /+ TATI foi observada em 62,8%, EGFR + /TATI- em 29,5%, EGFR /+ TATI em 4,9%, e EGFR /TATI- em 2,7% dos pacientes. expressão de EGFR correlacionada com grau OMS (p = 0,040). Na análise univariada, a expressão de EGFR correlacionada com a sobrevivência favorável (p = 0,006). EGFR pacientes + /TATI + apresentaram melhor sobrevida do que aqueles com outras combinações (p 0,001). Na análise multivariada, EGFR + /TATI + foi um fator prognóstico independente de prognóstico favorável (p 0,001)..
Conclusão
positividade concomitante de EGFR e TATI /SPINK1 prediz prognóstico favorável no CRC
Citation: Koskensalo S, Louhimo J, J Hagström, Lundin M, Stenman UH, Haglund C (2013) Expressão Tumor concomitante de EGFR e TATI /SPINK1 Associates com melhor prognóstico no câncer colorretal. PLoS ONE 8 (10): e76906. doi: 10.1371 /journal.pone.0076906
editor: Ichiro Aoki, da Escola de Medicina da Universidade de Yokohama, Japão
Recebido: 31 de maio de 2013; Aceito: 29 de agosto de 2013; Publicação: 25 de outubro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Koskensalo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por Finska Läkaresällskapet, medicinska Understösföreningen Liv och Hälsa eo Juselius Fundação Sigrid. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é a terceira neoplasia maligna mais comum do mundo [1], [2]. Na Finlândia, a incidência é de 30/100 000 /ano [3]. O fator prognóstico mais importante no CRC é o estágio do tumor.
O prognóstico dos pacientes com CCR local está sendo sobrevivência bom, de 5 anos de 80-90%, para os tumores nó-positivo é de 60-70%, enquanto que para tumores com metástases à distância, é inferior a 10%) [4] – [6]. Pacientes com estadio III-IV (Dukes ‘C e D) A doença costuma receber quimioterapia adjuvante. Na fase II (Dukes B) da doença, a quimioterapia não é utilizada rotineiramente, embora alguns destes pacientes, obviamente, iria beneficiar da terapia adjuvante. Para identificar pacientes com alto risco requer fatores prognósticos adicionais como biomarcadores.
O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), um alvo para o tratamento de câncer colorretal avançado, pertence a uma glicoproteína transmembranar da família de receptores tirosina quinase ErbB. interacção ligando-receptor e a dimerização do receptor leva a auto-fosforilação de tirosina, activando uma via de sinal intracelular que promove a divisão celular e migração, inibição da apoptose, angiogénese e [7]. Os anticorpos monoclonais ligam cetuximab e panitumumab ao EGFR e desabilitar a ativação de vias de sinalização a jusante de tirosina-quinase e.
mutações nos caminhos moleculares activados via EGFR pode contribuir para a carcinogênese. Em CRC, as mutações mais frequentes incidem sobre o gene KRAS ocorre em cerca de 40% dos casos de CRC [8], [9]. As mutações desactivar atividade guanosina trifosfatase (GTPase), levando ao acúmulo de KRAS ativadas. Estas mutações KRAS levar à falta de resposta à terapia anti-EGFR [10], [11].
Junto com EGF, amphiregulin, fator transformador de crescimento (TGF) α, epirregulina, betacelulina, EGF de ligação à heparina, e activar epigénio EGFR [12]. Recentemente em adenocarcinomas do pâncreas, inibidor de serina-protease do tipo 1 Kazal (SPINK 1), também chamado de inibidor de tripsina pancreática secretória (PSTI) e tripsinogénio inibidor associado a um tumor (TATI), foi mostrado activar a EGFR [13]. TATI /SPINK1 é expressa em conjunto com o EGFR em adenocarcinomas pancreáticos. EGF e TATI /SPINK1 partilham cerca de 50% de homologia de aminoácidos [14], e a afinidade de ligação de TATI /SPINK1 ao EGFR é cerca de metade do que de EGF [13].
Demonstrámos recentemente que o tecido expressão de TATI /SPINK1 é um indicador de prognóstico favorável em pacientes com câncer colorretal [15]. No presente estudo avaliou-se a relação entre EGFR e expressão TATI e seu possível valor prognóstico no câncer colorretal.
Pacientes
Os dados clínicos Materiais e Métodos
estavam disponíveis desde 643 pacientes submetidos a cirurgia para confirmação histológica de câncer colorretal no Departamento de cirurgia do Hospital Meilahti, Helsinki University Central Hospital, entre 1982 e 1998. os dados clínicos completos e amostras de tecido de arquivamento foram disponível a partir de 623 casos, 333 deles do sexo masculino. A idade média foi de 65,9 anos (variando 22,7-90,3) e tempo médio de follow-up 4,81 anos (intervalo 0-25,8). Sobrevivência e causa da morte de dados até Março de 2011 foram obtidos a partir de Registo da População Centro da Finlândia, e Statistics Finland. Diagnóstico e estadiamento foram realizados de acordo com a classificação do Dukes modificado “[16]. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética local e está em conformidade com a Declaração de Helsinki (Dnro HUS 226 /E6 /06) e da autoridade nacional de controlo para o Bem Estar e Saúde. características clinicopatológicas dos pacientes estão descritas na Tabela 1.
As amostras de tecido e preparação de blocos TMA
e amostras de tecidos cirúrgicos embebidos em parafina foram recolhidos dos arquivos do Departamento fixo com formalina de Patologia da Universidade de Helsinki. Histopatologicamente regiões representativas das amostras de tumor foram definidos e marcado em H E desliza. Três núcleos de cada bloco de tumor foram amostrados com 1,0 mm perfuradores por utilização de um microarrayer tecido semi-automático (Tissue Arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, EUA). Três blocos de série paralelas foram construídos, todos incluindo uma amostra de cada paciente. A partir de cada bloco, 4 mm de espessura foram cortadas para imuno-histoquímica.
Imunohistoquímica
O Laboratório de Visão Autostainer TM 480 (LabVision, Fremont, CA, EUA) foi utilizado para a imunocoloração. As secções de tecido foram desparafinados em xileno e reidratadas através de uma série álcool graduado. Para recuperar antigénios, as amostras foram aquecidas no módulo de pré-tratamento do Autostainer em TRIS-EDTA pH 9,0 pré-aquecido durante 20 min a 98 ° C. As amostras foram incubadas durante 5 min em DAKO real de solução bloqueadora-peroxidase (DAKO, Glostrup, Dinamarca) para a inactivação de peroxidases endógenas. As secções foram incubadas durante 60 min com anticorpo NCL-EGFR monoclonal primário (o clone 113) contra o domínio extracelular, que cora tanto membrana e citoplasma (Novo Castra, Newcastle, UK, diluição 1:10). Os cortes foram feitos reagir durante 30 min com ligação HRP durante 30 min e com a enzima HRP (polímero marcado anti-ratinho-anti-coelho) (Dako, Carpinteria, CA, EUA). Entre cada um dos passos, as secções foram lavadas com Tween 20 PBS (tampão de cloreto de sódio tamponada com fosfato, pH 9,0). Em seguida, as amostras foram incubadas durante 10 minutos no Sistema de DAB + EnVision (Dako, Glostrup, Dinamarca), e corados com hematoxilina durante 1 minuto. Finalmente, as amostras foram lavadas em água corrente. A imunocoloração de TATI foi realizada como descrito (Koskensalo 2011).
Scoring
EGFR imunopositividade citoplasmática em células tumorais foi pontuado por dois investigadores independentes (J. H. S. K. e) sem o conhecimento do resultado clínico. imunopositividade EGFR citoplasmática foi avaliada pela percentagem de células coradas positivamente. A positividade em mais de 50% das células foi classificada como 3, 10-50%, como 2, e menos de 10% como um (Figura 1). Ausência de positividade foi pontuado como 0. manchas de tecidos sem células tumorais foram excluídos. A pontuação mais alta foi utilizado para cada paciente. Para a análise estatística, os pacientes foram divididos em dois grupos:. EGFR (pontuação 0) e EGFR + (escores 1-3)
A. EGFR positivo, B. EGFR negativo, C. TATI /SPINK1 positivo, D. TATI /SPINK1 imunoexpressão negativo
TATI /SPINK1 imunoexpressão de pontuação foi análogo ao do EGFR (Koskensalo 2011).; Para a análise estatística, os pacientes foram divididos em dois grupos:. TATI- (pontuação 0) e TATI + (escores 1-3)
A análise estatística
Foram analisados separadamente EGFR coloração sozinho e em conjunto com TATI /SPINK1 coloração (EGFR +/-, +/- TATI ou EGFR-TATI +/-). A associação entre a imunoexpressão e variáveis clinicopatológicas foi avaliada pelo χ
2 ou teste exato de Fisher, em caso de baixas frequências esperadas. A sobrevivência foi analisada pelo método de Kaplan-Meier. Estatisticamente co-variáveis significativas na análise univariada foram analisados em análise de sobrevivência multivariada pelo modelo de riscos proporcionais de Cox. Um p 0,05 foi considerado significativo. As análises estatísticas foram realizadas com o IBM SPSS Statistics 20.0 software.
Resultados
imunocoloração para EGFR
avaliação fiável da imunocoloração foi possível em 520 dos 623 amostras. No 69 (13,3%), imunopositividade EGFR citoplasmática foi pontuado como alta (3), em 172 (33,1%) como moderado (2), e, 236 (45,4%) como fraco (1), enquanto que 43 (8,3%) mostrou não imunopositividade EGFR (Fig. 1). Nós avaliada somente coloração citoplasmática, porque se cytoplasma é positivo, a coloração da membrana é inadequado para avaliação confiável
EGFR imuno associado com o grau do tumor.; positividade foi detectada mais frequentemente em alta e moderadamente diferenciado do que em tumores indiferenciados (p = 0,040). expressão de EGFR não mostrou associação com Dukes, mas positividade foi mais frequentemente presente no local (Dukes ‘A-B) do que em tumores metastáticos (Dukes’ C-D) (94,4% versus 88,8%, p = 0,021) (Tabela 1 ).
imunocoloração simultânea para EGFR e TATI /SPINK1
Avaliação da imuno tanto para EGFR e TATI /SPINK1 foi possível em 511 dos 623 amostras. A combinação EGFR + /TATI + estava presente em 321 (62,8%), EGFR + /TATI- em 151 (29,5%), o EGFR-TATI + em 25 (4,9%), e EGFR /TATI- em 14 (2,7%) doentes.
EGFR + /TATI + correlacionada com a histologia ocorrendo com mais frequência em adenocarcinomas do que em outros tipos de tumor histológico (p = 0,005), e variaram de grau que, sendo na maioria das vezes presente em tumores altamente e moderadamente diferenciados (p 0,001) ( tabela 2)
valor prognóstico do EGFR
Na análise univariada, EGFR imunoexpressão (p = 0,006), a idade do paciente (p = 0,009), grau OMS (p . 0.001) e estágio Dukes ‘(p 0,001) associado com o prognóstico. sobrevida de cinco anos foi de 59,9% no EGFR + pacientes e 40,5% no EGFR-pacientes (Tabela 3)
Na análise de sobrevida multivariada, EGFR (p = 0,023), idade (p . 0.001 ), estádio Dukes ‘(p 0,001), localização do tumor (p = 0,001), e a OMS grau (p = 0,033) foram fatores independentes de prognóstico (Tabela 4)
papel prognóstico da combinação. de EGFR e TATI /SPINK1
expressão concomitante de EGFR e TATI /SPINK1 correlacionada com o prognóstico, sobrevida de 5 anos sendo 65,0% em pacientes EGFR + /TATI +, 47,7% no EGFR + /TATI-, 43,2% no EGFR /TATI +, e 42,4% em pacientes TATI- /EGFR-(p 0,001) (Tabela 4, Figura 2). Alta idade (p = 0,009), avançado estágio de Dukes ‘(p 0,001) e avançados que grau (p 0,001). Correlacionadas com prognóstico ruim (Tabela 5)
Em multivariada análise de sobrevivência, expressão EGFR /TATI (p 0,001), idade (p 0,001), estádio Dukes ‘(p 0,001), e localização (p = 0,003) foram fatores prognósticos independentes (Tabela 6)
Discussão
recentemente, mostrou que TATI é um fator independente de prognóstico no câncer colorretal, expressão tecidual alta sendo associado com prognóstico favorável. Aqui nós mostramos que imunoexpressão concomitante de EGFR e TATI é um fator prognóstico independente para a sobrevivência favorável no cancro colorectal, e é um fator prognóstico mais forte do EGFR ou TATI /SPINK1 sozinho.
Em concordância com os achados anteriores, superexpressão observado EGFR em amostras de cancro colo-rectal, [17], [18]. EGFR imunoexpressão significativamente correlacionada com o grau do tumor, sendo mais frequentemente positiva em tumores altos e moderadamente diferenciados, conforme relatado anteriormente [19]. Por outro lado, a expressão de EGFR também tem sido demonstrado que se correlacionam com a diferenciação pobre [18]. Como em outros estudos, encontramos correlação com histologia [20], [21], mas nenhuma correlação entre a imunoexpressão do EGFR e do estádio Dukes ‘. Isto está em concordância com o estudo de Giralt [20], enquanto Spano et al. relatado mais forte sobre-expressão do EGFR no T3 do que no T4 tumores colorretais [17]. Deng et al. encontrado, em 94 pacientes com câncer colorretal, uma associação entre alta expressão e estágio tumoral elevada [22].
Aqui nós mostramos que o EGFR imunoexpressão é um marcador independente de prognóstico favorável em pacientes com câncer colorretal. Nossos resultados diferem dos outros “; expressão de EGFR não se correlacionam com a sobrevivência em um estudo de 249 [19] e 132 pacientes CRC [17] ou em 87 pacientes Dukes ‘C CRC, [6]. No entanto, em alguns estudos específicos de cancro do cólon, expressão EGFR correlacionada com mau prognóstico. Num estudo de 149 pacientes, a expressão do EGFR era um marcador independente de prognóstico adverso, mas a expressão do EGFR foi observada em apenas 35,6% das amostras, o que é menos do que normalmente relatada [23]. Resnick et al. também mostrou uma associação entre a expressão de EGFR forte e mau prognóstico no câncer de cólon [24]. Em uma sub-análise incluindo apenas o câncer de cólon, nosso estudo mostrou uma associação entre a expressão de EGFR e sobrevivência melhorada, mas a diferença não foi significativa (dados não mostrados).
Em uma análise de subgrupo de câncer retal, encontramos significativamente melhor as taxas de sobrevivência (p = 0,001) em pacientes com positividade EGFR (dados não mostrados). Em 87 pacientes com câncer retal que tinham recebido radioterapia pré-operatória, Giralt et al relataram expressão do EGFR no pré-tratamento biopsies- mas não em Amostras- cirúrgica para associar com prognóstico adverso [20]. Em um estudo realizado por Fernebro et al. em 269 pacientes com câncer retal, nenhuma associação foi observada com sobrevida livre de metástases [25]. Em um estudo com 40 pacientes com câncer retal, Yasuda et al. encontrado diminuição dos níveis de EGFR após radioquimioterapia, mas a expressão do EGFR não era um marcador de prognóstico [26]. A radioterapia pode tanto reduzir e aumentar a expressão de EGFR [27], [20]. Nós não analisar a expressão de EGFR em biópsias de pré-tratamento, mas não houve diferença na expressão de EGFR surgiu entre pacientes com câncer retal receber ou não a radioterapia pré-operatória (dados não mostrados).
tratamentos direcionados-EGFR foram utilizados para metástase cancros colorectais, mas o valor de imunoexpressão EGFR para prever a eficácia de tratamento adjuvante é controversa. Curiosamente, o antagonista de EGFR cetuximab provou ser eficaz, mesmo contra tumores EGFR-negativos [28]. Uma explicação para isto pode ser que o tratamento anti-EGFR é dirigido contra tumores metastáticos, e correlação entre Imunoexpressão EGFR em tumor primário e lesão metastática é pouco claro e varia entre os estudos [19], [29], [22]. Além disso, os tumores EGFR-positivo nem sempre respondem ao tratamento com cetuximab [30]. Além disso, os tumores com mutações KRAS foram encontrados para respondem fracamente a terapia anti-EGFR [10], [11], e a análise mutacional do KRAS é recomendado para todos os CRCs metastáticos [31]. mutações KRAS no códon 12 correlaciona-se com prognóstico adverso [31], [32]. BRAF é o segundo passo da via EGFR mediada. Mutante BRAF correlaciona-se com prognóstico adverso [33], mas os pacientes com a mutação BRAF podem beneficiar de tratamentos direcionados-EGFR [31]. Um novo método que parece ser superior à análise de mutações KRAS para selecionar pacientes para a terapia anti-EGFR é combinado análise de mutações KRAS e número de cópias do gene EGFR [34].
O PIK3CA (fosfatidilinositol-4, 5-bisfosfonato 3-quinase, gene polipeptídeo catalítica subunidade alfa) via é outro caminho a jusante da sinalização de EGFR. Mutações do gene PIK3CA pode promover a transformação maligna [35]. Uso de blocos de aspirina a via PIK3CA, e se correlaciona com melhor prognóstico entre os pacientes com um gene mutado [36]. Infelizmente, os dados sobre o uso de aspirina não estava disponível em nossos registros de pacientes.
Ozaki et al. mostrou que o EGFR e TATI /SPINK1 são co-expressos em cancro pancreático e que SPINK1 estimula a proliferação de células de cancro do pâncreas, através da activação do EGFR [13]. Aqui nós mostramos que, em cerca de dois em cada três amostras de carcinoma colorretal EGFR e TATI /SPINK1 são co-expressas. Temos demonstrado anteriormente que a expressão tecido alta TATI /SPINK1 se correlaciona com melhor prognóstico em CRC; aqui vamos mostrar que a expressão concomitante de EGFR e TATI /SPINK1 é uma ainda melhor marcador para a melhora da sobrevida. Sabe-se que existem laços de realimentação positivos e negativos dentro de vias mediadas por EGFR, dependendo do tipo de célula, e uma razão para melhor prognóstico no cancro colorrectal pode ser que a ligação de TATI conduz à inibição da cascata que conduzem à transformação maligna. Além disso, a ligação a EGFR TATI pode inibir a ligação de ligandos de activação mais fortes.
Por conseguinte, é plausível que TATI /SPINK1 e a interacção entre TATI /SPINK1 e EGFR desempenham diferentes papéis na CRC do que em cancer.Interestingly pancreático, expressão de TATI /SPINK1 no tecido de câncer também está associada com bom prognóstico no câncer gástrico [37] e perda de expressão TATI /SPINK1 se correlaciona com doença agressiva no cancro da bexiga [38]. Isso indica que TATI /SPINK1 exerce funções diferentes em diferentes patologias. TATI /SPINK1 é não apenas um activador de EGFR, mas também é um inibidor da tripsina e tripsina eficaz é expresso por diversos tumores [38]. Assim, não é surpreendente se ele também exerce funções diferentes em diferentes tumores. Até agora, não EGFR imuno-histoquímica é uma ferramenta para a previsão de quais os pacientes que são susceptíveis de beneficiar de tratamento adjuvante alvo EGFR. Seria interessante estudar se a adição de análise de tecido TATI /SPINK1 mais KRAS mutação e análise de EGFR avaliação do número de cópias do gene poderia melhorar ainda mais os resultados promissores de Algars et al. [34].
Em conclusão, com o melhor de nosso conhecimento, nós mostramos pela primeira vez que imunoexpressão concomitante de EGFR e TATI /SPINK1 é um marcador prognóstico independente para prognóstico favorável em pacientes com câncer colorretal. A combinação é uma ferramenta de prognóstico mais forte do que qualquer TATI /ou EGFR SPINK1 sozinho. Mais estudos são necessários para entender melhor a associação entre TATI /SPINK1 e EGFR no cancro colorectal e para avaliar o potencial uso desta combinação marcador para prever a resposta ao tratamento.
Reconhecimentos
Agradecemos Päivi Peltokangas , Tuire Koski e Elina Aspiala para excelente assistência técnica.