Abstract

A maioria dos ensaios de eficácia analgésica pré-clínicos ainda envolvem testes nociceptiva em roedores. Isto é, apesar das preocupações quanto à relevância desses testes para avaliar as propriedades de dor-de prevenção de drogas. métodos mais adequados teria como alvo a dor em vez de nocicepção, mas estes não estão disponíveis, por isso, não se sabe se a dor dos animais equivale ao estado negativamente afetiva e subjetiva /emocional que provoca nos seres humanos. modelos de câncer do mouse são comuns, apesar de a probabilidade de dor substancial. Nós usamos testes Condicionada Lugar Preferência (CPP), a avaliação da hiperalgesia térmica e comportamento para determinar a probabilidade de que os impactos MBT-2 cancro da bexiga negativamente no bem-estar do rato, tais como, causando dor. Não houve CPP a solução salina, mas a preferência morfina em ratinhos portadores de tumor excedeu que visto em controlos livres de tumor. Isso ocorreu até 10 dias antes do ponto-final do estudo juntamente com redução do peso corporal, o desenvolvimento de hiperalgesia e mudanças de comportamento. Estes efeitos ratos indicados experimentou um estado de bem-estar negativo causado pela

mal-estar

(se não a dor) antes de eutanásia. Devido à complexidade das avaliações necessárias para demonstrar este, é pouco provável que esta abordagem pode ser utilizada para a avaliação de rotina bem-estar em uma base estudo-a-estudo. No entanto, nossos resultados mostram ratos em suficientemente estudos semelhantes são susceptíveis de beneficiar da avaliação da gravidade mais intensiva e reavaliação dos pontos finais com vista à implementação de melhorias adequadas. Neste caso particular, um refinamento teria sido ter ratos sacrificados pelo menos 7 dias antes, ou eventualmente por prestação de alívio da dor em fase terminal. CPP teste verificou-se ser um método útil para investigar as respostas de ratinhos aos analgésicos, possivelmente, a um nível subjectiva. Estas conclusões e as de outros estudos recentes mostram que poderia ser um valioso método de triagem analgésicos candidatos para a eficácia contra a dor do câncer e possivelmente outros modelos de dor ou doença

Citation:. Roughan JV, Coulter CA, Flecknell PA, Thomas HD, Sufka KJ (2014) O teste de preferência local condicionado para a Avaliação Consequências de Bem-Estar e refinamentos potenciais em um modelo de cancro da bexiga do rato. PLoS ONE 9 (8): e103362. doi: 10.1371 /journal.pone.0103362

editor: Bradley Taylor, da Universidade de Kentucky Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Setembro, 2013; Aceito: 30 de junho de 2014; Publicação: 06 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Roughan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi financiado pelo Centro Nacional do Reino Unido para os 3Rs (NC3Rs): https://www.nc3rs.org.uk/, Grant Número G0900763, PI: JV Roughan. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Uma série de testes nociceptivos são utilizados para determinar a eficácia potencial de novos analgésicos, e ratos e ratinhos de laboratório são predominantemente os indivíduos de teste mais utilizado. Estes testes são tipicamente classificados de acordo com a duração e a intensidade do estímulo doloroso e da natureza da resposta. ensaios agudos ou fásicas nociceptivas que se aplicam calor ou estimulação mecânica (por exemplo, o movimento da cauda e testes Hargreaves; von Frey, respectivamente), devido à natureza em grande parte reflexiva das respostas obtidas, são considerados menos adequados do que os testes tónicas ou sub-crónica ( por exemplo, formalina ou carragenina) que provocam inflamação significativa e persistente [1]. No entanto, as insuficiências de ambos são bem conhecidos [2]. Apesar do desenvolvimento de simulações animais de síndromes de dor persistente (por exemplo artrite ou dor neuropática), as preocupações prevalecem quanto à sua relevância clínica. Estes, em última instância resultar de uma contínua falta de compreensão de como a dor dos animais equivale à experiência humana; sendo um fenômeno multidimensional, incluindo ambas as mudanças de estado emocional sensoriais e afetivos (mudanças coletivamente denominados ‘qualidade de vida’). Teoricamente, pelo menos, a dor dos animais e ensaios de analgésicos que informam sobre as mudanças nesses estados devem permitir uma maior validade translacional. Esta necessidade tem impulsionado as chamadas recentes para o desenvolvimento de mais clinicamente relevante

in-vivo

modelos [3], [4] que fornecem uma abordagem baseada em sistemas mais [5]. Esse raciocínio explica porque afetiva avaliação do estado (subjetiva) é cada vez mais considerada como uma abordagem mais relevantes para determinar as consequências de bem-estar de modelos onde os animais possam estar expostas à dor [6] – [8]. modelos de cancro são uma área de pesquisa onde consideravelmente mais conhecimento sobre como extensivamente os impactos dor no bem-estar pode ser muito atrasada.

A grande e cada vez maior número de animais (principalmente ratos) são usados ​​em testes de câncer (471.000 no Reino Unido em 2012, um aumento de 16% em relação ao ano anterior [9]), com apenas um conhecimento mínimo sobre os impactos potencialmente negativos sobre o bem-estar. No entanto, as orientações que são destinadas a minimizar o sofrimento nesses estudos [10], [11] não incorporam qualquer avaliação de mudanças no estado subjetivo subjacente, e obtenção de provas da dor do câncer em roedores tem dependia fortemente de avaliar as alterações nociceptivas subjacentes [12 ] – [15], e parece que este ainda é o caso hoje em dia [16] – [19]. O nosso grupo extensivamente avaliada alterações no comportamento naturalista como um meio de avaliar a dor pós-operatória em roedores e outras espécies utilizando ambos os manuais [20] – [26] e métodos automatizados [27] – [30], ou utilizada uma combinação de ambos tipos de análise [31]. No entanto, a análise de tal comportamento raramente tem sido utilizado para avaliar os efeitos do câncer, e aqueles poucos estudos que Citam ‘comportamento de dor’ realmente significa comportamentos nociceptivos ou nocifensive (ou seja, de retirada ou de guarda) em vez de comportamento verdadeira espontânea (por exemplo, home-gaiola) ( ver, por exemplo [14], [32]). Qualquer que seja o método de coleta de dados é usada, estabelecendo ligações entre resultado e causalidade em estudos comportamentais é difícil porque muitos fatores podem contribuir para as mudanças observadas. Mudanças podem ocorrer como um resultado indireto de influências processuais (por exemplo, anestesia, hipotermia, desidratação) ou fatores ligados a estes, como medo e ansiedade associada. No entanto, determinar se e quando a dor surge em estudos sobre câncer teria consequências significativas. Em primeiro lugar, iria encorajar uma abordagem mais rigorosa para tomada de decisão ética, permitindo aos investigadores para aplicar mais eficaz análises custo-benefício para determinar se end-points são justificados. Melhorar os padrões de bem-estar desta maneira, seria também benéfica para estudos porque a dor unalleviated poderá também comprometer a validade do modelo. A preveno da dor tem sido mostrado para ser benéfico para a validade em pelo menos um ensaio cancro [33] e, possivelmente, outras

in vivo

aplicações de pesquisa [34]. dor do câncer é também uma área onde os avanços em tratamentos humanos são urgentemente necessárias. A dor é a consequência mais comum e temido de câncer e entre 30-60% dos pacientes oncológicos continuam a relatar dor antes, durante e após o tratamento [35]. Na verdade, parece que o panorama continua desolador, apesar de 40 anos de tentativas para resolver o problema [36]. Claramente, o manejo da dor do câncer precisa ser refinado, e os modelos de cancro em animais fornecem uma plataforma ideal para o progresso paralelo na promoção do bem-estar e de descoberta de drogas. Apesar disso, modelos de cancro geralmente não são utilizados para rastrear potenciais analgésicos, com excepções só raras [13], [37]. Isso pode ser porque a maioria dos estudos de câncer têm objectivos alternativos, mas também pode ser devido a uma falta de métodos de avaliação adequados; isto é, aqueles que acomodar aspectos subjetivos.

condicionado Lugar Preferência (CPP) de teste é amplamente utilizado para avaliar as propriedades psicoativas (afetivos) de drogas em animais [38], mas geralmente para identificar risco de abuso por seres humanos. Os animais são condicionados por estar confinado em um ‘lugar’ e emparelhamento que com o tratamento medicamentoso, enquanto que em outro lugar que eles são dadas apenas um placebo. Como os “lugares” têm sinais distintos (geralmente em cor ou textura) animais associar progressivamente as drogas ‘afetar com o lugar onde eles experimentaram. Se esta é uma experiência gratificante, quer devido a positiva ou negativamente reforço efeitos (analgésico) das drogas, animais costumam passar mais tempo dentro, ou visitar o local combinado de drogas com mais freqüência. Prestação de analgesia é uma experiência positiva em humanos dolorosos, portanto, se o mesmo se aplica aos animais, em seguida, estudos CPP tem potencial para avaliar as propriedades aversivas de dor e os efeitos analgésicos de drogas. A abordagem tem sido cada vez mais aplicados à pesquisa em dor após a primeira demonstração de que a artrite causas CPP melhorados para a morfina e do antagonista de N-metil-D-aspartato MK-801 [39]. posteriormente foi demonstrado que a bradicinina B antagonista

1 receptor tem potencial terapêutico contra a dor inflamatória crónica [40]. Um tempo considerável depois, King et al. mostrou CPP também é um método eficaz para avaliar analgésicos contra a dor neuropática [41]. Qu et al. ilustrado a relevância do CPP para avaliar aspectos subjetivos de dor neuropática em ratos, mostrando que o rostral do córtex cingulado anterior é essencial para mediar a dor afeta [42]. Rutten et ai. também foram capazes de utilizar CPP dissociar entre as consequências positiva e negativamente gratificantes de analgésicos com opiáceos-como afeta em comparação com outros mecanismos em um modelo inflamatório rato (carragenina) [43]. Davoody et ai. em seguida, mostraram um aumento da CPP para clonidina (um agonista α-2) em ratos por meio de lesão da medula espinal como um modelo de dor central [44]. Okun et ai. utilizada uma abordagem semelhante para mostrar CPP para vários fármacos diferentes num modelo osteoartrítico [45], e mais recentemente, Park et ai. ausência mostrou de reforço positivo (recompensa) à gabapentina em ratos normais, mas CPP em um modelo de dor polyneuropathic causada por antineoplásico (cisplatina) de tratamento [46]. Colectivamente, estes resultados demonstram claramente que o paradigma CPP é capaz de fornecer animais com um meio para informar sobre a sua percepção da dor, e assim poderia oferecer um método mais adequado de avaliar sua centralizado (afetivo /subjetivo), em oposição a nociceptiva (efetivos) propriedades.

a noção de que a dor pode ser tão complexo em animais (pelo menos em mamíferos), como é em seres humanos é sublinhada pelo fato de que nenhum critério de medição única pode (até agora) efetivamente avaliá-lo. Bateson et ai. originalmente aplicado a várias medidas de abordar a resolução de problemas científicos (mais tarde chamado de “triangulação”) [47], citando que, embora “as provas obtidas por diferentes abordagens era ambígua”, “quando todo o corpo de evidências foi considerado, muito maior confiança poderia ser colocado um significado especial “. Ao abordar o problema do sofrimento animal, e aceitar que “não podemos observar diretamente os sentimentos da Animals ‘”, Bateson recomendou que “devemos usar uma variedade de tarefas para ganhar confiança nas conclusões” [48]. Assim, os estudos estão agora a aplicar cada vez mais várias medidas diferentes em uma tentativa de caracterizar a dor de forma mais confiável [49], [50]. Neste estudo, adoptou uma abordagem comparável ao avaliar um parâmetro bem-estar padrão (de peso corporal) ao lado de testes de hipersensibilidade periférica, monitorando o comportamento exploratório espontânea e realização de testes de CPP. Apesar de várias limitações, hiperalgesia (hipersensibilidade) testes ainda fornece um indicador valioso secundária de dor de várias modalidades diferentes, incluindo o cancro [12], [16], [19]. mudanças de comportamento também são uma resposta comum a dor, mas a coleta de dados e análises são muitas vezes demorado, especialmente se aplicado em estudos que geralmente duram várias semanas; como é geralmente o caso em estudos sobre câncer. A interpretação desses dados pode também ser problemática porque, como já foi descrito, há sempre explicações alternativas para quaisquer alterações comportamentais que são detectados. Uma possibilidade frequentemente citado é que os sinais de incapacidade em roedores pode ser escondida como uma resposta adaptativa para reduzir a probabilidade de predação; apesar de nosso conhecimento, este nunca foi demonstrado de forma inequívoca. Para superar, pelo menos em parte, a limitação vez que usamos um software automatizado de registro de comportamento (HomeCageScan; inteligente Systems Inc., VA, EUA (HCS)). Este reconhece um intervalo ( 20) comportamentos de ratos com uma precisão comparável à análise manual por um observador treinado [27], [28]. Neste estudo contrastado conclusões sobre a hiperalgesia e mudanças de comportamento com os resultados dos testes CPP para avaliar as consequências do cancro da bexiga no bem-estar de ratos; aplicação do conceito de triangulação. Até onde sabemos, nenhuma tentativa anterior foi feita para avaliar a abordagem CPP como descrito aqui durante o desenvolvimento do tumor; com ciclos de acondicionamento e de ensaio consecutivos. Procurou-se também avaliar (pelo menos hipoteticamente) se esta poderia ser uma abordagem útil para a triagem de drogas candidatas para o tratamento da dor do câncer em seres humanos. Encontrámos ratinhos tumorais ganharam menos peso, desenvolveu a hiperalgesia e mostrou alterações de comportamento que foram ligadas tempo para a morfina reforçada busca em ratinhos portadores de tumor nos 7 dias anteriores a eutanásia. Concluiu-se que a explicação mais provável para estas mudanças foi a dor. Se não devido à dor, no mínimo, os resultados indicaram impactos negativos no bem-estar, incluindo possivelmente o

mal-estar

. Normalmente ratinhos só seria removido a partir de estudos Após este tempo, indicando uma necessidade provável de ponto final de refinamento neste modelo de ratinho de cancro da bexiga. O nosso método de aplicação de testes CPP também poderia ser um método potencialmente útil de testar a eficácia de analgésicos destinados para o câncer e outras condições, especialmente

Métodos

Declaração de Ética aqueles onde a dor pode aumentar ao longo do tempo.

Todo o trabalho foi realizado de acordo com os Animais (procedimentos científicos) Act 1986 e foi objecto de revisão ética local. Os experimentos também aderiu às orientações do Comité de Investigação e Questões Éticas da Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Home Office do Reino Unido (Project licença PPL 60/4431).

Sujeitos e Pecuária

Todos os ratinhos foram fêmea C3H /galinha, pesava 25 a 30 g na entrega (Charles river Laboratories Inc., UK) e tiveram acesso livre a uma dieta peletizada comercial (R . M no.3 SDS LTD, Whitham, UK) e água da torneira em grupos de 10 para uma semana de aclimatação. Em seguida, foram alojados individualmente (Macrolon 2 gaiolas; North Kent, plásticos, Reino Unido) para mais uma semana antes da inscrição. Serragem e aparas de madeira foram usados ​​como roupa de cama e gaiolas foram suplementadas com ‘Nest Sizzle “, uma mastigação-block Aspen e um tubo de papelão (B K Universal). A temperatura ambiente foi mantida a 21 ± 1 ° C, com 15-20 mudanças de ar por hora sob um ciclo de luz de 12 horas (luzes apagadas às 19:00 h). Todos os testes foram realizados dez horas – três horas

Recolha de Dados

Os resultados de 3 estudos com grupos separados de ratos são descritos.; (1) Hargreaves (teste nociceptivo) estudo, (2) Estudo do comportamento e (3) ensaios condicionado lugar preferência (CPP), que consiste de um piloto dose que varia de inquérito e, em seguida, um estudo principal. Os dados obtidos em estudos 1 e 2 eram de ensaios exploratórios realizados por colegas do Instituto Norte para Pesquisa do Câncer (NICR) usando células singeneicas MBT-2 (mouse bexiga tumor) derivados de C3H /ave ratos /J (células doadas pelo Prof. Michael O’Donnell (University of Iowa, Iowa City, IA, EUA) e Dr. William A. Larchian (EMH /Cleveland Clinic Centro de próstata, Cleveland, OH, EUA)). Os dados de CPP foram obtidos a partir de ratinhos especificamente obtidos para o teste. objetivos do nosso colega foram; inicialmente para caracterizar o perfil de crescimento de tumores de bexiga implantados ortotopicamente (Estudo 1) e, em seguida, para refinar a metodologia implante (Estudo 2). No entanto, ambos os estudos foram uma oportunidade para recolher dados suplementares sobre os efeitos patológicos (possivelmente incluindo a dor) que poderiam ajudar na concepção do principal estudo (CPP); reduzindo assim o uso de animais para um nível tão baixo quanto possível.

Estudo Hargreaves

Este foi um estudo piloto realizado para estabelecer as características de crescimento de células ortotopicamente implantados MBT-2 que informam sobre a eventual desenho do estudo CPP. tamanhos de grupo foram determinadas por colegas NICR base em suas necessidades de estudo. Os murganhos foram distribuídos aleatoriamente em três grupos de cinco que se submeteram a laparotomia para implante ortotópico de 100 ul de fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS), ou o mesmo volume de DPBS contendo 2 × 10

4 ou 2 × 10

5 MBT células -2. Um quarto grupo de 5 ratinhos foram anestesia únicos controlos. Oito ratos submetidos a cirurgia foram escolhidos aleatoriamente para receber 5 mg /kg de meloxicam (por via subcutânea; s /c) para aliviar a dor pós-cirúrgica [27], enquanto que o restante recebeu solução salina (0,3 mls s /c; n = 7). A anestesia foi induzida com 5% de isoflurano em oxigénio (5 l /min.) Numa câmara perspex. Ratos em seguida, colocar em decúbito dorsal sobre uma manta de aquecimento para manter a temperatura corporal entre 34,5 e 37,5 ° C e anestesia foi mantida com 1,5-2% isoflurano em oxigênio (500 ml /min.). Profundidade foi monitorada pela observação taxas respiratórias e regularmente avaliar os reflexos toe-pitada. Simples pomada (Pliva Pharma Ltd., Reino Unido) foi utilizada para evitar a secagem da córnea. A cirurgia foi uma incisão na linha média, 0,5 cm de pele e os músculos da bexiga que se sobrepõem. Uma vez exposto, 0,1 ml de soro fisiológico ou a suspensão de células de tumor apropriado foi injectado por via intramuscular na parede da bexiga utilizando uma seringa de insulina. Os músculos abdominais e pele foram fechados separadamente usando 5/0 de poliglactina 910 ( ‘Vicryl’, Ethicon Ltd, Edinburgh, UK) e cola de tecido ( ‘Nexaband’, laboratórios Abbott, Chicago). Anestesia durou aproximadamente 10 minutos

latências de retirada térmicas foram obtidos na linha de base, e após 1 hora e 1 dia (24 horas) após a cirurgia, e em seguida em dias.; 3, 7, 10, 14, 17, 21 e 24, utilizando o teste plantar (Modelo 37370; Ugo Basile, Itália) de acordo com o método de Hargreaves [51]. Os animais foram colocados em câmaras de acrílico transparente sobre um chão de vidro, e habituados durante 10 minutos. Uma fonte de calor infra-vermelho foi alternadamente aplicada à área mid-plantar de cada pata traseira (70% da capacidade máxima de aquecimento; equivalente a 253 ± 7 mW /cm

2; 30 segundo corte-off). Isto proporcionou uma gama adequada de latências de resposta em ratinhos normais (~between 3 e 8 segundos). Três respostas foram obtidas de cada pata traseira com um intervalo mínimo de 1 minuto entre as gravações ipsilaterais. Os dados só foram obtidos a partir dos ratos de controle anestesia até o dia 3, quando eles eram obrigados outro lugar. Os pesos corporais foram registados diariamente até ao dia 4, e em seguida, em dias de teste nociceptivo. Como tumores eram interna, fase de crescimento foi estimada por palpação diária por um técnico experiente, que classificados tumores em uma escala de 3 pontos; a partir de 1 (mal presente) a 3 (óbvio sem manipulação). Estas inspecções também incluiu um registro das atividades associadas com a dor abdominal em roedores [21], [31] e outros sinais de problemas de saúde, tais como hematúria, letargia, desidratação e má casaco e condição corporal.

Estudo de Comportamento

Os dados comportamentais foram coletados como parte de um estudo de follow-up (novamente sem o uso de animais adicional) para avaliar um método potencialmente mais refinado (não cirúrgico) do implante de células [52]. Nossos colegas procuraram determinar se o enxerto do tumor poderia ser melhorado com este método, enquanto que queríamos avaliar os efeitos a longo prazo de crescimento do câncer no comportamento. Como antes, foram pré-determinados tamanhos de grupo; 20 ratos foram alocados para o grupo DPBS e 20 ao grupo tumor. A anestesia foi induzida conforme descrito anteriormente, mas em lotes de 5 ratos usando uma máscara aberta sistema de fornecimento de gás feito por encomenda. O procedimento de implante já foi descrito, mas por pouco tempo, a bexiga de cada ratinho foi acedida através de uma cânula de calibre 27 colocada pediátrica na uretra. A urina foi anulada através de pressão suave supra-púbica e aspiração, e a mucosa da bexiga condicionado com uma lavagem com ácido suave (50 uL de HCl 0,1 M) durante 20 segundos. Isto também foi aspirado e, depois, neutralizada com 50 ul de 0,1 M de KOH, e três lavagens com DPBS. A bexiga foi esvaziada antes instilando 50 ul de 5 × 10

6 MBT-2 células ou o mesmo volume de DPBS através de uma seringa ligada à cauda. A concentração de células maior era em antecipação de uma fração de células desconhecido a ser anulado na urina após a recuperação. As células foram deixadas

in situ

durante 30 minutos, após o que os ratinhos foram colocados numa incubadora a 37 ° C durante 20 minutos. o desenvolvimento do tumor foi monitorizado diariamente como antes e os pesos corporais também foram registados diariamente. Os ratos foram filmados individualmente durante 10 minutos utilizando uma câmara de vídeo (Sony DCR-HC96, Sony, Japão) posicionada sobre um tripé 30 cm a partir da frente da 1284’cages Clear “(35 × 20 × 14 cm; TECHNIPLAST, UK Ltd) contendo apenas roupas de cama (serragem Aspen). O procedimento de coleta de dados comportamento foi como descrito anteriormente [28], exceto que ele era em dias alternados antes da detecção do tumor e, em seguida diárias. As filmagens foi sempre durante a fase de luz, mas a hora do dia cada rato foi filmado foi aleatória dentro dos grupos de tumores e de controlo.

condicionado Estudos Lugar preferência

O trabalho CPP foi realizado em 2 etapas. O primeiro foi um estudo piloto para explorar o desenvolvimento da CPP à morfina sob ciclos de condicionamento e testes repetitivos, e para identificar uma dose de morfina para o estudo principal CPP. A dose escolhido seria aquele que suportado apenas preferência lugar modesto, mas manteve propriedades analgésicas suficiente para provocar o reforço negativo em ratos portadores de tumor. Números foram determinados utilizando uma análise de potência retrospectiva dos resultados morfina CPP anteriores através de uma gama de taxas de dose em ratos normais (1 e 5 mg /kg s /c) [53] que também deve provocar efeito analgésico significativo, [54], [55] . As dimensões das amostras de 8 ou 10 foram encontrados retrospectivamente para atingir 79% ou 91% de potência para detectar significativa CPP a um fármaco (3 ou 5 mg /kg de morfina) versus compartimento emparelhado com placebo. O aparelho CPP consistiu em preto (haste de aço com piso) e (com piso de grade de aço) compartimentos brancos separados por um (piso sólido) cinza começar câmara. Nós usado 4 unidades idênticas de testes (Med Associates, St Albans, VT, EUA; Modelo CPP-3013AT) equipados com portas de guilhotina controlados automaticamente e luzes. Compartimentos alojados matrizes de infra-vermelhos para gravar automaticamente os tempos de residência do compartimento e movimentos dentro e entre os 3 compartimentos. Um ensaio inicial foi usada para determinar a preferência do compartimento de linha de base de cada animal. Para isso, eles foram colocados na central (cinza) começar a câmara durante 1 minuto antes de ligar as luzes e abrir as portas de guilhotina. testes de preferência foi sempre realizada dez horas – duas horas. O tempo em relação a explorar os compartimentos preto e branco sobre um posterior julgamento 15 minutos foi calculada como uma proporção do tempo total de teste (ver seção de análise de dados CPP). Os ratos foram designados para o condicionamento no compartimento em que eles gastaram proporcionalmente a menor quantidade de tempo (ou seja, a sua câmara não preferenciais) S + (solução salina ou morfina), mas não ratos mostraram preferências compartimento iniciais proporcionais superior a 0,6 (CPP detalhes seção de análise a preferência método de cálculo). O projeto foi então contrabalançada tal que a preferência do grupo inicial relativa aproximação, tanto quanto possível para 0,5 (ou seja, números iguais foram atribuídas por grupo para o preto (B) ou W) S branco (+ câmaras). Nesta base oito ratos foram atribuídos a cada um de 2 grupos de morfina que abrangem a gama de taxas de probabilidade analgésica eficaz ou uma dose (5 mg /kg s /c) e um grupo representativo de 4 ratinhos foram controlos de solução salina. Uma vez que atingiu a fase de testes de câncer sabíamos que a abordagem tradicional CPP de ensaios condicionado repetitivas seguido por um único teste de preferência não seria apropriado. Isso porque, se a dor ocorreu; nós também quis capturar o seu aparecimento. Informado por isso, todos os testes de CPP (incluindo no estudo piloto) consistiu de blocos repetitivos de 3 dias, com cada bloco compreendendo 2 dias de condicionamento antes de um teste de preferência livre de drogas cada dia subsequente (mostrado na Figura 1). Para o estudo piloto os 4 controles receberam apenas solução salina (0,03 ml s /c) tanto no âmbito do S- e S + condições. Por causa da possível morfina “carry-over” para tarde S + ensaios, era necessário que o veículo (S-) injeções foram sempre dadas de manhã e S + (morfina ou soro fisiológico) à tarde. A morfina foi obtida como uma solução de sulfato de morfina (30 mg /ml, material de NHS, Reino Unido) e foi apropriadamente diluído com água para injecção (WFI) a ser administrado por via subcutânea num volume de 0,03 ml. Todas as injeções foram dadas imediatamente antes da colocação no alocado B ou compartimento W por um período de condicionamento 45 minutos com a guilhotina portas fechadas. Os ratos foram devolvidos às suas casas-gaiolas imediatamente após cada sessão condicionado. Quatro testes de preferência consecutivos foram realizadas para o estudo-piloto (4 blocos de teste; Figura 1). Precisamente seguindo o método utilizado para determinar a preferência do compartimento inicial

blocos sucessivos foram cada um dos dois dias de condicionamento onde os ratos foram submetidos a manhã S- (solução salina) e, em seguida, tratamentos tarde S + (morfina ou solução salina) e foram confinados durante 45 minutos na câmara de preto ou branco. O terceiro dia de cada bloco era uma droga livre teste de preferência, eo ciclo de três dias foi repetido até a eutanásia.

A principal investigação CPP começou com uma repetição do teste de preferência inicial. Cada rato foi atribuído um B ou W para o compartimento posterior S- /S + condicionado do modo anteriormente descrito (equilíbrio números inicialmente preferindo o compartimento B ou W entre os grupos de controlo e de tumor). Como antes, os murganhos foram designados para o seu compartimento inicialmente não preferido, tanto quanto possível. os ratinhos foram novamente tumor implantado através da uretra com 50 ul DPBS contendo 5 × 10

6 células MBT-2. Trinta ratos foram ortotopicamente implantados com células tumorais e dez eram controles salinos. Estes números foram informados por nossas descobertas anteriores sobre o número de falhas de enxerto após o implante uretral. Nós planejado para equilibrar o design (e ainda mais o uso de animais conserve) através da atribuição de quaisquer falhas para controlar os grupos, mas apenas se não havia sinais palpáveis ​​ou outros do desenvolvimento do tumor após 21 dias. ausência tumor foi também confirmada

post-mortem.

Uma vez que as inspecções clínicas confirmou o crescimento do tumor, cada rato começou CPP condicionado e uma testemunha não-tumor combinado entraram no estudo simultaneamente. A série de três dias de sessões de condicionamento e de teste, em seguida, continuou até os ratos foram sacrificados (ver secção sobre a determinação de ponto final). Os grupos experimentais, portanto, formou um (Drug) × 2 (Tratamento) Projeto 2 factorial que combinava condicionado à morfina ou 0,9% de solução salina em ratos tumorais ou não-tumorais. Nós selecionamos uma dose intermediária de morfina (2 mg /kg s /c) para o estudo principal com base nas conclusões do estudo-piloto. Nos testes de preferência principais estudo CPP foram também 45 em vez de 15 minutos, mas a metodologia foi idêntico ao utilizado no estudo piloto. Devido a limitações de tempo e o confundem potencial de deposição em outros ambientes não familiares (efetivamente outros “lugares”), avaliações do comportamento e hiperalgesia não foram realizados como o estudo CPP progrediu. No entanto, o efeito de tratamento analgésico de fase tardia do comportamento foi avaliado como um potencial opção refinamento. Isto significava que sobre a eutanásia dias os ratos foram filmados por 20 minutos antes de e após a injecção da dose condicionado de morfina (2 mg /kg s /c) e gravações idênticos foram feitos a partir de um número igual de controlos no último dia do estudo.

ponto final determinação

inspecções clínicas foram realizadas em todos os estudos para determinar se os ratos portadores de tumor necessários para ser retirada. Estes foram, de acordo com as diretrizes publicadas [10], [11] e com o conselho de pessoal altamente experiente cuidados com os animais. A eutanásia era inevitável uma vez que os animais tiveram um grande tumor palpável ou mais de 15% de perda de peso corporal, e se qualquer um destes coincidiu com hematúria significativa (indicado pela pele manchada de sangue e /ou roupa de cama). Todos os ratinhos, incluindo os controlos foram submetidos a palpação. Eles foram contidos na maneira que é usual para uma injecção intraperitoneal. A região da bexiga foi então suavemente palpados entre o polegar eo indicador, mas com pressão suficiente para determinar a primeira hora do início do desenvolvimento do tumor de forma tão confiável quanto possível.

Análise de Dados

Estudo de Hargreaves.

Como latências de resposta foram inicialmente semelhantes entre a esquerda e traseiras-patas direitas, todos os valores foram calculados para calcular a latência de resposta média geral em cada tempo de gravação. Os dados reunidos os requisitos para análise paramétrica de modo foram examinadas utilizando medidas repetidas ANOVA com ‘Time’ (10 níveis) e ‘Grupo’ (4 níveis, 2 × tumor; 1 × placebo e apenas anestesia) como dentro e entre-sujeitos fatores de, respectivamente, .

post-hoc

níveis de tempo e comparações entre os grupos foram feitas e de probabilidade individuais ajustados em conformidade (

Bonferroni

). As alterações de peso corporal também foram calculados como a mudança da linha de base e os mesmos métodos estatísticos aplicados. Para uma maior clareza, as alterações de peso são representadas como valores absolutos em cada ponto de tempo. Devido à ausência de dados nociceptivos nos ratos de controlo não-cirurgia após o dia 3 e peso corporal de dados após o dia 4 todas as análises a seguir nestes tempos incluídos apenas os grupos de cirurgia. Por fim, os efeitos do meloxicam pré-cirurgia foram examinados, comparando as latências de resposta de linha de base para o ponto de tempo de 1 hora no ANOVA; mas com “pré-tratamento” (meloxicam ou solução salina) como um entre o fator de sujeitos (n = 7 (Saline) versus n = 8 (meloxicam)).

Estudo do comportamento.

O comportamento dados foram processados ​​usando HCS automatizados de software de análise. As medidas utilizadas foram as classes totais distância percorrida e cinco de comportamento que compreendem diferentes elementos dos 20 comportamentos individuais do sistema reconhecidos. Estes foram: 1) Cria (compreendendo “Rear Up ‘(tanto parcial e total extensão bípede) a atividade recíproca” Come Down’); 2) comportamento ativo (incluindo caminhar, correr, saltar e escalada); 3) Abdominal Grooming, e 5) Descanso (períodos inactivos). Nós resumiu as ocorrências de comportamentos dentro de cada classe como a magnitude relativa dos elementos de classe era suficientemente uniforme. por exemplo.