Abstract

O câncer de próstata é um câncer muito comum entre os homens. Os tratamentos tradicionais para câncer de próstata têm eficácia limitada; portanto, novas estratégias terapêuticas e /ou novas drogas adjuvantes devem ser exploradas. levedura de arroz vermelho (RYR) é um tempero tradicional comida feita na Ásia através da fermentação de arroz branco com

Monascus purpureus

Fui levedura. evidências acumuladas indicam que RYR tem actividade antitumoral. Neste estudo, as células PC-3 (células de cancro da próstata humano) foram utilizados para investigar os efeitos anti-cancro da radiação (IV) combinado com monascuspiloin (MP, um pigmento amarelo isolado a partir de

Monascus pilosus M93

ionizante – arroz fermentado) e para determinar os mecanismos subjacentes a esses efeitos

in vitro

e

in vivo

. Descobrimos que IR combinado com MP mostraram aumento da eficácia terapêutica, quando comparado com um ou outro tratamento sozinho em células PC-3. Além disso, o tratamento combinado melhorado danos no ADN e no retículo endoplasmático (ER) estresse. O tratamento combinado induzida principalmente autofagia em células PC-3, e a morte de células que foi induzida pelo tratamento combinado era principalmente o resultado da inibição das /mTOR vias de sinalização de Akt. Em um

in vivo

estudo, o tratamento combinado apresentaram maiores efeitos de crescimento anti-tumorais. Estas novas descobertas sugerem que o tratamento combinado pode ser uma estratégia terapêutica potencial para o cancro da próstata

citação:. Chiu H-W, Fang W-H, Chen Y-G, Wu H-D, Yuan G-F, Ho S-Y, et ai. (2012) Monascuspiloin Aumenta a sensibilidade à radiação de células cancerosas humanas da próstata, estimulando Retículo endoplasmático estresse e induzindo autofagia. PLoS ONE 7 (7): e40462. doi: 10.1371 /journal.pone.0040462

editor: Kevin Camphausen, NIH, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Abril, 2012; Aceito: 18 de maio de 2012; Publicação: 03 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Chiu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Indústria Alimentar eo apoio financeiro (101-EC-17-a-01-04-0525) do Ministério dos Assuntos Económicos, o Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC 100-2314-B- 006 -055), o Christian Hospital Sinlau, Tainan, Taiwan, Food and Drug Administration, Departamento, Executive Yuan (DOH101-FDA-41301) e apontar para o Projeto Universidade Top. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

levedura de arroz vermelho (RYR), também conhecido como Koji vermelho ou “Hongqu”, compreende arroz principalmente nonglutinous, levedura vermelha e subprodutos da fermentação. RYR é um tempero tradicional comida que é consumida em toda a Ásia [1]. É produzido pela fermentação do fungo comida, um

Monascus

espécies, com arroz cozido no vapor e tem sido usado por mais de 600 anos para produzir vinhos e outros produtos alimentares fermentados. Várias espécies do fungo

Monascus

têm sido amplamente utilizados no fabrico de vinho tinto e queijo de soja vermelho [2].

Monascus

produtos -fermented têm muitos metabólitos secundários funcionais, incluindo monacolin K, citrinina, ankaflavin e monascin. Em vários estudos recentes, estes metabolitos secundários têm mostrado anti-inflamatória, anti-oxidante, e actividades antitumorais [3], [4]. Muitos estudos também investigaram a capacidade anti-cancro de RYR, tal como no cólon, da mama, do pulmão, e cancro da próstata [3]. As classes de estruturas de policétido que resultam do processo de fermentação são chamados monacolins, e a maior monacolina encontrados em RYR é monacolina K [5]. No entanto, RYR mostrou uma inibição mais potente do crescimento de células de cancro, quando comparado com a monacolina K [6], [7]. No entanto, os outros policetídeos em RYR pode proporcionar uma abordagem botânico a terapia do cancro que é digno de uma investigação mais aprofundada.

O câncer de próstata é a malignidade mais comum do mundo e a segunda principal causa de morte por cancro [8]. cancro da próstata na fase inicial é andrógeno-dependente e pode ser tratada de forma eficaz com a terapia de ablação de androgénio, radiação e /ou cirurgia. No entanto, células cancerosas da próstata avançar para um estado independente de androgénios, onde eles podem progredir e levar à metástase e morte [9]. Porque a quimioterapia ea radioterapia são ineficazes e doenças metastáticas freqüentemente desenvolvem mesmo após a cirurgia, há limitadas opções de tratamento disponíveis para o câncer de próstata [10]. Por conseguinte, devem ser desenvolvidos novos métodos de tratamento de cancro da próstata. evidências acumuladas mostrou que a resistência adquirida para a terapia de radiação pode ser superada através da utilização de compostos de moléculas pequenas que têm como alvo proteínas-chave envolvidas na resistência à radiação [11]. abordagens terapêuticas anti-cancerígenos, tais como a radiação ionizante (IR), pode ativar máquinas apoptótica celular em células de câncer de próstata andrógeno-independente [12]. No entanto, a resistência à radiação adquirida pode desenvolver-se em cancro da próstata refractário a hormonas que está associada com resistência a apoptose [13]. Estudos anteriores também demonstraram que os defeitos na maquinaria apoptótica estão correlacionadas com a resistência das células cancerosas para intervenções terapêuticas actuais, incluindo IR [14].

A autofagia é um importante processo catabólico responsáveis ​​pela degradação e reciclagem de longa duração proteínas, agregados celulares e organelas danificadas. Além do papel bem documentado de autofagia da sobrevivência das células, uma função para autofagia na morte celular foi proposto há muito tempo [15]. Nos últimos anos, o papel de autofagia como um mecanismo de morte celular alternativa tem sido um assunto de debate. Estão em curso estudos para definir melhores estratégias para modular a autofagia para a prevenção e terapia do cancro e de explorar a autofagia como um alvo para a descoberta de fármacos no tratamento [16]. A activação da quinase PI3 /Akt, um método bem conhecido para inibir a apoptose, também inibe a autofagia [17]. Akt fosforila alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), o que tem sido relatado para inibir a indução de autofagia [18]. Estudos anteriores demonstraram que a resposta ao stress do retículo endoplasmático (ER), em combinação com autofagia, representa um mecanismo adaptativo para suportar a sobrevivência de células em resposta a uma grande variedade de condições prejudiciais [19]. ER estresse ativa um conjunto de vias de sinalização que são coletivamente denominados o Response proteína Unfolded (UPR). Tipicamente, a sinalização da RPU promove a sobrevivência celular através da melhoria do equilíbrio entre a carga de proteína e a capacidade de dobragem no ER [20]. No entanto, se as células são expostas ao stress prolongado ou ER robusta, as células morrem por apoptose [21]. Evidências crescentes indicou que ER stress é também um potente gatilho de autofagia [22]. Assim, uma melhor compreensão das vias de sinalização que controlam ER stress induzida por autofagia e destino celular venha a abrir novas possibilidades para o tratamento do cancro.

(A) Estrutura química de MP. (B) Os efeitos dependentes da concentração de MP sobre a viabilidade de células PC-3. As células foram tratadas com 5, 15, 25, 35 ou 45 uM MP durante 48 horas. *,

p Art 0,05, MP versus controle. (C) Os efeitos citotóxicos nas células tratadas com IR (4 Gy) e /ou MP (25 uM). #,

p Art 0,05, IR versus tratamento combinado. *,

p Art 0,05, MP versus tratamento combinado. (D) As curvas de sobrevivência de radiação de dose-resposta de células PC-3 com ou sem MP. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão de três experiências independentes.

Monascuspiloin (MP), um pigmento amarelo isolado pela primeira vez pelo nosso grupo de

Monascus pilosus M93

arroz -fermented, é um estruturalmente semelhante ao bem conhecido

Monascus

pigmento monascin. No entanto, os mecanismos subjacentes aos efeitos da MP em combinação com IR sobre o câncer de próstata são em grande parte desconhecida. No presente estudo, as células PC-3 (células de cancro da próstata humano independente de androgénios) foram utilizados para investigar os efeitos anti-câncer de IR combinados com MP

in vitro

e

in vivo

. Foram examinados os tipos de morte celular induzida por IR, quando combinado com o MP. Nós também investigou os possíveis mecanismos subjacentes a morte celular induzida pelo IR e /ou MP nas células PC-3.

Gy) e MP (25 mM). As caudas indicam danos no ADN. (B) O efeito da MP IR ou sozinho ou em combinação, durante 48 horas no ADN média cauda. #,

p Art 0,05, IR versus tratamento combinado. *,

p Art 0,05, MP versus tratamento combinado

Materiais e Métodos

cultura celular

A linha de células de cancro da próstata humano. PC-3 (ATCC CRL-1435) foi obtido a partir da American Type Culture Collection (ATCC). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY) suplementado com antibióticos contendo 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina (Gibco BRL, Grand Island, NY) e soro de bovino fetal a 10% (Hyclone, Sul Logan, UT, EUA). As células foram incubadas numa atmosfera humidif içada contendo 5% de CO

2 a 37 ° C. Exponencialmente as células em crescimento foram descoladas utilizando 0,05% de tripsina-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) em meio RPMI 1640.

(A) a apoptose precoce, detectada utilizando um kit de detecção de apoptose Anexina V, foi medida utilizando um caudal citometria. As células foram tratadas com IR (4 Gy) e MP (25 uM) durante 48 horas. (B) Desenvolvimento de Avos em células PC-3. Detecção de fluorescência verde e vermelha nas células AO-coradas utilizando citometria de fluxo. (C) Quantificação de avos com células coradas AO-tratados com IR (4 Gy) ou MP (25 uM), isoladamente ou em combinação com a citometria de fluxo. #,

p Art 0,05, IR versus tratamento combinado. *,

p Art 0,05, MP versus tratamento combinado. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão de três experiências independentes. microfotografias (D) EM de células PC-3 tratadas com IR (4 Gy) e MP (25 uM) durante 48 horas. O

setas brancas

aponte para autofágica vacúolos e autolysosomes. (E) Western Blot para LC3-I, LC3-II, p62 /SQSTM1 e Atg5-12 em células PC-3. As células foram tratadas com IR (4 Gy) e MP (25? M) durante 48 horas.

Microorganismo e preparação de monascuspiloin (MP)

Monascus pilosus M93

foi obtido a partir de BCRC, FIRDI (Hsinchu, Taiwan) e mantidas em agar de dextrose de batata (PDA; Difco). A estirpe foi plaqueada em placas de PDA e cultivou-se a 25 ° C durante 7 dias. Os esporos foram então lavadas para fora a partir da placa PDA utilizando água estéril e a concentração da suspensão de esporos resultante foi ajustado para 1 × 10

6 /ml. Seguindo os esporos passo de enriquecimento, 1 ml de suspensão de esporos foram inoculados em 250 ml de frascos de agitação contendo 50 ml de meio RGY (3% de amido de arroz, 7% de glicerol, 1,2% de polipeptona, soja em pó 3%, 0,1% MgSO

4 e 0,2 NaNO%

3) e cultivado com agitação (150 rpm) a 25 ° C durante 3 dias para se obter o caldo de micélio de M93. Para a produção de RYR, cinquenta frascos de vidro de 450 ml, contendo cada um 75 g de arroz e 75 mL D.I. água, foram esterilizados durante 20 min a 121 ° C. M93 caldo de micélio (7,5 ml) e forma RGY (7,5 ml) foram adicionados a cada frasco. Os bottltes foram então incubadas a 25 ° C durante 21 dias (7,5 ml de meio de RGY foi adicionado a cada frasco 10 na

dias de incubação), e os conteúdos foram então liofilizadas para remover a água. O RYR (1 kg) foi extraída com etanol a 95% (3 L) a 25 ° C durante 24 horas, e o etanol foi removido por secagem sob vácuo para obter o extracto em bruto RYR. A quantidade de MP nos extratos foi medida utilizando HPLC com uma estrela Purospher® coluna RP-18 (Merck). A fase móvel composta por 60% de acetonitrilo contendo 0,1% de fosfato a um caudal de 1,0 mL /min. O RYR (1 kg) foi, em seguida, extraiu-se com etanol a 70% (3 L) a 25 ° C. Depois da filtração, o extracto de etanol foi concentrada e acetato de etilo (EA) foi adicionado para se obter uma fracção solúvel em EA. A fracção solúvel foi EA-injecção numa coluna de gel de sílica (70-230, 230-400 mesh, Merck) e eluída usando n-hexano /acetato de etilo (02:01). Para obter MP, a fracção eluída foi concentrada sob pressão reduzida e purificou-se utilizando cromatografia em camada fina preparativa (gel de sílica 60 F-254, Merck) com

N

-hexano /EtOAc (02:01).

Gy) e /ou MP (25? M) durante 48 horas.

As rotações ópticas foram medidas utilizando um polarímetro digital de Jasco P-1020. Os espectros de UV foram obtidos em MeOH utilizando um espectrofotómetro Jasco-240 UV e espectros de IV (KBr ou puro) foram obtidos utilizando um espectrómetro de FT-IR Perkin-Elmer 2000 de sistema. O 1D (

1H,

13C, DEPT) e 2D (COSY, NOESY, HSQC, HMBC) espectros de RMN utilizando CDCl

3 e CD

3OD como solventes, foram registrados usando um Varian UNITY plus 400 (400 MHz para

1H NMR, 100 MHz para

13C) e Varian INOVA-500 (500 MHz para

1H NMR, 125 MHz para

13C) espectrômetro. Os desvios químicos foram referenciados para os sinais do solvente internos em CDCl

3 (

1H, δ 7,26;

13C, δ 77,0), e TMS foi utilizado como padrão interno. Baixa resolução ESI-MS Os espectros foram obtidos utilizando uma API 3000 (Applied Biosystems), e de alta resolução ESI-MS Os espectros foram obstained usando um espectrómetro Bruker Daltonics 30e APEX II.

Gy) ou MP (1 mg /kg x 6), isoladamente ou em combinação. (A) O peso corporal em ratos pelados, medido uma vez por semana. (B) O volume de tumor em ratinhos nus, medidos a cada dois dias. Os dados são apresentados como o volume relativo do tumor (média ± erro padrão) normalizada para o volume inicial do tumor medido no dia 0. (C) As observações directas de ratinhos com tumores. Seguindo as experiências, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram removidos. (D) A medição do peso do tumor em ratinhos nus após o sacrifício. (E) Immunohistochemical (IHC) e hematoxilina e eosina (H E) de coloração de tecidos de PC-3 do rato de xenoenxerto. IHC foi utilizado para determinar os níveis de LC3 e p62 /SQSTM1 expressão (x 100 ampliação da objetiva).

MP, isolado como um óleo amarelado, foi atribuído a fórmula molecular C

21H

28º

5Na por ESI-MS ([m + Na]

+,

m /z 383

) e HR-ESI-MS ([m + Na]

+,

m /z

383,1832). MP era semelhante à de um composto conhecido, monascin, a estrutura de MP foi determinada como sendo (3

S

,3a

R

,9a

R

)-3a,4-dihydro-3-((

S

)-1-hydroxyhexyl)-9a-methyl-6-((E)-prop-1-enyl)-3

H

-furo [3, 2-

g

] isocromeno-2,9 (8

H

, 9a

H

) -diona (Fig. 1A).

O tratamento de irradiação e a viabilidade celular ensaio

RI foi realizada com 6 raios-X MV utilizando um acelerador linear (digital H Mevatron acelerador, Siemens Medical Systems, CA, EUA) a uma taxa de dose de 5 Gy /min. Um adicional de 2 cm de um bolus de tecido equivalente foi colocado no topo dos frascos de cultura de tecidos de plástico para assegurar o equilíbrio electrónico, e 10 cm de material de tecido equivalente foi colocada sob os frascos para se obter completa retro-difusão. As células tratadas foram centrifugadas e ressuspensas em 0,1 ml de PBS. Cada suspensão de células (0,02 ml) foi misturado com 0,02 ml de solução de azul tripano (0,2% em PBS). Depois de 1 ou 2 minutos, cada solução foi colocado em um hemocitómetro, e as células coradas de azul foram contados como não-intacta.

ensaio clonogénico

As células foram irradiadas utilizando 2, 4 ou 6 Gy. MP foi adicionado às células em concentrações de 15 ou 25? M. As células foram tripsinizadas e contadas. um número conhecido de células foram subsequentemente novamente plaqueadas em placas de cultura de 6 cm e voltou para a incubadora a fim de permitir o desenvolvimento de colónias. Após 7 dias, as colónias contendo ≥50 (células) foram coradas com solução de violeta cristal a 0,5% durante 30 min. A eficiência de plaqueamento (PE), é a razão entre o número de colónias para o número de células semeadas no grupo não irradiado. Cálculo de frações de sobrevivência (FE) foi realizada utilizando a equação: SF = colónias contadas /(células semeadas × PE), utilizando o PE indivíduo

Determinação de apoptose precoce

A apoptose foi avaliada por. a quantificação da translocação de fosfatidilserina à superfície da célula, detectadas com um kit de detecção de apoptose Anexina V (Calbiochem, San Diego, CA, EUA), de acordo com o nosso relatório anterior [23].

ensaio cometa

Para detectar danos no DNA em células individuais, adotamos um ensaio do cometa. Resumidamente, as células (2 x 10

4) foram recolhidas após os tratamentos e ressuspensas em 0,2 ml de PBS contendo 0,5% de agarose de ponto de fusão de baixo ponto. Oitenta e cinco microlitros da mistura foi aplicada a lâminas, que foram então submergidos em solução de lise frio (2,5 M NaCl, 0,1 M de EDTA, 10 mM de Tris, 1% de Triton X-100 (pH 10)). A electroforese foi realizada a 300 mA e 25 V durante 20 min. Após a electroforese, as lâminas foram neutralizadas com 0,4 M de tampão frio de Tris-HCl (pH 7,5) e em seguida corados com brometo de etídio. Cometas foram visualizadas utilizando um microscópio de fluorescência (Olympus, Japão). dano do ADN foi avaliada em 100 células em que momento da cauda (cauda multiplicado pelo comprimento da fracção de ADN na cauda) foi quantificada usando o programa Image-Pro Plus (Media Cybernetics Inc.).

supravital das células coradas com acridina laranja para detecção de autofagia

coloração celular com acridina laranja (Sigma Chemical Co.) foi realizada de acordo com procedimentos publicados [23].

a microscopia eletrônica

As células foram fixadas usando uma solução contendo 2,5% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em tampão de cacodilato 0,1 M, pH 7,3, durante 1 h. Após a fixação, as amostras foram fixadas posteriormente em 1% de OsO

4 no mesmo tampão durante 30 min. seções ultra-finas foram posteriormente observado sob um microscópio eletrônico de transmissão (JEOL JEM-1200EX, Japão) a 100 kV.

Western blot análise

Total de lisados ​​de proteína celular foram preparados por células colheita em proteínas tampão de extracção durante 1 hora a 4 ° C, como descrito anteriormente [24]. As densidades das bandas foram quantificadas utilizando um densitómetro de computador (AlphaImager

TM 2200 Sistema Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, EUA). GAPDH foi usada como o controlo da carga de proteína. Anticorpos para a detecção de Akt, fosfo-Akt, fosfo-mTOR, fosfo-AMPK, AMPK e fosfo-p70S6K foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Ipswich, MA, EUA); anti-GAPDH foi obtido a partir de Abcam (Cambridge, MA, EUA); anti-LC3 e anti-Atg5-12 foram obtidos a partir de Abgent (San Diego, CA, EUA); anti-p62 /SQSTM1 anticorpo foi obtido a partir de MBL (Nagoya, Japão), e anti-anti-mTOR e p70S6K foram obtidos a partir de Epitomics (Burlingame, CA, EUA).

Ensaios in vivo do crescimento tumoral utilizando o PC -3 modelo de tumor em ratinhos nus

Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as orientações do nosso instituto (o Guia de Cuidados e Uso de Animais de laboratório, Universidade Nacional Cheng Kung). O protocolo de uso de animais listados abaixo foi revisto e aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) (Aprovação No: 99.138). Seis a oito semanas de idade camundongos nu masculina (BALB /cAnN.Cg-Foxn1

nu /CrlNarl) foram adquiridos a partir do Centro de Animal Laboratório Nacional (Taiwan). Os animais foram alojados cinco por gaiola, a 24 ± 2 ° C e 50% de humidade relativa ± 10% e submetido a uma 12-h ciclo de luz /escuro de 12 h. Os animais foram aclimatizados durante uma semana antes do início das experiências e alimentados com uma dieta de ração Purina e água ad libitum. Os tumores foram induzidos por injecção subcutânea (s.c.) de células PC-3 (2 × 10

6 células em 0,1 ml de PBS) a um local do flanco direito. Tumores (visualizado como pequenos nódulos nos locais de injecção) apareceu ~ 7 dias após a injecção, e os animais foram distribuídos aleatoriamente em cada grupo. Os ratinhos foram tratados com: (1) veículo (óleo de milho), (2) 1 mg /kg MP três vezes por semana, durante duas semanas, (3) uma dose única de 6 Gy IR, ou (4) a um tratamento de combinação compreendendo um mg /kg MP três vezes por semana durante duas semanas iniciada imediatamente após uma única dose de 6 Gy IR. Os pesos corporais de ratinho foram medidas uma vez por semana e foram utilizadas como um indicador da toxicidade sistémica do tratamento. O crescimento do tumor foi medida a cada dois dias, e o volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula indicada abaixo [25]:

O volume do tumor (mm

3) = diâmetro maior (mm) x diâmetro pequeno (MM )

2/2

os dados são expressos como o volume relativo do tumor em comparação com o volume de pré-tratamento medido no dia 0. o tempo de quadruplicação do volume do tumor (TVQT, em dias) foi determinada por uma regressão que melhor se ajusta análise. O (TGD) tempo de atraso do crescimento do tumor é definida como a diferença entre o TVQT dos tumores tratados em comparação com a dos tumores de controlo não tratados. O tempo TVQT TGD e foram calculadas para cada ratinho individual, e, em seguida, os meios foram gerados por cada grupo. taxa de inibição do crescimento do tumor foi calculada como se segue:. Inibição (%) = (volume médio de tumor de ratinhos de controlo não tratadas – o volume do tumor de ratos tratados) /volume médio do tumor de ratos de controlo não tratados x 100

imuno-histoquímica (IHC) análise de coloração

secções de tecido

parafina-incorporados (4 mm) foram secas, desparafinados, e reidratadas. Após pré-tratamento de micro-ondas em tampão citrato (pH 6,0; para a recuperação de antigénio), as lâminas foram imersas em peróxido de hidrogénio a 3% durante 20 minutos para bloquear a actividade da peroxidase endógena. Após lavagem intensiva, com PBS, as lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo anti-LC3 anticorpos e /SQSTM1 (MBL, Japão) anti-p62. As secções foram então incubadas com um anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente, e as lâminas foram desenvolvidas utilizando o kit de detecção de Starr TREK Universal HRP (Biocare médica, Concord, CA). Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina. Cada lâmina foi digitalizada em baixa potência (× 200).

A análise estatística

Os dados são expressos como a média ± SD. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student para comparação entre as médias ou one-way análise de variância com teste post-hoc de Dunnett [26]. As diferenças foram consideradas significativas quando p . 0,05

Resultados

efeitos citotóxicos e curvas de sobrevivência de MP e IR tratados isoladamente ou em combinação com células PC-3

A viabilidade das células foi observada em diferentes concentrações de MP (de 0 a 45 uM) durante 48 horas (Fig. 1B). MP sozinho reduziu a viabilidade das células de uma forma dependente da concentração. Após o tratamento com 25 uM MP durante 48 horas, a viabilidade de células PC-3 foi reduzida para 60%. A Figura 1C mostra a viabilidade de MP e IR tratada isoladamente ou em combinação em células PC-3. Significativamente toxicidade aumentada foi encontrada para o tratamento combinado em comparação com MP e IR tratamento sozinho em células PC-3. Além disso, a figura 1D mostra as curvas de sobrevivência de resposta à dose de radiação para células PC-3 com ou sem tratamento com MP. As curvas de sobrevivência dramaticamente deslocado para baixo. MP (15 ou 25? M) aumentou-IR induzida morte de células clonogénicas, em células PC-3. MP reduziu significativamente a fracção de sobrevivência de um modo dependente da dose em comparação com IV sozinho.

danos no ADN determinada pelo ensaio de cometa e expressão de proteínas relacionadas com o stress em células ER PC-3 tratadas com MP e IV sozinho ou em combinação

RI desempenha um papel fundamental na terapia do cancro devido à sua capacidade para induzir directamente danos no ADN [27]. O ensaio cometa é um instrumento sensível para a estimativa da reparação de dano de ADN e a nível celular, que requer apenas um pequeno número de células [28]. No ensaio de cometa para as células PC-3, uma limitada ou nenhuma cauda foi encontrado nos controlos não tratados, enquanto a cauda aumentou após a irradiação e tratamento combinado (Fig. 2A). O comprimento da cauda aumentou significativamente depois de IV (4 Gy) em comparação com os controlos (Fig. 2B). danos no ADN aumentados de forma significativa foi encontrada para o tratamento combinado em comparação com IV sozinho. Estes resultados sugeriram que os danos do ADN estava envolvido nos efeitos anti-proliferativos de tratamento combinado em células PC-3. Além disso, dados recentes mostram que um dos mecanismos através dos quais RI activa ER stress e a RPU é pela indução de danos no ADN [29]. Portanto, para detectar a expressão de proteínas relacionadas com o stress ER, foi realizada a transferência de Western com lisados ​​de células PC-3 que recebem cada um dos diferentes tratamentos (Fig. 2C). Os nossos resultados mostraram que IRE1α e fosforilação de eIF2α aumentada com o tratamento combinado em comparação com sozinho ou MP IR tratamento, confirmando assim que o tratamento combinado induzida ER stress em células PC-3.

Medição da apoptose e autofagia em PC- 3 células tratados com MP e IV sozinho ou em combinação

Como se mostra na Figura 3A, a apoptose precoce em células PC-3 foi medida por citometria de fluxo com o kit de detecção de apoptose Anexina V. Os resultados quantitativos mostraram que a ocorrência de apoptose precoce em células PC-3 tratadas com MP e /ou IR foi baixa. Assim, analisamos ainda que a morte celular programada tipo II (autofagia). Caracteriza-se pela formação de numerosas vesículas ácidas, que são chamados organelos vesiculares ácidas (avos) [30]. laranja de acridina (AO) coloração foi quantificada utilizando citometria de fluxo (Fig. 3B, 3C). Um aumento significativo em células AO-positivas foi encontrado para células que receberam o tratamento combinado com comparação com os tratados com IR ou MP sozinho. Além disso, os ultra-estruturas das células PC-3 para cada grupo de tratamento foram observadas por EM fotomicrografia (Fig. 3D). O tratamento combinado também resultou em um grande número de vacúolos autofágicos autolysosomes e no citoplasma. Além disso, não houve condensação de cromatina ou picnose nuclear, que são características da apoptose, ocorreu em qualquer uma das células tratadas. Para detectar a expressão de proteínas relacionadas com autophagy, foi realizada a transferência de Western com lisados ​​de células PC-3 que recebem cada um dos diferentes tratamentos (Fig. 3E). Os níveis de expressão LC3-II, p62 e proteínas Atg5-12 aumentada com o tratamento combinado, o que sugere que o tratamento combinado autofagia induzida em células PC-3.

A via de sinalização /mTOR Akt está envolvida no tratamento combinado autofagia induzida em células PC-3

estudos anteriores demonstraram que a via Akt /mTOR está envolvida na regulação autofagia [31]. Por conseguinte, para investigar se a via de sinalização /mTOR Akt estava envolvido na autofagia induzida pelo tratamento combinado, foi realizada a transferência de Western para detectar o estado de fosforilação de proteínas (Fig. 4). As proteínas fosforiladas que estão envolvidas nas vias de sinalização de Akt /mTOR também foram examinados. Fosforilação de Akt, mTOR e p70S6K diminuiu em células tratadas com o tratamento combinado em comparação apenas com MP ou do IR tratamento.

O crescimento do tumor em ratinhos nus foi suprimida pelo IR e MP

A seguir, avaliou o efeito de crescimento anti-tumoral de IR e MP

in vivo

. Os tumores foram induzidos por s.c injecção de células PC-3 em ratinhos nus. Medimos o peso corporal dos ratinhos numa base semanal e o volume do tumor a cada segundo dia. Os resultados deste estudo demonstraram que nenhum dos regimes de tratamento produziu qualquer perda de peso do corpo, o que pode ser um sinal de toxicidade (Fig. 5A). O tratamento combinado suprimida volume do tumor e peso do tumor em ratinhos nus em comparação com MP IR ou tratamentos sozinhos (Fig. 5B, 5C, 5D). Como mostrado na Tabela 1, o tempo de quadruplicação do volume do tumor (TVQT) do grupo de controlo foi medido no dia 10 (10,3 ± 2,4). O tempo de atraso do crescimento do tumor (TGD) para o tratamento de 10 dias de MP sozinho foi de 10,4 ± 4,2 dias, que foi significativamente diferente do que para o grupo de controlo (

P 0,05

). IV sozinho produziu um tempo TGD de 17,8 ± 6,2 dias (

P

0,05 comparado com o grupo de controlo). O tratamento combinado resultou em um tempo TGD de 52,3 ± 7,1 dias (

p

0,05, em comparação com o grupo controle ou MP sozinho). A terapia de combinação de IR e MP resultou em uma inibição do crescimento do tumor de 71% no Dia 10. Assim, o tratamento combinado possui efeito anti-tumoral de crescimento

In vivo

.

Em seguida, o exame histológico foram analisadas através de hematoxilina e eosina (H e) de coloração (Figura 5E.). O tumor do tratamento combinado foi composta de células com os rácios mais baixos núcleo-a-citoplasma do que sozinho ou MP IR tratamento. Além disso, os padrões de LC3 e expressão p62 em tumores PC-3 foram examinados por meio da coloração IHC. LC3 e p62 foram aumentadas em tumores de camundongos tratados com o tratamento combinado em comparação apenas com MP ou do IR tratamento.

Discussão

Recentemente, foi relatado que RYR, uma erva comida chinesa tradicional e moderna suplemento dietético, demonstrou

in vitro

efeitos, incluindo inibição da proliferação e estimulação da apoptose em células cancerígenas do cólon humano [6]. Além disso, RYR reduziu significativamente os volumes dos tumores de xenoenxertos de tumores da próstata [32]. A combinação de IR com outros agentes que conseguem radiosuscetível potencial tornou-se intervenções importantes para os pacientes com cancro da próstata [33]. Estudos anteriores também demonstraram que os produtos naturais como os novos radiossensibilizadores para o tratamento do cancro da próstata refractário a hormonas que é resistente à terapia de radiação [11], [34]. No presente estudo, nós demonstramos pela primeira vez que a MP sensibiliza células PC-3 de cancro da próstata humano para IR ambos

in vitro

e

in vivo

no modelo de ratinho de xenoenxerto nu (Fig. 1, 5). Para a maior parte da história da terapia do cancro, a apoptose foi pensado para ser o único mecanismo de morte celular induzida por drogas. Mais recentemente, foi relatado que um tipo II a morte celular programada, autofagia, pode participar na morte de células de cancro induzida pela terapia do cancro. Descobertas recentes, incluindo o nosso laboratório, sugeriram que a autofagia activado é um supressor de tumores [23], [24], [35]. Aqui, o PC 3-células tratadas com autofagia induzida tratamento combinado potencialmente ocorreu quando a via apoptótica de células PC-3 foi bloqueado (Fig. 3). No estudo

In vivo

de PC-3 tumores de xenoenxerto, LC3 e p62 foram aumentada após o tratamento combinado (fig. 5E).

radiação desempenha um papel fundamental na terapia devido à sua capacidade para induzir directamente danos no ADN, em particular de ADN quebras de cadeia dupla, conduzindo assim à morte das células [27]. No nosso estudo, os danos no DNA significativamente aumentada foi encontrada no grupo de tratamento combinado em comparação com IR ou MP sozinho (Figs. 2A, 2B). No entanto, o detalhe do mecanismo ainda não está totalmente compreendido. É possível que MP interfere com o processamento e reparação de ADN induzida IR quebras de cadeia dupla. Alternativamente, a MP pode interferir com um passo de pós-reparação que envolvem a inversão real de γH2AX, tais como desfosforilação ou degradação e /ou uma troca da histona γH2AX [36]. Evidências recentes mostram que um dos mecanismos através dos quais RI ativa ER stress é a indução de dano do ADN [29]. Assim, duplos quebras de ADN de cadeia pode servir como um elo entre a ativação de estresse IR e ER. Os nossos resultados mostraram que IRE1α e fosforilação de eIF2α aumentada com o tratamento combinado, o que indica que o tratamento combinado induzida ER stress em células PC-3 (Fig. 2c). ER-stress pode ativar vias envolvidas na apoptose e autofagia [22] sinalização.