Abstract
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regulação positiva, amplificação e mutação têm sido amplamente relatado em cancros do ovário e outros tumores, que sugere fortemente que
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é um alvo terapêutico promissor. No entanto, até à data, os mecanismos subjacentes
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regulamentação e activação
in vivo
ainda é incerto. Durante a tumorigénese, interacções-tumor hospedeiro pode desempenhar um papel crítico na edição do tumor. Aqui, nós relatamos um novo mecanismo através do qual o microambiente do tumor ativa o
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oncogene. Mostramos que
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regulação positiva ocorre em regiões de tumor não-proliferação
in vivo
. Foram identificados e caracterizados o
PIK3CA
5 ‘a montante da transcrição região reguladora e confirmou que
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é transcricionalmente regulada através de NF-kB via. Estes resultados oferecem um novo mecanismo pelo qual o microambiente tumoral activa directamente vias oncogénicas em células tumorais
citação:. Yang N, Huang J, J Greshock, Liang S, Barchetti A, K Hasegawa, et ai. (2008) a regulação da transcrição da
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Oncogene por NF-kB no cancro do ovário Microenvironment. PLoS ONE 3 (3): e1758. doi: 10.1371 /journal.pone.0001758
Editor do Academic: Edathara Abraham, da Universidade de Arkansas, Estados Unidos da América
Recebido: 15 Janeiro, 2008; Aceito: 07 de fevereiro de 2008; Publicação: 12 de março de 2008
Direitos de autor: © 2008 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NCI SPORE P01-CA83638 no cancro do ovário (Carreira de Desenvolvimento Award, LZ); do Fundo de Investigação do cancro do ovário (GC e LZ); Mary Kay Ash Charitable Foundation (LZ) e da American Cancer Society (LZ). AG foi apoiado em parte por uma bolsa predoctoral do Ministério grego da Educação (Programa HERACLITOS, EPEAEK). DK foi parcialmente apoiado pela Associação Italiana de Investigação do Cancro (AIRC)
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
fosfatidilinositol-3. ‘quinase (PI-3-quinase) é um transdutor intracelular com especificidade de substrato lipídico implicada numa ampla variedade de vias de sinalização associadas a cancro envolvidas no metabolismo de células de tumor, a sobrevivência e proliferação [1], [2], [3], [4 ], [5], [6], [7]. É recrutados e activados por várias tirosina-quinases receptoras e gera segundos mensageiros via fosforilação de lípidos de inositol membrana na posição D3 [3], [8]. PI-3-quinase foi identificada pela primeira vez como oncogene putativo devido à sua capacidade para se ligar ao antigénio T do meio de polioma [9], [10]. A clonagem molecular de de PI 3-cinases revela uma família grande e complexo que contém três classes de múltiplas subunidades e isoformas de [3], [8]. No entanto, como cada subunidade contribui precisamente para o progresso e manutenção de câncer é desconhecida [3], [5].
O
gene PIK3CA
codifica a subunidade p110-alfa catalítica, um dos as três proteínas de subunidade catalítica da classe IA PI-3-cinases que estão normalmente activada pelo factor de crescimento cinases de tirosina receptoras.
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foi identificado como um oncogene codificado-retrovírus aviária que transforma fibroblastos de embrião de galinha [11]. Numerosos estudos recentes indicam que
PIK3CA Comprar e vias a jusante são frequentemente alvo de genômica amplificação, mutação ou sobre-expressão em tumores sólidos, incluindo o cancro do ovário [12], [13], [14], [15], [16] , [17], [18], [19], [20]. Estudos anteriores sobre a função de
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têm predominantemente focado em circuitos de regulação dentro da célula cancerosa.
In vitro
,
PIK3CA
desempenha um papel crítico na sobrevivência e proliferação de células [1], [2], [3], [4], [5], [7]. No entanto, até à data, não se sabe se
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assume diversos papéis, dependendo do estado e /ou o contexto em que se encontra a célula tumoral. Além disso, não se sabe como tais papéis de
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pode ser afetada pelo meio tumor.
interações dinâmicas entre desregulação genética em células tumorais e as alterações moleculares e celulares reativas em células hospedeiras preencher o tumor microambiente desempenhar um papel crítico na promoção da transformação maligna e a progressão do tumor e o crescimento [21], [22]. Após a aquisição de alterações genéticas críticas, as células tumorais são submetidos ao estresse metabólico /isquêmica e editar o microambiente circundante. Por sua vez, as células hospedeiras servir para editar o tumor, promovendo a selecção de células tumorais que se beneficiam de influências microambiente do tumor. mecanismos de resposta imune inata e adaptativa para tumores que culminam na inflamação têm recebido atenção significativa neste contexto, como a inflamação tem sido mostrado para promover o crescimento do cancro e progressão [23], [24], [25]. leucócitos associados a tumores produzir inúmeros factores pró-angiogénico que promovem a vascularização do tumor [26], [27], [28], [29]. Além disso, factor nuclear kappa B (NF-kB), um regulador transcricional fundamental da inflamação, foi mostrado desempenhar um papel crítico na carcinogénese-driven inflamação e para promover o crescimento e progressão tumoral [25], [30], [31 ], [, 33, 34, 35 32] [] [] []. Foi assim postulado que a conversa cruzada contínua e dinâmica entre as células tumorais e células hospedeiras assegura a sobrevivência de células tumorais e sustenta o crescimento de tumores [21], [22]. Os efeitos mútuos de interações tumor-hospedeiro foram caracterizados com relação à angiogénese. No entanto, como as interações tumor-hospedeiro afetar diretamente as células tumorais permanece parcialmente indeterminada.
epitelial do ovário (EOC), o tumor maligno de ovário mais comum, continua a ser a principal causa de morte entre as doenças malignas ginecológicas [36]. A falta de estratégias de prevenção, métodos de diagnóstico precoce e terapias eficazes para tratar tumores de ovário recorrente cria uma necessidade premente de entender sua patogênese e identificar alvos moleculares para o diagnóstico e tratamento da EOC em diferentes fases de progressão da doença [20], [37] , [38], [39], [40], [41]. Neste estudo, nós examinamos a expressão de
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e sua relação com o microambiente do tumor no câncer de ovário humano. A identificação e caracterização do
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5 ‘da transcrição região reguladora (TRR) em conjunto com experimentos de validação funcionais confirmou que
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é transcricionalmente regulados pelo microambiente, através de inflamação e NF-kB. Esses resultados oferecem um novo mecanismo através do qual o microambiente do tumor ativa diretamente vias oncogênicas em células tumorais e promove o crescimento do tumor.
Materiais e Métodos
Pacientes e espécimes
As amostras usadas neste estudo foram coletados na Universidade da Pensilvânia e da Universidade de Turim, na Itália [42]. Os tecidos foram obtidos após consentimento por escrito dos pacientes no âmbito de um protocolo geral de recolha de tecidos aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da instituição (IRB), da Universidade da Pensilvânia e da Universidade de Turim. Todos os tumores eram de sítios primários, e foram coletadas no momento da debulking cirurgia de pacientes não tratados previamente com estágio III e IV câncer de ovário. As amostras foram congelados instantaneamente imediatamente e armazenado a -80 ° C. Os espécimes foram coletados em fase de aprovação de revisão institucional local e processados de acordo com procedimentos aprovados pelo ato HIPAA.
Cultura celular
As células foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% soro fetal de bovino (FBS, Invitrogen). Em algumas experiências, as células foram incubadas em meios enriquecidos com TNF-α humana recombinante (50 ou 100 ng /ml, BD Bioscience, San Jose, CA) durante várias vezes, conforme indicado.
Isolamento de ARN total e quantitativa Real- tempo de RT-PCR
O ARN total foi isolado a partir de 100 a 500 mg de tecido congelado ou 1 × 10
6 células cultivadas com o reagente TRIzol (Invitrogen). Após o tratamento com DNase isenta de RNase (Invitrogen), RNA total foi a utilização do Kit Superscript First-Strand Synthesis por RT-PCR (Invitrogen) sob condições definidas pelo fornecedor transcritas inversa. O ADNc foi quantificada por PCR em tempo real no Sistema de detecção ABI Prism Sequence 7900 (Applied Biosystems). Human
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iniciador directo: TCA AAG GAT TGG GCA CTT TT, e iniciador inverso: GCC TCG ACT TGC CTA TTC AG. A PCR foi realizada usando reagentes de SYBR Green PCR núcleo (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A amplificação por PCR do gene GAPDH de limpeza foi realizada para cada amostra como controlo de carregamento de amostra e para permitir a normalização entre amostras. Uma curva padrão foi construída com PCR II-TOPO vector de clonagem (Invitrogen) contendo o mesmo fragmento inserido e amplificado pela PCR em tempo real.
tissue microarray
O tissue microarray foi construído como descrito anteriormente [43], [44]. Em resumo, os tumores foram incluídos em parafina e 5 mícrons foram coradas com HE para selecionar regiões representativas para biópsias. Quatro biópsias de tecidos do núcleo foram obtidos a partir de cada espécimen. A presença de tecido tumoral nas amostras dispostas foi verificado na secção corada por hematoxilina-eosina.
imuno-histoquímica (IHQ) e Análise de Imagem
IHC foi realizada utilizando o Kit Vectastain ABC como descrito pelo fabricante (Vector, Burlingame, CA). Foram utilizados os seguintes anticorpos primários (todos da BD Pharmingen, a menos que indicado de outro modo): Ki67 de coelho anti-humano (1:200, DAKO, Carpinteria, CA); citoqueratina coelho anti-humano (1:200, DAKO); de coelho anti-p65 humana (1:400, Santa Cruz, Santa Cruz, CA); rato p110α anti-humana (1:250 ou 1:50); rato anti-ratinho CD31 (1:200); HIF1Α rato anti-humano (1:200); rato c-jun anti-humano (1:200); de rato anti-CD11b (1:200). Os anticorpos foram incubados durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. O imunorreacção foi visualizado com 3,3′-diaminobenzidina (Vector). coloração de imunofluorescência dupla foi realizada tal como anteriormente descrito [45]. Resumidamente, as secções foram sequencialmente incubadas em soro normal de 5%; anticorpos primários durante 2 horas; e fluorescente anticorpos secundários marcados (Vector) durante 30 min. As secções foram contra-coradas com DAPI antes de serem inspeccionadas sob um microscópio fluorescente. As imagens foram coletadas por meio fresco SNAP Pro cor câmera digital (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) e índice de coloração foi analisada utilizando software Imagem-Pro Plus 4.1 (Media Cybernetics).
TUNEL Ensaio
a peroxidase ApopTag no kit de detecção situ (Intergen) foi usado para visualizar as células em apoptose
in vivo
e
in vitro
. O procedimento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, secções de tecido de tumor foram fixadas com paraformaldeído a 1% em PBS, seguido de etanol frio e ácido acético pós-fixação. A seguir à incubação com os resíduos de nucleótidos digoxigenina e transferase terminal de desoxinucleótido durante uma hora a 37 ° C, as células foram incubadas com anticorpo anti-digoxigenina marcado com FITC.
Os plasmídeos
O rato
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cDNA foi generosamente fornecidos pelo Dr. Roberts (Universidade de Harvard). De mamífero pCDNA3 plasmídeo de expressão foi a partir de Invitrogen. Para construir os plasmídeos repórter da luciferase, 5’TRRs do humano e de ratinho
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foram amplificados a partir de ADN genómico de BAC ou usando Expand High Fidelity Sistema de PCR (Roche, Indianapolis, IN) e inserido a montante do gene da luciferase em pGL3 -Basic vector (Promega, Madison, WI). Sequências de 5’TRR em todas estas construções repórter foram verificados por sequenciação de ADN.
5 ‘Amplificação Rápida de extremidades de ADNc (5’ RACE)
O ARN total foi extraído com o kit RNeasy Mini ARN (Qiagen, Valencia CA) e o “sistema 5 RACE (Invitrogen) foi utilizado. O produto de PCR 5 ‘RACE foi inserido no sistema de clonagem TA (Invitrogen).
A transfecção do plasmídeo
As células foram semeadas em placas de 6 poços a 3 x 10
5 células /poço e crescidas durante a noite de ~ 40% de confluência antes da transfecção. Todos os plasmídeos foram transfectados com o reagente de transfeco FuGENE6 (Roche) seguindo as instruções do fabricante. Para seleccionar células resistentes à neomicina, aplicou-se 400 ug /ml de neomicina (Invitrogen). Para as experiências de shRNA, as células foram transfectadas com ARNsi expressando pLTsuppressor1.0. Em experimentos in vitro indicaram que a supressão do
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mRNA persistiu por até 30 dias. Todas as experiências de transfecção foram realizadas em triplicado e repetidas pelo menos duas vezes com diferentes isolados de ADN.
Luciferase Reporter Assay
As células foram semeadas em placas de 6 poços a 3 × 105 células /poço e cultivadas durante a noite a 40% de confluência antes da transfecção. Para testar a actividade do promotor de
PIK3CA
, um total de construção repórter de 0,5 ug e 0,01 ug de pRL-TK controlo interno (Promega) foram utilizados para cada transfecção. Todas as experiências de transfecção foram realizadas em triplicado e repetidas pelo menos duas vezes com diferentes isolados de ADN. Quarenta e oito horas após a transfecção, a análise da luciferase foi realizado em Luminoskan Ascent (Thermo Labsystems-, Waltham, MA) utilizando Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) de acordo com as instruções dos fabricantes. Para as experiências de co-transfecção, 1 ug de cada plasmídeo pCMV-IκBα ou pCMV-IκBαM (Clontech, Mountain View, CA) foi utilizado.
Mudança eletroforética Mobility Assay (EMSA)
Extracto nuclear a partir de células foi preparado utilizando NE-PER citoplasmáticas de extracção Reagentes nuclear e mais Halt Inibidor de Protease Cocktail Kit (Pierce, Rockford, IL) seguindo os protocolos do fabricante e armazenou-se a -80 ° C até serem usadas. Recombinante NFkB (p50) foi encomendado da Promega. 5′-biotina marcado com oligos de DNA contendo o tipo selvagem humana
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NFkB sítio de ligação (GACGTGGGGGATTTTTCGCGTA), mutantes humana
site de PIK3CA
ligação de NFkB (GACGTGGGCGATTTTTCGCGTA), precipitação humana
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ligação de NFkB local (TCAGATAGACGAGACTTGAGTC), local de ligação de controlo de tipo selvagem NFkB (AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG) [35], local de ligação de NFkB mutado de controlo (AGTTGAGGCGACTTTCCCAGG) foram sintetizados e os dois oligonucleótidos complementares foram hibridados para se obter a sonda de cadeia dupla. EMSA foi realizada utilizando Kit LightShift Quimioluminescentes EMSA (Pierce). O extracto nuclear (ou p50) e 30 fmol de sonda marcada foram incubadas no tampão de ligação 10 ×, mais 1 pg de poli (dl-dC) no sistema reaccional de 20 ul à temperatura ambiente durante 20 min. Toda a reacção de ligação de 20 ul foi aplicada num gel de poliacrilamida a 7,5% e realizada à temperatura ambiente em 0,25 × TBE a 110 V durante 1-1,5 h. A reacção de ligação a electroforese foi então transferida para BrightStar-Plus positivamente membrana de nylon carregada (Ambion, Austin, TX) em Trans-Blot SD semi-seco transferência electroforética celular (Bio-Rad, Hercules, CA) a 15 V durante 30 min e transversal -ligada no UV Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, CA) a auto nível de ligação transversal para 1 min. Detecção de sonda de DNA biotina marcado foi realizada seguindo estritamente o protocolo do fabricante.
Cromatina imunoprecipitação (CHIP)
ensaio de chip para detectar p65 vinculativo sobre o ser humano
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promotor foi realizada utilizando o kit de ensaio de Upstate chip (Upstate, Charlottesville, VA) seguindo as instruções do fabricante. ADN cortado foi incubada a 4 ° C durante a noite com 2? G imunoprecipitar anticorpos IgG policlonal de coelho para p65 (Santa Cruz) ou IgG normal de coelho de controle 2 ug. Entrada e ADN imunoprecipitado-cromatina foi usado como molde de PCR para a detecção de p65 de ligação no promotor (com os iniciadores 5′-GCACCAAGACACTACCTTGAATC-3 ‘e 5′-CTCTGCAGTCCTTTGACTCACTT-3′) ou no promotor GAPDH (com os iniciadores 5’-GACACCATGGGGAAGGTGAA -3 ‘e 5′-GAGTAGGGACCTCCTGTTTC-3’), utilizando o kit de PCR Núcleo (Roche).
Bioinformatics
a busca de potencial fator de transcrição sites sobre o ser humano e do rato a ligação
PIK3CA
5’TRRs foram realizadas utilizando o programa Mat Inspector V2.2 na https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html [46].
Estatísticas
a análise estatística foi realizada utilizando o pacote de software estatístico SPSS (SPSS). Todos os resultados foram expressos em média ± SD, e p 0,05 foi usado para significância
Resultados
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é regulada em regiões não-proliferação no cancro do ovário
Para revelar aspectos espaciais da
PIK3CA
regulação no tumor
in vivo
, primeiro analisou a expressão de p110α em amostras de cancro do ovário humanos. Curiosamente, a expressão forte p110α foi detectada principalmente nos grupos de não-proliferação, células tumorais Ki67- (Figura 1 A a C). Nestas células, p110α foi translocado para a membrana celular (Figura 1 C). Em contraste, Ki67 regiões + exibiram baixa expressão de p110α, que foi localizado principalmente no citoplasma, ao passo que apenas poucas células Ki67 + exibiram p110α na membrana celular (Figura 1 B). A tissue microarray foi usado para validar ainda mais este resultado no cancro do ovário humano. Em 18 dos 30 (60%), tumores forte expressão p110α (e a localização da membrana) foi detectada principalmente nas regiões tumorais Ki67-, enquanto que nos outros tumores expressão forte membrana p110α ou foi detectada tanto em ambas as células de tumor Ki67- e Ki67 + (5 /30, 16,7%); principalmente em células tumorais Ki67 + (3 /30,10.0%); ou era indetectável. (30/04; 13,3%)
A a C. Duplo imunocoramento p110α (verde, FITC) e Ki67 (vermelho, Texas Red) no cancro do ovário B. alta ampliação humana de um região de A com baixa expressão de p110α. p110α é expresso em níveis baixos e localiza-se no citoplasma das células tumorais Ki67-positivas. C. alta ampliação de uma região de A com elevada expressão de p110α. p110α é expressa em níveis elevados e localiza na membrana plasmática nas células tumorais Ki67-negativas. D e E. imuno-localização de Ki67 permite a identificação clara das áreas de proliferação e áreas de células tumorais não-proliferação
in vivo
em 2008 tumores de xenotransplante de ovário. E. Ampliação elevada da área de D mostrando a fronteira entre uma proliferação e uma região não-proliferantes. F a expressão forte H. e localização membrana celular de p110α só é encontrado em áreas Ki67-negativos. F. Secção adjacente a D, coradas com anticorpo contra p110α humano (diluição 1: 250). G. alta ampliação da área a partir de F, mostrando a fronteira entre a proliferação e a região não-proliferantes. H. alta ampliação da área de G mostrando a localização da membrana de p110α na região de não-proliferação. I. A imunocoloração de citoqueratina humana identifica células tumorais em áreas proliferantes e não proliferantes no 2008 modelo de xenotransplante. A linha traça o limite entre as duas zonas, tal como definido por coloração de Ki67 em secção adjacente (ver J). Ambas as regiões proliferantes e não-proliferação são positivas para citoqueratina humana (FITC, verde), indicando células tumorais. os núcleos das células foram contrastadas com DAPI. J para L. Duplo p110α e Ki67 mapas imunocoloração
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ativação no proliferar ou não proliferando áreas em 2008 tumores de xenoenxerto. J. Ki67 (vermelho, Texas Red) e p110α (FITC, verde) exibem expressão recíproco. K e L. alta ampliação de proliferar região (I) e a região não-proliferativas (H) a partir de J.
Para confirmar ainda mais este resultado, nós investigamos tumores de xenoenxerto gerados com a linha celular 2008 do cancro do ovário . A vantagem deste modelo é que áreas distintas de proliferar e descansando células tumorais podem ser claramente identificados
in vivo
por coloração Ki67 (Figura 1 D e E) [47]. Da mesma forma para a expressão recíproca observado nas amostras humanas, forte expressão p110α foi detectado em células tumorais apenas em Ki67-, regiões não proliferativas (Figura 1 F a H). Nessas áreas, p110α foi localizada principalmente na membrana celular (Figura 1H). coloração Duplo confirmou que as áreas que expressam p110α foram, de facto, preenchida por células tumorais, que expressaram citoqueratina, um marcador de tumor epitelial (Figura 1 I a K). Com o aumento da concentração de anticorpo primário (de 1:200 a 1:50), expressão p110α fraco poderia também ser detectada em regiões Ki67 +, mas p110α localizado difusamente ao citoplasma nestas áreas (Figura 2). Assim, oncogene
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é significativamente regulada em regiões não-proliferação no cancro do ovário humano
in vivo
. Estas regiões não proliferando sempre falta de apoio dos vasos sanguíneos e contêm numerosas células necróticas /apoptose, bem como linfócitos rica infiltrando (Figura 3).
A. a coloração imuno-histoquímica de p110α utilizando alta concentração de anticorpo primário (01:50) revela baixa expressão de p110α difusa no citoplasma das células tumorais em regiões Ki67-positivas (+) Ki67. B e C. alta ampliação de proliferação regiões (c) de A.
A não-proliferação (B) e. imunocoloração dobro do CD31 (vermelho, Texas Red) e p110α (verde, FITC) no modelo 2008 xenotransplante. p110α coloração forte é detectada principalmente nas regiões distantes do tumor localizado capilares. coloração B. Triplo de p110α (vermelho, Texas Red), Ki67 (azul, AMCA) e TUNEL (verde, FITC) no modelo 2008 xenotransplante.
Identificação e caracterização do humano e murino
PIK3CA
promotores
para entender melhor os sinais de regulação contribuindo para a regulação positiva de
PIK3CA
em câncer, 5 ‘sequências reguladoras a montante do ser humano
gene PIK3CA
foram identificado. 5′-amplificação rápida da extremidade de cDNA (5 ‘RACE) foi utilizado para identificar o local de início da transcrição (TSS) de
PIK3CA
(Figura 4A e B) humana. Um segmento de 125 pb da região 5 ‘não traduzida (UTR) e 2,3 Kbp do TRR do ser humano
PIK3CA
foram clonados a partir cromossomo humano bacteriana artificial (BAC, o número de clone: PR11-245C23). Descobrimos que a região reguladora a montante de 5 ‘de humano
PIK3CA
está localizado a aproximadamente 50 Kpb a montante do codão de iniciação da tradução local (Figura 4A). Esta região é muito rica em GC (Figura 4B). Mapeamento de RT-PCR confirmou adicionalmente a TSS de
PIK3CA, e uma pequena variante de splicing foi identificado (Figura 4C para E). O murino
PIK3CA
“sequência reguladora a montante 5 foi também clonado através do mesmo método, e verificou-se ser de 63,6% de identidade com a sequência humana (Figura 5) e incluem um pequeno intrão.
A. Ilustração da estrutura do gene PIK3CA
humana
e sua “região reguladora 5 upstream. B. Uma região muito rica em GC é encontrada no
PIK3CA
5’TRR. C. Ilustração dos iniciadores utilizados para o mapeamento de RT-PCR do
PIK3CA
local de início da transcrição (SST). D. Resultados do mapeamento de RT-PCR. Não há banda entre a F1 iniciador directo localizada a montante da SST ea R iniciador inverso localizado no exão 1 de
PIK3CA
. As bandas de tamanho adequado pode ser detectado entre F2 ou F3 iniciador (ambos localizados a jusante da SST) e inverter RE iniciador Uma pequena variante de splicing é encontrada no 5’UTR de humano
PIK3CA gene, que pode também ser detectada por mapeamento de RT-PCR (iniciadores F2 e R). F. Resumido resultados da atividade transcricional de
PIK3CA
fragmentos TRR.
Para caracterizar ainda mais a atividade transcricional da região promotora, TRR todo o 2.3 Kbp 5 ‘ou incrementalmente fragmentos do promotor truncado foram subclonados em conjunto com um 316 ou uma região de transcrição de 150 pb no vector repórter pGL-básico para revelar a expressão de luciferase (Figura 4F). atividade transcricional forte foi localizada para a região de -2.340 para -159 pb por ensaio luciferase, enquanto a atividade transcricional diminuiu significativamente após -159 pb (Figura 4F).
Em seguida, fator de transcrição locais de ligação foram previstas em humanos
PIK3CA
5’TRR
in silico
por Genomatix (https://www.genomatix.de/index.html). sítios de ligação para vários fatores de transcrição associado ao estresse foram encontrados, incluindo NF-kB; hipoxia-inducible factor (HIF); proteína de choque térmico (HSP); e um activador de proteína (AP1) (Figura 6). Assim, os sinais de estresse mediadas por estes fatores podem regular o
expressão PIK3CA
nas células tumorais não proliferando em áreas de diminuição da vascularização e aumento de linfócitos infiltrantes.
Expressão e localização da transcrição candidato fatores
in situ
a expressão e localização de três fatores reguladores putativos que emergiu da anterior
in silico
análise, HIF1α; c-Jun, um membro do complexo de AP1; e a subunidade p65 de NF-kB, foram selecionados em 2008 xenotransplantes. Porque a função desses fatores requer expressão e translocação nuclear, considerou-se forte expressão e localização evidências nuclear indirecta de ativação funcional. Expressão forte HIF1α nuclear foi visto em grupos de células irregulares em regiões Ki67-. HIF1α proteína também foi detectada em regiões de Ki67 +, mas principalmente localizada no citoplasma (Figura 7 A, D e G). proteína c-Jun foi estritamente expressa nas fronteiras entre Ki67 + e regiões Ki67-, onde apenas uma coloração nuclear foi detectada. Poucas células de c-Jun-positivas dispersas também podia ser detectada em regiões Ki67 +, mas a energia nuclear c-Jun não foi observada em regiões Ki67- (Figura 7 B, E e H). localização nuclear forte de proteína /p65 de NF-kB foi visto nas regiões Ki67- e Ki67 em áreas adjacentes + para as regiões Ki67- (Figura 7 C, F e I). Curiosamente, mais forte nuclear NF-kB /p65 foi detectada adjacentes a áreas de necrose do tecido (Figura 7 F). Estes dados, juntamente com o
PIK3CA
análise promotor sugerem que HIF1α e NF-kB está envolvida na regulação positiva de
PIK3CA
em regiões Ki67-
in vivo
. Consistente com esta hipótese, a via de hipoxia /HIF foi reportado para regular
PIK3CA
em células cancerosas [48]. Desde regulação hipóxica de
PIK3CA
foi confirmado, o próximo focada na regulação da
PIK3CA
pela via NF-kB.
A a C. imuno coloração do candidato fatores de transcrição HIF1α, c-Jun e NF-kB em 2008 xenotransplantes. A linha mostra a fronteira entre as regiões p110α de alta Ki67 + p110α-baixa, e Ki67-. D a F. alta ampliação de A para C, respectivamente, mostra a expressão e localização nuclear de HIF1Α, c-Jun e NF-kB em 2008 xenoenxertos. G a I. Ilustração da localização da transcrição candidato factores HIF1α, c-Jun e NF-kB, no modelo de xenoenxerto de 2008. Grandes pontos representam localização citoplasmática, enquanto os pequenos pontos representam localização nuclear. A linha representa o limite entre as regiões p110α de alta Ki67 + p110α-baixa, e Ki67-.
NF-kB se liga ao promotor e regula positivamente
PIK3CA
expressão
de acordo com um importante papel de NF-kB na regulação da
PIK3CA
, encontramos ligação NF-kB sequências local de consenso em
PIK3CA
5’TRRs (Figura 8A) humana e mouse. O sítio de ligação de NF-kB promotor humano foi localizado em -807 a -786 pb. Testamos se NF-kB regula a atividade transcricional de humano
PIK3CA
promotor
in vitro
. activação de NF-kB requer liberação da sua subunidade inibidora IκBα, o que permite que o NF-kB translocação para o núcleo [34], [35]. Transient forçada de expressão de tipo selvagem ou mutante IκBα IκBα (IκBαM), ambos os quais se ligam de NF-kB e bloquear a sua translocação para o núcleo, atenuou a actividade de transcrição de
PIK3CA
promotor, como foi revelado por ensaio de luciferase. Removendo o sítio de ligação de NF-kB da região do promotor revogada a actividade inibidora de IκBα ou IκBαM (Figura 8 B e C).
. Ilustração do sítio de ligação de NF-kB previsto no humano (topo) ou de murídeo (inferior)
PIK3CA e região promotora. B. Ilustração das construções compreendendo luciferase ligada ao humana
PIK3CA
promotor com (Luc-2340/316) ou sem local de ligação de NF-kB (Luc-378/316). C. Síntese de actividades de luciferase Luc-2340/316 e Luc-378/316 co-transfectadas com pCMV- IκBα ou pCMV- IκBαM. ensaio D. Gelshift usando extracto nuclear de células de cancro do ovário após a estimulação de TNF-α. Pista 1, o sítio de ligação de NF-kB de
promotor PIK3CA
humana do tipo selvagem (wt hu
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sonda NF-kB) sozinho; as faixas 2 e 3, em peso hu
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NF-kB sonda + extrato nuclear; pista 4, controlar sonda NF-kB + extrato nuclear, pistas 5 e 6, mutado hu
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sonda NF-kB + extrato nuclear; pista 7, controle mutado sonda NF-kB + extrato nuclear; pistas 8 e 9, precipitação hu
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sonda NF-kB + extrato nuclear. ensaio de desvio em gel utilizando E. proteína /p50 de NF-kB recombinante. Pista 1, em peso hu
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sonda NF-kB só; as faixas 2 e 3, em peso hu
PIK3CA
sonda NF-kB + p50; pista 4, mutado hu
PIK3CA
NF-kB sonda sozinha; pistas 5 e 6, mutado hu
PIK3CA
NF-kB sonda + p50; pista 7, controlar sonda NF-kB só; pistas 8 e 9, controlar sonda NF-kB + p50.
A sequência de ligação de NF-kB previsto no ser humano
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promotor foi ainda testado usando ensaio de gel shift. As proteínas nucleares de 2,008 linha celular de cancro do ovário, tratadas com TNF-α foram capazes de deslocar (bind) sequências de oligonucleótidos que contêm o local de ligação do NF-kB previsto de
promotor PIK3CA
humano, mas não foram capazes de deslocar qualquer mutante ou sequências de oligonucleótidos simulada (Figura 8 D). Além disso, a proteína /p50 de NF-kB recombinante foi capaz de deslocar as sequências de oligonucleótidos que contêm o previsto NF-kB locais de ligação, confirmando a sua presença no humano
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promotor (Figura 8 E). Finalmente, a presença de local de ligação de NF-kB na
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promotor foi confirmada por ensaio cromossomo imunoprecipitação (CHIP).
A inflamação pode regular o
expressão PIK3CA
via NF- kB via
Durante o crescimento do tumor, estresse metabólico /isquémico induz a morte das células tumorais, o recrutamento de células inflamatórias, incluindo macrófagos. Estas citocinas pró-inflamatórias liberação que ativam a via de NF-kB [25], [33], [34], [35]. Foram mapeados a distribuição da necrose, os macrófagos infiltrantes tumorais e activação de NF-kB, no modelo de xenoenxerto de 2008. Morfológica necrose foi detectada predominantemente em Ki67- p110α + regiões, muitas vezes localizadas em seu centro (Figura 9 A). infiltração intensa de macrófagos CD11b +, que produzem citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, foi encontrada em associação com áreas de necrose (Figura 9 B a D).
. H E de tumores coloração de 2008 revela uma área proeminente de necrose (N). B e C. imuno-coloração de CD11b murino revela macrófagos se infiltrar em um xenotransplante de 2008. células CD11b + infiltrar tumores em regiões Ki67-negativas na proximidade de necrose. C. alta ampliação de B. D. Duplo imunocoramento CD11b (verde, FITC) e Ki67 (vermelho, Texas Red) revela CD11b macrófagos + principalmente em não-proliferando regiões Ki67-negativos. análise de E. ChIP de NF-kB ligação ao endógena
PIK3CA
promotor.