Abstract
O embelin produto natural foi demonstrado possuir uma vasta gama de terapêutica propriedades, no entanto, os mecanismos através dos quais ela exerce efeitos anticancerígenos ainda não são claras. Ao monitorar as mudanças moleculares associados durante a fase inicial de apoptose, identificamos o papel crucial do estresse induzido sinalização MAP quinase oxidativo como um mecanismo predominante para os seus efeitos anticancerígenos. O tratamento de células de cancro do pulmão A549 com embelin resultou no aumento de fosfo-p38 e os níveis de fosfo-JNK tão cedo quanto 4 horas. O pré-tratamento de células com inibidores específicos de p38 (PD169316) e JNK (SP600125) revogados embelin induzida por activação da caspase-3. Estudos realizados com embelin na presença ou ausência de inibidores específicos MAP quinase indicou que as mudanças observadas nos níveis de fosforilação de p38, JNK e ERK 1/2 são unicamente devido a embelin e não por causa de cross-talk entre MAP quinases. espécies reactivas de oxigénio (ROS) desempenham um papel crucial em alterações induzidas embelin da fosforilação da quinase MAP e apoptose como pré-tratamento de células com FeTMPyP mitigar este efeito. As alterações observadas não são, devido ao efeito inibidor de embelin em XIAP como células tratadas com o péptido SMAC-N7-Ant, um inibidor específico de domínio BIR3 de XIAP não embelin mímico induziu efeitos apoptóticos. Os resultados do presente estudo indicam claramente o papel crucial da p38 e JNK percursos em embelin apoptose induzida e nos fornecer novas pistas para melhorar a sua eficácia terapêutica
Citation:. Avisetti DR, Babu KS, Kalivendi SV (2014 ) a ativação do p38 /JNK caminho é responsável pelo Embelin induzida apoptose em células de câncer de pulmão: papel de transição das espécies reativas de oxigênio. PLoS ONE 9 (1): e87050. doi: 10.1371 /journal.pone.0087050
editor: Shrikant Anant, Universidade de Kansas School of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 24 de setembro de 2013; Aceito: 17 de dezembro de 2013; Publicação: 22 de janeiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Avisetti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo projecto sorriso do CSIR, na Índia. Senior Research Fellowship para DRA da UGC, na Índia, é reconhecido agradecimento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Embelin, um componente activo de frutos de
Ribes embelia,
foi demonstrado possuir um largo espectro de propriedades terapêuticas, tais como anti-cancro, anti-inflamatório, anti-diabetes, anti-obesidade, analgésica, anti-fertilidade e anti-helmíntico [1] – [5]. A descoberta inicial de embelin como um inibidor de XIAP em virtude da sua interacção com o domínio BIR3 e a sua selectividade observada para as células cancerosas em comparação com as células normais nos inspirou a considerá-lo como um composto de chumbo para estudos adicionais contra o cancro [6]. Como muitos dos cancros expressam níveis elevados de XIAP e tornam-se refractários à apoptose, o tratamento com embelin ou em combinação com outros fármacos anti-cancerígenos conhecidos foi encontrado para sensibilizar os para a apoptose [6], [7]. Estudos indicam que baseada em mecanismo embelin inactiva NF-kB através da inibição do transporte nuclear de p65 e também mostrado inibir a fosforilação de STAT3 por induzir a expressão de PTEN [8], [9].
esforços específicos para identificar o molecular preciso alvo de embelin resultou na identificação de embelin como um inibidor contra o domínio BIR3 [6] de XIAP. Além disso, embelin também demonstrou ser um inibidor de 5-lipoxigenase e microssomal prostaglandina E2 sintase-1 (mPGES) -1; inibidor-1 do activador do plasminogénio (PAI-1) e P300 /CBP fator associado (PCAF) [10] – [12]. Além disso, embelin foi mostrado para interferir com a fosforilação oxidativa mitocondrial e pode passar por ambos os mecanismos redox e não-redox mediada [13], [14].
Embora a afinidade de embelin contra alguns dos alvos moleculares e os mecanismos de sinalização celular ter sido identificado, o alvo intracelular principal responsável pela sua propriedade anti-cancro ainda não é claro como muitos dos estudos anteriores foram realizados em pontos de tempo mais tardios em que a cascata de transdução de sinal torna-se complexa devido à diafonia entre vários mecanismos de sinalização celular [8], [15], [16], [17]. Assim, no presente estudo, buscou-se identificar as alterações nas vias de sinalização responsáveis para a propriedade anti-câncer da embelin durante a fase de apoptose precoce. O presente estudo identificou pela primeira vez o papel central da via da MAP quinase, especialmente p38 e JNK, em embelin apoptose induzida.
Materiais e Métodos
Materiais
Embelin foi purificado a partir dos frutos de
embelia Ribes
como descrito anteriormente [18], [19]. Meio Essencial Mínimo (MEM), meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), salino tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS), penicilina, estreptomicina, sulfo-rodamina B (SRB), Ac-DEVD-7-AFC, Ac-LEHD-7-AFC, PD169316 , SP600125, N-acetil-L-cisteína (NAC), tampão de precipitação radioimune ensaio (RIPA) e mistura de inibidores de protease foram adquiridos de Sigma-Aldrich, Alemanha. U0126 e FeTMPyP foram adquiridos a partir de Calbiochem. SMAC-N7-Ant peptídeo (AVPIAQK-P-RQIKIWFQNRRMKWKK) foi sintetizado por Genpro Biotech, Noida, na Índia. kit de ensaio de Anexina-V foi adquirido em Clontech Inc., EUA. Todos os produtos químicos para a preparação de buffer e produtos químicos finos foram adquiridos da Sigma-Aldrich, Alemanha.
Cultura de Células e condições experimentais
Todas as linhas celulares foram obtidas a partir de ATCC, EUA. A549, DU145, células MCF-7 e WPMY-1 foram cultivadas em MEM (suplementado com 10% FBS, 100 unidades /ml de penicilina e 100 unidades /ml de estreptomicina), enquanto H9c2 e as células MRC-5 foram cultivadas em meio DMEM (suplementado com 10 % de FBS, 100 unidades /ml de penicilina e 100 unidades /ml de estreptomicina). As células foram mantidas em atmosfera humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C. Doze horas antes dos tratamentos, o meio de cultura celular foi substituído com respectivos meios contendo 2% de FBS, a menos que indicado de outra forma. Em estudos de intervenção, as células foram pré-tratadas com os respectivos inibidores da cinase MAP ou antioxidantes durante 1 h antes da adição de embelin (15 uM). Para as experiências envolvendo péptido SMAC-N7-Ant, as células foram tratadas com 100 uM de péptido durante um período de 8 h.
Ensaio de Citotoxicidade
O efeito de embelin sobre a viabilidade celular foi determinada através de sulfo-rodamina B ( SRB) ensaio como descrito anteriormente [20]. SRB é um corante que se liga a aminoxanthene resíduos de aminoácidos básicos (de células fixas a placas de cultura de tecidos por ácido tricloroacético) sob condições acídicas suaves [20]. Resumidamente, as células (em placas de 24 poços, ~ 80% de confluência) foram tratadas com diferentes concentrações de embelin durante 48 h em meio suplementado com soro fetal bovino a 10%. Após o término da incubação, as células foram fixadas por adição de ácido tricloroacético a 30% para o meio a 4 ° C durante 1h. Mais tarde, as células foram lavadas com água desionizada e secas ao ar. SRB (0,04%, w /v) foi adicionado às células e incubou-se ainda durante 30 min à temperatura ambiente. Finalmente, as células foram lavadas com ácido acético a 1% (três vezes) e seco ao ar. SRB ligado às células foi solubilizado em base Tris 10 mM e a absorvância foi medida a 565 nm usando o leitor de placa Enspire multimodo (Perkin Elmer).
caspase 3 e 9 Ensaio
sequência da terminação de incubação, celulares da caspase-3 e -9- actividades foram medidas usando substratos AFC tetrapéptido conjugado, tal como descrito anteriormente [21]. Resumidamente, as células foram lavadas com DPBS gelado e lisadas em tampão de lise arrefecido em gelo (50 mM de HEPES pH 7,4, CHAPS 5 mM e DTT 5 mM) [22]. Os lisados foram sedimentadas para baixo a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C e os sobrenadantes foram recolhidos. Para os lisados de volumes iguais de tampão de ensaio (40 mM de HEPES pH 7,4, 0,2% CHAPS, DTT 10 mM, EDTA 4 mM) contendo quer caspase-3 de substrato (Ac-DEVD-AFC 7-, 40? M) ou caspase-9 substrato (Ac-LEHD-7-AFC, 40 uM) foi adicionado e incubado a 37 ° C. Aumento nas leituras de fluorescência devido à libertação de AFC foi monitorizada para cada intervalo de 5 min a λex 400 nm e 505 nm para λem 1h usando Enspire leitor de placas multimodo (Perkin Elmer). estimativa de proteínas foi realizada pelo método de Bradford e as unidades de fluorescência foram normalizadas para o total de proteínas na mistura de incubação.
Anexina-V /FITC Análise de Apoptose
células A549 cultivadas em lamelas em 6- bem placas foram tratadas com embelin durante 4 h. Após o tratamento, lamelas foram lavadas duas vezes com PBS, seguido por tampão de ligação 1X. As células foram então coradas com anticorpo /FITC anexina-V por incubação no escuro durante 30 min e lavado com tamp de ligao 1X para remover qualquer anticorpo não ligado de acordo com o protocolo do fabricante (Clontech Inc, EUA). Formaldeído (2%) foi adicionada para fixar as células no final da incubação. A fluorescência foi monitorizada utilizando um microscópio Olympus-IX71inverted equipado com configurações de filtro FITC e rodamina.
Gene Expression Profiling usando Microarray
As células A549 foram tratadas com embelin durante 4h. Após os tratamentos, o ARN foi isolado utilizando o kit da Qiagen de acordo com as instruções do fabricante. A concentração e pureza do ARN extraído foram avaliados usando o Nanodrop espectrofotómetro (Thermo Scientific). A integridade do RNA extraído foi analisado no Bioanalyzer (Agilent). RNA foi considerado de boa qualidade com base nos valores 260/280, rRNA 28S /relações 18S e número de integridade do RNA (RIN). As amostras foram rotulados com Kit Agilent rápida Amp. 500 ng de RNA total foi transcrito de forma inversa utilizando oligo-dT primer marcado a sequência do promotor de T7. ADNc assim obtido foi convertido em cDNA de cadeia dupla na mesma reacção. Além disso, o ADNc foi convertido em ARNc o
In vitro
passo de transcrição de T7 usando enzima RNA polimerase e corante Cy3 foi adicionado na mistura de reacção. cRNA obtido foi limpo utilizando colunas RNeasy (Qiagen Inc) e da concentração e da quantidade de corante incorporado foi determinada utilizando Nanodrop. A actividade específica para todas as amostras superiores a 8 pmol corante /ug ARNc foram considerados ideais para a hibridação. Labeled ARNc (600 ng) foi hibridado na matriz (Custom Total Genoma Humano 8 × 60k concebido por genotípico tecnologia privada limitada AMADID: 027114), usando o kit de Expressão A hibridação do gene em câmaras de hibridação SURE (Agilent), a 65 ° C durante 16 h. lâminas hibridadas foram lavadas utilizando tampões de lavagem Gene Expression. Os hibridizadas, slides microarray lavadas foram então digitalizados em um scanner de microarray (G2505C, Agilent Technologies). extração de dados a partir de imagens foi feita utilizando software Feature Extraction e as imagens foram quantificados (Versão 10.7 da Agilent). Recurso de dados em bruto extraído foi analisado utilizando GeneSpring GX versão 11.5 do software da Agilent. A normalização dos dados foi feito em GeneSpring GX usando o 75
th turno percentil. genes significativos para cima e para baixo mostrando regulado de duas vezes e superior dentro das amostras no que diz respeito ao controlo de exemplo foram identificados. Estatística
t
-test p-valor foi calculado com base no
t
-test Algoritmo de Student. Genes foram classificados com base na categoria funcional e percursos usando GeneSpring GX e software de análise genotípica Biointerpreter-Biológica. Os dados microarray foi submetido ao banco de dados GEO com o número de acesso GSE50545.
intracelular ROS Medição
Geração de espécies reativas de oxigênio nas células foi determinada por carboxi-H2-DCFDA (Molecular Probes), como descrito anteriormente [23]. Após a cessação do tratamento, o meio foi aspirado e as células em placas de 12 poços foram lavadas duas vezes com DPBS. meio livre de soro contendo 10 uM carboxi-H2-DCFDA foi adicionado às células e incubou-se ainda a 37 ° C durante 20 min. Finalmente, as células foram lavadas duas vezes com DPBS antes da adição de meio de cultura. fluorescência intracelular foi monitorado usando um microscópio Olympus-IX71inverted equipado com configuração de filtro FITC.
Western Blot Analysis
seguintes tratamentos, as células foram lavadas com DPBS, suavemente raspadas e recolhidos por centrifugação breve (300 g durante 3 min) e ressuspensas em 100 ul de RIPA contendo mistura de inibidores de protease e de orto-vanadato de sódio, 10 mM (Sigma). A suspensão celular resultante foi passada através de uma agulha de calibre 26 a 10 vezes para assegurar uma lise completa. O lisado foi centrifugado a 12000 g durante 15 min a 4 ° C e os sobrenadantes límpidos foram recolhidas em tubos separados. Uma vez que todos os anticorpos utilizados são anticorpos monoclonais, em vez de decapagem e reprobing as imunotransferências de proteínas totais e específicas de fosfo, temos realizado imunotransferência separadamente, a fim de evitar quaisquer sinais de fundo. Seguindo estimativa de proteína pelo método de Bradford, proteínas (25 ug) foram resolvidas por 10% SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. As manchas foram sondadas com anticorpos monoclonais produzidos contra anticorpos específicos para totais e fosfo ERK 1/2, p38, JNK (Cell Signaling Technology); e tubulina (Sigma-Aldrich). Anti-Ig de coelho-G conjugada com HRP (GE Life Sciences) e anti-IgG de ratinho conjugado com fosfatase alcalina (Sigma-Aldrich) foram utilizados como anticorpos secundários para a MAP-cinase e anticorpos de tubulina respectivamente. Bandas foram desenvolvidos utilizando ECL Prime transferência de Western reagente (GE, Ciências da Vida) ou reagente BCIP /NBT para tubulina (Sigma-Aldrich) e as intensidades das bandas foram calculados utilizando software GeneTools (Syngene sistema de documentação de gel).
Estatística análise
Todas as experiências foram realizadas em triplicado e os resultados foram expressos como média ± SD A significância estatística foi determinada pelo estudante de
t
teste usando software SigmaPlot.
Resultados
Embelin Exposições citotoxicidade melhorada em células de câncer em comparação com as células normais
A actividades anti-proliferativas de embelin foram comparadas pelo ensaio de SRB em cancro seleccionado e linhas celulares normais (Fig. 1). As células foram submetidas a concentrações crescentes de embelin (2,5, 5, 10 e 25 uM) durante 48 h. Entre as células cancerígenas, embelin foi encontrada para ser mais tóxico para as células A549 com um IC
50 valor de 4,4 uM seguido por DU145 e MCF7 com 6,31 uM e 10,66, respectivamente. No entanto, o IC observada
50 valores eram comparativamente menos do que as linhas de células normais, viz., MRC5, WPMY-1 e H9c2 que demonstraram uma
valor de IC 50 de 24,4, 10,9 e 23,4 ^ M, respectivamente. A diferença entre o IC observada
50 valores de cancro do pulmão e células normais (4,44 ± 0,76 e 24,44 ± 5,32 uM) pareceu ser mais significativa. Como as células A549 apresentaram sensibilidade aumentada no sentido embelin, todos os outros estudos foram realizados utilizando esta linha celular para a compreensão do modo de acção do embelin para ganhar novos conhecimentos para atingir selectivamente as células cancerosas de pulmão, em comparação com o seu homólogo celular normal. Assim, a fim de identificar a fase apoptótica precoce, analisamos o efeito dependente do tempo de embelin em celular a actividade da caspase-3 em células A549 (Fig. 2A). Embelin (15 uM) induziu um aumento de quase duas vezes na actividade da caspase-3 como início do período de tempo de 4 horas, que ainda aumentada até 6 vezes por 8h (Fig. 2A). Anexina-V /FITC coloração de células tratadas com embelin (4H) indica claramente a fase apoptótica precoce de células que foram coradas apenas com anexina-V, mas não com iodeto de propidio (Fig. 2B). No entanto, a posterior pontos de tempo, ou seja, 18 e 24 horas, a caspase-3 actividades diminuiu quase a 4 e 2 vezes, respectivamente, indicando que as células apoptóticas podem ter morrido completamente até ao final de 18 ou 24 horas ou poderia também haver a possibilidade de múltiplas mecanismos de morte celular devido ao cross-talk entre os vários mecanismos de sinalização.
(a) Estrutura do Embelin (B) as células foram tratadas com embelin por 48h e após o término da incubação, a viabilidade celular foi medida por sulfo B de ensaio e de CI
50 valores foram calculados como mencionado na secção “Materiais e Métodos”. Os dados apresentados são média ± DP de três experiências separadas. * Indica P 0.01as em comparação com controlos
células A549
(A) foram tratados com 15? M embelin para intervalos de tempo diferentes.. Após a cessação dos tratamentos, a actividade da caspase-3 foi medida como indicado na secção “Materiais e Métodos”. (B) As células A549 foram tratadas com 15? M durante 4 h embelin e coradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio /tal como descrito na secção “Materiais e Métodos”. imagens de fluorescência foram capturados utilizando um microscópio de fluorescência invertido Olympus-IX71 equipado com configurações de filtro FITC e rodamina. Imagens representativas de três diferentes campos de visão são mostrados. (C) As células foram tratadas com um inibidor de XIAP, péptido SMAC-N7-Ant (100 uM) durante 8 h. Mais tarde, a caspase-3 e -9- actividades foram medidos utilizando os substratos de tetra-péptido, tal como descrito na secção “Materiais e Métodos”. Para ambos (a) e de dados (C) apresentados são a média ± DP de três experiências separadas. ** Indica P 0,01 e * indica P 0,05, em comparação com controlos
Como embelin é conhecido por inibir a XIAP por ligação ao domínio BIR3 semelhante ao de SMAC, nós próxima examinado se a. observado afecta de embelin na apoptose celular pode ser demonstrada por um péptido SMAC-N7-Ant permeável célula (composto de amino-terminal de péptidos de ácido 7 amino maduro da SMAC – AVPIAQK ligado a formiga péptido -RQIKIWFQNRRMKWKK, para a permeabilidade celular por um ligante prolina), que é conhecido para interagir especificamente com o domínio de BIR3 de XIAP, [24], [25]. Os resultados demonstram que o tratamento de células A549 com SMAC-N7-Ant péptido (100 | iM para 8H) aumentou celular actividade de caspase-9 para cerca de duas vezes em relação ao controlo não tratado, no entanto, não foi observado aumento significativo na actividade da caspase-3 ( A Fig. 2C). Embora os efeitos observados de peptídeo SMAC-N7-Ant estão em conformidade com relatório anterior [24], a falta de ativação da caspase-3 com SMAC-N7-Ant peptídeo, mas não com embelin, levou-nos a investigar as vias responsáveis mediação embelin induzido apoptose para ganhar novos insights sobre seu mecanismo de ação.
a alteração na expressão gênica perfil por embelin
a fim de identificar as vias responsáveis em embelin apoptose induzida, analisamos o perfil de expressão genética alterada em células A549 tratadas com embelin (15 uM para 4H). Um total de 215 regulada e 80 genes reprimidos foram identificados que mostraram diferença, pelo menos, duas vezes mais controles com significância de p . 0,05
A classificação destes genes com base na categoria funcional e percursos usando GeneSpring GX e genotípica software de análise Biointerpreter biológicos indicaram que os genes regulados positivamente majoritariamente pertencem a cinco vias diferentes (com, pelo menos, 4 genes alterados em cada via) e o número de genes alterados são na ordem de Wnt (4 genes) adesão focal (5 genes ) p53 (8 genes) citocina-receptor de citocina interacção (11 genes) via da MAP quinase (16 genes) (Figura 3 A-C).. Entre os genes regulados negativamente com pelo menos três genes em cada via possuindo uma alteração de 2 vezes, com uma significância de p . 0,05 pertencia ao receptor de citocina por citoquinas e via da MAP-quinase (Fig. 3A e B)
A549 As células foram tratadas com embelin (15? M) durante 4 h. Microarray Analysis foi realizada como descrito na secção “Materiais e Métodos”. Genes que mostraram regulação diferencial em pelo menos 2 vezes com p 0,05 foram classificadas com base na categoria funcional e percursos usando GeneSpring GX e software de análise genotípica Biointerpreter-Biológica. Vias que predominantemente mostraram expressão diferencial foram via (A) Quinase MAP, (B) a interacção receptor de citocina por citoquinas e (C) via p53. Os dados foram submetidos a base de dados GEO com o número de acesso GSE50545.
À primeira vista, os resultados obtidos indicam que, entre os caminhos alterados, MAP quinase via de sinalização parece ser mais predominante e significativamente afectado, com quase 16 genes alterados e muitos dos genes estão a montante ou a jusante de p38 /JNK /via ERK, tais como p53 ou reguladores destes via (Fig. 3A). Do ponto de vista funcional, o estado de fosforilação das proteínas identificadas (como, DUSPs, GADD45A /B, p53, etc.), mas não apenas os seus níveis de transcritos de ditar o destino celular. No entanto, os resultados obtidos indicaram o papel substancial da sinalização MAP quinase e nos inspirou a se concentrar sobre o envolvimento de via da MAP quinase no embelin apoptose induzida.
Embelin Induzida por Activação de p38 e JNK Pathway
com base nas pistas iniciais obtidos a partir de estudos de micromatrizes sobre o papel potencial da via da MAP cinase em embelin induziu apoptose, procurou-se investigar mais profundamente no envolvimento da sinalização MAPK e monitorizada alterações embelin induzida no estado de fosforilação de ERK, proteínas p38 e JNK ( A Fig. 4). Os resultados, como mostrado na figura 3, indicam que embelin (15 uM) induziu a fosforilação da p38 a cerca de 2,5 e 3 vezes por 4 e 8 horas, respectivamente. A fosfo-JNK 1/2 níveis também foram aumentadas para 1,2 e 1,9 vezes, respectivamente por 8h. No entanto, sob as condições de tratamento semelhantes, houve uma diminuição significativa no estado de fosforilação de ERK 1/2 (p42 e p44) e os valores revelaram-se 0,3 e 0,2 vezes menor do que a dos controlos (Fig. 4A e B). A fim de entender se as mudanças no estado de fosforilação destas proteínas MAP quinase tem qualquer relevância para a apoptose, observado, temos células para 1h pré-tratados individualmente com inibidores específicos para p38 (PD169316), JNK (SP600125) e MEK (U0126) em 5? M seguido de concentração embelin (15? M) durante 4 h. -Induzida Embelin actividade da caspase-3 foi significativamente inibida por inibidores de p38 e JNK com valores de controlo cerca (Fig. 4C). No entanto, sob condições experimentais semelhantes inibidor MEK (U0126) não apresentam qualquer efeito de protecção contra a apoptose induzida embelin e também nenhum aumento significativo na actividade da caspase-3 foi observada em células tratadas com inibidores isoladamente (Fig. 4C). As alterações observadas indicam claramente que as alterações no estado de fosforilação de JNK e p38, tanto parece ser crucial na apoptose induzida embelin.
Células A549
(A) foram tratados com embelin 15 uM, durante 4 e 8 h. Total, bem como ERK fosforilada 1/2, p38, JNK 1/2 e tubulina (controlo de carga) foram medidos por Western blot como descrito em «Materiais e Métodos» secção. (B) Os valores normalizados das intensidades das bandas obtidas por análise densitométrica dos dados de (A). (C) a actividade da caspase-3 em células pré-tratadas com ou sem U0126 (5 uM), PD169316 (5 uM), SP600125 (5 ^ M) durante 1 hora seguido por embelin (15? M) durante 4 h. Os valores de controlo são normalizadas para 1 e os dados indicados são a média ± DP de três experiências separadas. * Indica P 0,05 quando comparado com o controle e # indica p . 0,05, em comparação com células embelin tratada
De modo a determinar se as alterações observadas na fosforilação da MAPK são por causa do tratamento embelin sozinho ou devido ao efeito regulador de uma MAP cinase sobre o outro MAPK do, que trataram as células individualmente com embelin (15 pM) na presença e na ausência de inibidor de MEK (U0126, 5 ^ M) ou inibidores da p38 (PD169316, 5 uM) ou inibidor de JNK (SP600125, 5 ^ M) durante 4 h e analisaram os níveis de fosforilação de todos os três MAP quinases (Fig. 5). A U0126 inibidor de MEK iniba a sua ERK alvo a jusante. inibidor de p38, PD169316 e inibidor de JNK, SP600125 inibir especificamente a p38 e a actividade de JNK, respectivamente, por forma competitiva a ligação aos bolsas de ligao de ATP impedem a fosforilação de proteínas a jusante, mas, como tal, não resulta em níveis de fosforilação reduzidos de qualquer p38 ou JNK [26 ], [27]. Os resultados indicam que o tratamento de células com o inibidor de MEK (U0126) inibiu a fosfo-ERK 1/2, mas não alterou os níveis de embelin induzida fosfo-p38 e os níveis de fosfo-JNK. Da mesma forma, o tratamento de células com o inibidor de p38 (PD169316) não afectou os níveis de fosfo-JNK e fosfo-ERK causadas por embelin. Além disso, o tratamento de células com o inibidor de JNK (SP600125) não afectou os níveis de fosfo-p38 e fosfo-ERK, na presença ou ausência de embelin (Fig. 5). Os resultados acima indicam que as alterações observadas nos níveis de fosforilação de p38, JNK e ERK parece estar diretamente mediado por tratamento embelin, mas não devido ao cross-talk entre as quinases MAP.
As células A549 foram pré tenha sido tratada com com ou sem U0126 (5 uM), PD169316 (5 uM), SP600125 (5 ^ M) durante 1 hora seguido por embelin (15? M) durante 4 h. Os níveis totais e fosforiladas de ERK 1/2, p38, JNK 1/2 e tubulina (controlo de carga) foram detectados por transferência de Western como descrito em «Materiais e Métodos» secção.
ROS Medeia MAP Regulamento quinase por Embelin
proteínas MAPK são conhecidas por serem reguladas pelo estresse oxidativo [28]. Além disso, a estrutura de benzoquinona embelin foi demonstrada para formar radicais semiquinona por mecanismo de redox que eventualmente leva a geração espécies reactivas de oxigénio [13], [29]. Estas observações sugerem um papel importante para ROS em embelin induzida apoptose. Para avaliar as propriedades pró-oxidantes de embelin, estudou-se os seus efeitos sobre a geração de estresse oxidativo em células A549. As ROS intracelulares gerados pelo embelin foi detectada por um aumento na fluorescência de DCF intracelular (Fig. 6). Embelin (15 uM) induziu a produção de ROS em uma forma dependente do tempo com cerca de 5 e 10 vezes o aumento em relação a controlos não tratados até ao fim de 2 e 4 h, respectivamente (Fig. 6). O pré-tratamento das células com o anti-oxidante, FeTMPyP (10 uM) ou N-acetil-L-cisteína (NAC) (10 mM), induziu-embelin DCF coloração inibiu significativamente a que dos valores de controlo (Fig. 6).
células A549 (a) foram pré-tratadas com ou sem FeTMPyP (10 uM) ou NAC (10 mM) durante 1 h seguido de embelin (15? M) durante 4 h e a produção de ROS foi detectado por coloração com DCF, como descrito em «Materiais e Métodos» seção. fluorescência celular foi capturado usando um microscópio de fluorescência invertido Olympus-IX71 equipado com configurações de filtro FITC. (B) A intensidade média de fluorescência a partir de três diferentes campos de visão foram obtidos utilizando o software ImageJ. * Indica P 0,05 quando comparado com o controle e # indica p . 0,05, em comparação com células embelin tratada
Foram avaliados ainda mais o efeito de ROS em sinalização MAPK, na presença e ausência de induzida por embelin o antioxidante, FeTMPyP (Fig. 7). Os resultados indicam que embelin ROS induzida é responsável pelas alterações observadas nos níveis de proteína de fosfo-p38, JNK e ERK 1/2 como pré-tratamento de células com FeTMPyP anulou este efeito (Fig. 7A). De acordo com os resultados acima, o pré-tratamento de células com FeTMPyP (10 uM) também inibiu os efeitos apoptóticos de embelin indicando que alterou a sinalização da MAP-cinase, devido à aumentada de ROS desempenha um papel crucial na apoptose induzida por embelin (Fig. 7B).
as células A549 foram pré-tratadas com ou sem o antioxidante FeTMPyP (10 uM) durante 1 h seguido de embelin (15 uM) de tratamento, durante 4 h. (A) os níveis celulares de ERK total e fosforilada 1/2, p38, JNK e 1/2 tubulina foram detectadas por Western Blot seguido por detecção por quimioluminescência, conforme descrito na secção “Materiais e Métodos”. (B) Em condições experimentais semelhantes como (A), celular atividade da caspase-3 foi medida como descrito na secção “Materiais e Métodos”. Os dados apresentados são a média ± DP de três experiências separadas. * Indica p 0,01 em comparação ao controle e # indica p 0,05 em comparação com embelin células tratadas
Discussão
No presente estudo, relatamos que o estresse oxidativo induzido MAPK. sinalização desempenha um papel importante na apoptose induzida embelin. Análise do perfil de expressão de genes por microarrays estudos indicaram o possível envolvimento da via da MAP cinase em células A549 tratadas com embelin durante 4 h. O pré-tratamento de células com inibidores específicos de p38, quer da JNK ou embelin inibiu significativamente a activação induzida por caspase-3, bem como alterações anulado embelin-induzidas nos níveis de fosforilação de p38, JNK e ERK MAP quinases 1/2. espécies reactivas de oxigénio (ROS) parece desempenhar um papel de charneira entre embelin e via da MAP quinase. Todos os efeitos observados de embelin não são devidos à inibição de XIAP como tratamento das células com células péptido SMAC-N7-Ant permeável, que se liga ao domínio de BIR3 de XIAP não afectou a activação celular da caspase-3.
O produto natural, embelin, tem sido dada mais atenção nos últimos tempos por suas propriedades anticancerígenas. Mais importante, foi demonstrado ter mais selectividade para as células cancerosas em comparação com as células normais (6). Mesmo no presente trabalho, observou-se uma tendência semelhante, e uma diferença significativa no IC
50 valores de embelin era evidente entre câncer de pulmão e linhas de células normais (Fig. 1). Embora embelin foi inicialmente identificado como sendo um inibidor de XIAP, por meio da sua interacção no domínio BIR3, estudos posteriores demonstraram
in vitro
efeitos directos de embelin sobre a fosforilação oxidativa mitocondrial, inibição de 5-lipoxigenase (5 -lo) e microssomal prostaglandina E2 sintase-1 (mPGES) -1 e a inactivação do inibidor do activador do plasminogénio-1 (PAI-1) [10], [11]. No entanto, a identificação do alvo intracelular principal que é responsável para a propriedade anti-cancro de embelin pode eventualmente ajudar no refinamento estrutural da embelin para melhorar a sua eficácia e selectividade.
Recentemente, vários estudos têm sido realizados com a compreender modo de acção do embelin e foi demonstrado ter um papel importante na inactivação do NF-kB, a inibição da STAT3 a sinalização através da proteína tirosina fosfatase PTEN, desestabilização lisossomal e AKT e vias mTOR [8], [9], [15] , [30], [31]. No entanto, se todos os efeitos observados são interdependentes ou independentes um do outro não é ainda claro que muitas das experiências relatadas foram realizadas a uma duração fixa de 24 ou 48h [8], [10], [16], [17 ].
dados de estudos de microarranjos durante as fases iniciais de embelin apoptose induzida nos apontou as mudanças na regulação dos fatores de transcrição a jusante MAPK proteínas (Fig. 3). No presente estudo, nós identificamos um papel proeminente da via da MAP-quinase, (níveis aumentados de fosfo-p38 e fosfo-JNK) na apoptose induzida por embelin.