Abstract

carcinoma da próstata é o câncer mais comum em homens com poucos, quantificáveis, biomarcadores. Prostate descoberta de biomarcadores de câncer tem sido dificultada devido à análise subjetiva da expressão da proteína em secções de tecido. Uma abordagem imuno-histoquímica imparcial, quantitativo fornecido aqui, para o diagnóstico e estratificação de câncer de próstata pode superar este problema. Os anticorpos contra quatro proteínas BTF3, HINT1, NDRG1 e ODC1 foram usados ​​em uma matriz de tecido da próstata ( 500 núcleos de tecido individuais a partir de 82 pacientes, os pares de 41 casos combinados com um paciente em cada par tinha recorrência bioquímica). A expressão de proteína, quantificados de forma imparcial utilizando um protocolo de análise automática no software ImageJ, foi aumentada em vs maligno da próstata não maligno (por 2-2,5 vezes, p 0,0001). Características de operação indicar a sensibilidade na gama de 0,68-0,74; combinação de marcadores em um modelo de regressão logística demonstra melhoria no poder de diagnóstico. imunofluorescência Triplo-marcado (BTF3, HINT1 e NDRG1) em arranjo de tecido mostraram uma significativa (p 0,02) a mudança nos coeficientes de co-localização para BTF3 e NDRG1 co-expressão em recidiva bioquímica vs epitélio câncer não-recaída. BTF3, HINT1, NDRG1 e ODC1 poderia ser desenvolvida como biomarcadores específicos epiteliais para o diagnóstico e estratificação de câncer de próstata tecido base.

Citation: Symes AJ, Eilertsen M, Millar M, Nariculam J, Freeman A, Notara M, et al. (2013) Análise Quantitativa de BTF3, HINT1, NDRG1 e ODC1 proteína sobre-expressão no tecido do cancro da próstata humana. PLoS ONE 8 (12): e84295. doi: 10.1371 /journal.pone.0084295

editor: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de agosto de 2013; Aceito: 13 de novembro de 2013; Publicação: 27 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Symes et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado pela caridade Cancer Research Centre da próstata e Confiança de São Pedro. Os autores são gratos a Mike Millar, Sheila MacPherson e Nancy Evans, da Universidade de Edimburgo para ajudar com coloração e Daniel Ciantar, UCL para Huygens o uso do software. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma da próstata é uma doença do epitélio, o câncer mais comum em homens ea causa de morbidade e mortalidade consideráveis ​​[1]. Cada ano, mais de 30000 homens são diagnosticados de cancro da próstata e mais de 10.000 morrem da doença no Reino Unido. Em 2010, 217,730 novos casos de cancro da próstata foram diagnosticados em os EUA, com 32.050 homens americanos morrem da doença [2].

O diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata é baseada na morfologia do tecido de biópsias (~ 1 milhão de procedimentos nos EUA e ~ 70.000 no Reino Unido /ano). Primeira biópsias tempo identificar o cancro em 38% dos casos, enquanto o diagnóstico equívoca ou falsos negativos constituem ~ 25-30% dos casos de [3]. Descritores de agressividade (por exemplo Gleason grau) determinar a gestão e tratamento do câncer, mas têm desvantagens significativas e de alta variância, particularmente para cancros de baixo grau. A imuno-histoquímica (IHQ) é utilizado na resolução de diagnóstico equívoco, no entanto, a maioria dos biomarcadores IHC foram identificados utilizando análise subjectiva (pontuação) introdução de uma grande variabilidade [4]. Para confinado ao órgão biópsia doença da próstata permanece uma ferramenta clínica crítica, no entanto, existe uma necessidade de resolver falsos negativos e refinar diagnóstico. Ao identificar cânceres que têm bom prognóstico sobre-tratamento pode ser reduzido, mas não há marcadores proteicos quantitativos para melhorar a qualidade do diagnóstico. Uma abordagem reprodutível, quantitativo poderia facilitar muito esse processo.

A descoberta de marcadores IHC, em grande parte, e sua análise, é conduzida por métodos quantitativos semi (por exemplo, marcação de secções de tecido manchadas com um cromossomo ou fluoróforo) com erros inter-observadores grandes [4,5]. Pontuação da intensidade de um cromóforo (ou fluoróforo) envolve inspecção visual seguido por uma pontuação dentro de um intervalo pré-determinado pelo experimentador. Uma abordagem baseada na observação visual dos objetos modelados como tecidos de mamíferos, com uma arquitectura distinta, ou assesment visual da intensidade de um sinal de luz como se fez para IHC pontuação, implica com severas limitações de percepção de iluminância e julgamento, em geral [6] e para a avaliação de carcinoma da próstata, especificamente [7]. Uma outra desvantagem da utilização de uma abordagem de pontuação subjectiva é que a selecção de proteínas-alvo a serem investigados gravita para os extremos (seja altamente expresso em cancro (por exemplo EZH) ou ausente no cancro (por exemplo, citoqueratinas 5 e 6). Isto significa que um grande número de alterações biológicas significativas que inevitavelmente ocorrem dentro desses extremos não são apanhados e não podem ser utilizados para a compreensão dos mecanismos da carcinogénese ou desenvolvidos como biomarcadores para o diagnóstico, ou estratificação ou prognóstico de cancro. quantitativa IHC [8] pode identificar novos biomarcadores de uma maneira imparcial, reproduzível, e em conjunto com sondas fluorescentes podem ser úteis para o último. é provável que não apenas a expressão, mas o co-localização de duas ou mais proteínas podem também mudar como resultado de doença ou de tratamento [9, 10]. Um pré-requisito para o prognóstico da doença com base em critérios moleculares, em vez de morfológicas, também requer detecção robusta e reprodutível de expressão de proteínas em secções de IHC que poderia ser seguido pela quantificação alterações co-localização em imunofluorescência [10].

Em um estudo anterior, desenvolvemos um método semi-automático, quantitativo para medir a expressão de Wnt5a no tecido da próstata [8] em uma matriz de tecido da próstata ( 500 núcleos de tecido de 82 pacientes, os pares de 41 casos pareados com um paciente em cada par tinha recorrência bioquímica). O objectivo deste estudo foi para utilizar a abordagem quantitativa IHC para avaliar se este método poderia ser utilizado para identificar os marcadores de cancro putativo para efeitos de diagnóstico. Nós escolhemos quatro genes BTF3, NDRG1, HINT1 e ODC1 que são up-regulamentados no carcinoma da próstata (oncomine.org; critérios de selecção: p = 0,0001, 2 mudança vezes e em 10% dos genes sobre-expressos no conjunto de dados global) em pelo menos, quatro vs normal conjuntos de dados de análise de expressão de genes do cancro da próstata [11-14]. Utilizou-se imuno-histoquímica quantitativa [8] para mostrar que a expressão de BTF3, HINT1, NDRG1 e proteínas ODC1 está aumentada em tecido de cancro da próstata e podem servir como alvos putativos para a investigação de carcinogénese ou biomarcadores para a doença. Em seguida, empregou um método de imunofluorescência quantitativa para estratificar o câncer de próstata utilizando coeficientes de co-localização de BTF3, HINT1 e NDRG1.

Resultados

análise imuno-histoquímica quantitativa de proteínas sobre-expresso em tecido de câncer de próstata

Expressão de BTF3, HINT1, NDRG1 e ODC1 foi em grande parte epitelial maligna e aumento em comparação com núcleos benignas da próstata ou não-maligna (Figura 1). Foram quantificados o DAB-label em tons de cinza (Figura 1 e Figura S1), de uma maneira imparcial, usando uma análise de partículas reprodutível, semi-automatizado (Analisar Partículas) protocolo [8] o uso de imagens em tons de cinza do tecido manchado de mais de 450-500 núcleos individuais de tecido da próstata para cada biomarcador (Figura 2). Os cálculos de área total e fracção de área são apresentados na Tabela 1. A integração da AUC revelou um aumento na expressão de BTF3, HINT1, NDRG1 e ODC1 em núcleos malignas, diagnosticada por histopatologia, em comparação com núcleos não-malignos (p 0,0001, Mann Whitney U). Estes resultados identificam BTF3, HINT1, NDRG1 e ODC1 como proteínas que são sobre-expressos em câncer de próstata.

(de mais de 500 núcleos de tecidos manchados para cada anticorpo) a partir de matrizes de próstata humana. Estes são representantes de mais imagens 450-500 núcleo tecido analisado para cada anticorpo biomarcador utilizando o protocolo de análise de imagem automatizado (ver Materiais e Métodos – Análise de partícula de imagem). Cada núcleo foi fotografada usando um microscópio vertical Leica (10x) e salva como um arquivo jpg. Cada imagem foi utilizada para calcular a expressão da proteína (etiqueta DAB, marrom, em grande parte nas células acinares). imagens a cores RGB (A-H) foram convertidos no correspondente imagens em tons de cinza (I-P) para a quantificação do sinal DAB usando Analise protocolo de partículas em software ImageJ obter Área Total coradas, em pixel. a expressão da proteína para BTF3, HINT1, NDRG1 e ODC1 foi aumentada em v núcleos benignas malignas (p 0,0001).

Um protocolo imparcial, automatizado foi usado para calcular Área Total manchado (em pixel) padronizado para quantidade de tecido em cada núcleo (ver Métodos). TA é convertido para fração de área (área total dividido pelo total de pixels na imagem). Cada bin são dados para um indivíduo, maligna (vermelho) ou tecido não maligno núcleo (verde). Há um aumento significativo na AUC da expressão da proteína no tecido prostático maligno v não-maligna (p 0,0001).

Protein

Estado (

n

)

Área Total

fração de área

*

Fold aumento

BTF3Benign ( 236) 22301 ± 16.971,66 ± 0.12Malignant (228) 54750 ± 35.884,09 ± 0,27

2.5HINT1Benign (214) 28564 ± 18.822,13 ± 0.14Malignant (225) 67173 ± 39.774,93 ± 0.292.3NDRG1Benign (230) 27752 ± 18.752,07 ± 0.14Malignant ( 223) 72297 ± 43805,4 ± 0.332.6ODC1Benign (261) 38621 41842,80 ± ± 0.31Malignant (243) 65428 53894,88 ± ± 0.41.8Table 1. a quantificação da expressão de proteínas em tecidos arryas malignas e não-malignas humanas da próstata utilizando o software ImageJ

rótulo DAB, o que representa a expressão da proteína para BTF3, HINT1, NDRG1 e ODC1 foi quantificado de uma maneira imparcial, usando, uma análise de partículas semi-automatizado reprodutível (Analisar partículas) protocolo com software ImageJ. Mais de 500 núcleos de tecido da próstata individuais (ver métodos) imagens RGB foram convertidos em 16 bit em tons de cinza. Os resultados são médias ± SE dos parâmetros calculados de área total e fração de área. Estes dados são normalizados para a quantidade de tecido em cada núcleo utilizando o protocolo inversa em ImageJ (ver métodos). Fold aumento na expressão de proteínas em lesões malignas em comparação com não-malignas núcleos (benigno) foi confirmada por cálculos de AUC de dados da Figura 2. (n) = número de núcleos utilizáveis ​​incluídos na análise.

*

Análise estatística: expressão, para todas as proteínas, é significativamente diferente, em comparação com maligno da próstata não maligno em P 0,0001 utilizando o teste U de Mann Whitney. CSV Baixar CSV

Para investigar a utilidade das proteínas como biomarcadores putativos para o diagnóstico do câncer de próstata, foi calculado a verdadeira taxa positiva (sensibilidade) e taxa de falsos positivos (1-especificidade) pela curva ROC (Figura 3). Os dados fração de área foi transformada em probit e equipado com uma função de Gauss. Os valores AUC de 1,0 para uma curva de ROC representam uma elevada selectividade e sensibilidade, ao passo que 0,5 sugere que o marcador testado não pode distinguir entre as categorias não-malignas e malignas. Os gráficos de pontos dos dados transformados são dadas na Figura S2. Sensibilidade e uma especificidade foram calculados para os valores da fração de área para NDRG1, BTF3, HINT1 e ODC1 (Tabela S1). limiar fixo (critérios ) valores para biomarcadores putativos para a gama de diagnóstico entre 0,68 e 0,74 (Tabela S1), indicando alta sensibilidade para NDRG1, BTF3 e HINT1, como marcadores de diagnóstico para identificação de câncer de próstata em núcleos de tecido por imparcial imuno-histoquímica, quantitativa. razão de verossimilhança positiva (LR +) para cada biomarcador nos critérios designados (Tabela S1) variou de 1,7 a 2.4. Uma razão de probabilidade de maior do que 1 indica que o resultado está associada com a presença da doença [15]. NDRG1, BTF3 e HINT1 também mostrou LR + de 10 em vários critérios pontos de corte; LR + s superior a 10, para um teste de diagnóstico, são considerados fornecem fortes evidências para governar na doença [15,16]. O poder diagnóstico foi reforçada pela incorporação de dados de dois biomarcadores em um modelo de regressão logística (Tabela 2). os graus de Gleason 4 + 3 + 4 e 3 fez-se 80% das amostras de tecido maligno dispostos sobre a matriz de tecido (entre 221-241 núcleos dos tecidos, ver Tabela S2). Não houve diferença significativa na expressão dos quatro biomarcadores quando segregado por análise com base Gleason de grau. (4 + 3 + 3 e 4; Figura S3)

curva ROC demonstra o desempenho discriminador da expressão da proteína no a diferenciação entre núcleos de tecido maligno e não-malignas que utilizam a fracção da área (probit) para dados BTF3, HINT1, NDRG1 e ODC1. Os valores de características de operação são dadas na Tabela S1. A linha sólida representa a área de ROC de 0,5. combinação

Protein

% dos casos corretamente identfied *

BTF 3 e HINT172BTF3 e NDRG178BTF3 e ODC193HINT1 e NDRG181HINT1 e ODC185NDRG1 e ODC197Table 2. Modelo de regressão logística para identificar combinação de marcadores que podem melhorar o poder de diagnóstico.

um modelo de regressão logística foi utilizado usando o software MedCalc para analisar a relação entre uma variável dependente dicotômica (v não-malignas maligno) e uma ou mais variáveis ​​independentes (dois biomarcadores). Os resultados (percentagem de casos correctamente identificados) sugere que, dentro do grupo de amostras utilizadas neste estudo, o poder de diagnóstico para a identificação de casos malignos é aumentada com a combinação de BTF3 e ODC1 e NDRG1 e ODC1. * O nível de significância do ajuste global do modelo para a análise de todas as combinações é p 0,0001. CSV Baixar CSV

estratificação doença usando múltiplos marcadores e imunofluorescência

Estima-se que cerca de 30% dos pacientes submetidos à prostatectomia radical para a doença clinicamente localizada experimentará recidiva bioquímica (definido como PSA detectável ≥ 0,2 ng ml

-1 dentro de 2 anos de cirurgia). Uma coorte de pacientes utilizados para a matriz do tecido, neste estudo, tinha sofrido recidiva bioquímica [17]. Colocámos a hipótese de que não apenas de uma alteração na expressão, mas também co-localização dos biomarcadores identificadas alterações no epitélio do cancro da próstata. Este foi investigada por coloração de imunofluorescência multi-rotulados usando BTF3, HINT1 e anticorpos NDRG1 (Figura 4). Os 3 proteínas foram diferencialmente expressos em não-maligna (Figura 4A) em comparação com (Figura 4B) núcleos maligna e verificou-se ser em grande parte no epitélio da próstata, o que confirma os dados de anticorpos individuais coloração com 3,3-diaminobenzidina-peroxidase de rábano ( DAB-HRP, Figura S1 e Figura 1). Estes resultados indicam não só que a expressão destas proteínas biomarcadores, individualmente, é aumentada no cancro da próstata (Figura 2), mas que a expressão é em grande parte epitelial e, portanto, específica para o processo da doença (Figura 4).

Co-expressão de três proteínas BTF3 (FITC-verde), HINT1 (Cy3- azul) e NDRG1 (Cy5-vermelho) em não-malignas (A) e núcleos de tecido da próstata malignas (B); imagens são núcleos de tecido representativo da matriz de tecido com mais de 200 amostras. Os três anticorpos foram incubados simultaneamente e marcada com Cy5 -vermelho três diferentes fluoróforos utilizando cola sistema automatizado de coloração. núcleos de tecido inteiras foram fotografadas usando um sistema confocal Leica e azulejos 4×4 em exatamente as mesmas configurações para comparação. As imagens foram ampliadas 3x usando o zoom digital em ImageJ. Barra de escala = 100 um

O co-localização de BTF3, HINT1 e NDRG1 estava ao lado investigada nos imunofluorescência núcleos múltiplos marcado com tecido de recaída e pacientes não-recaída de imagens fluorescentes compósitos (Figura 5.; BTF3, HINT1 e NDRG1, verde, azul e vermelho, respectivamente), a fim determinar a utilidade desta abordagem para a estratificação de câncer de próstata. Há uma evidente mudança e quantificável no padrão de coloração desses biomarcadores de proteínas em amostras de tecido recaída bioquímicos: Expressão BTF3 parece menos em uma recaída, em comparação com amostras não recaída, enquanto HINT1 e expressão NDRG1 aparece dominante em amostras de tecido recidiva (tecido representativo núcleos de pacientes de recaída e de controlo bioquímicos são mostrados na Figura 5A e B); análise de co-localização quantitativa de alta ampliação deconvoluídos imagens (Figura 5C e D) mostrou que a maioria da alteração aparente no padrão de expressão, para secções de multi-rotulados de tecido em não-recidiva vs amostras recidiva, foi devido à mudança na co-expressão de BTF3 (isotiocianato de fluoresceína, FITC, verde) e HINT1 (cianina 3, Cy3, azul). coeficientes de Pearson calculado para uma co-localização de não-recaída vs recaída foram 0,73 ± 0,02 vs 0,60 ± 0,07 (média ± DP, n = 4, a significância das diferenças p 0,02). co-localização quantitativa indica que aproximação multi-etiquetagem pode ser utilizado para a estratificação de cancro da próstata em núcleos de tecido.

co-expressão de três proteínas BTF3 (FITC-verde), HINT1 (Cy3- azul) e NDRG1 (Cy5 -vermelho) em núcleos de tecido de próstata maligna (a a D). micrografias compostas de núcleos de tecido da próstata imunofluorescência manchadas de pacientes com recidiva bioquímica (definido como PSA ≥ 0,2 ng /ml dentro de 2 anos de prostatectomia radical). núcleos de tecido de 4 pacientes (pares combinados para pontuação de Gleason e PSA), não-recaída (A) e recidiva bioquímica (B) imagens representativas usados ​​para análise quantitativa co-localização (ver métodos) são mostrados. A visualização foi realizada utilizando um microscópio confocal Leica; A e B são pequeno aumento; C e D maior ampliação; E é um exemplo da expressão dos três marcadores em tecido não maligno também em maior ampliação. A expressão de BTF3 (verde), por exemplo, é evidente em amostras não recidiva ao passo que não é muito evidente em núcleos de pacientes recidivantes. Imagiologia foi realizada utilizando um microscópio Olympus confocal (40x de azulejos (A e B) ou 40x com zoom digital 3,5-4 (C, D e E). Imagens de alta ampliação (C, D e E) foram deconvolved usando software Huygens profissão. 16bit TIF para cada fluoróforo (FITC, Cy3 e Cy5) foram importados para ImageJ e pseudo colorida (FITC, verde, Cy3, azul e Cy5, vermelho). Z-projeções para até 27 imagens são mostradas para cada núcleo tecido barra de escala. = 100 um de a e B e 20 um para C e D. análise quantitativa de co-localização de imagens (por exemplo, Figura 5C e D) mostrou que a maior alteração significativa no padrão de expressão, em não-recidiva vs amostras recidiva, foi devido à mudança de co-expressão de BTF3 (FITC, verde) e HINT1 (Cy3, azul) com coeficientes de Pearson para uma co-localização de não-recaída vs recaída = 0,73 ± 0,02 vs 0,60 ± 0,07 (média ± DP, n = 4, a significância das diferenças p 0,02).

Discussão

ao usar análise de expressão gênica global, tremendo progresso tem sido feito na identificação de genes desregulados no câncer de próstata ao longo da última década. O que tem faltado é a tradução destes genes em biomarcadores clinicamente úteis para o diagnóstico e a estratificação da doença. próstata humana foi um dos primeiros tecidos a ser investigado por mudanças globais no gene-expressão na doença há quase uma década. Aliás, a aprovação de novos marcadores por Food and Drug Administration, EUA, particularmente marcadores de proteínas, tem diminuído ao longo da última década. Este declínio pode ser atribuído a três grandes problemas na identificação e desenvolvimento de biomarcadores de proteína de tecido base para o diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata: 1. Falta de especificidade, ou seja, não epitélio específico (o local de início da doença) 2. Falta de uma análise imparcial, automatizado, quantitativa da expressão da proteína que pode identificar dados robustos, reprdoucible de biomarcadores putativos 3. Falta de abordagens quantitativas, proteômicas para para uma base molecular de prognóstico do câncer de próstata.

marcadores poderiam ser extremamente útil no diagnóstico primário ou confirmação de apoio à histopatologia, mas devido às dificuldades de identificação ou validação [18] apenas um punhado de tais marcadores existe. Parece também provável que a análise histopatológica continuará a ser um baluarte para o diagnóstico de câncer de próstata no próximo futuro a médio. Assim, em adição à pesquisa para a identificação de biomarcadores não invasivas que podem ser detectados nos fluidos corporais continuada, é importante para manter a refinação e melhorar os biomarcadores tecido imunoquímicos que poderia facilitar o diagnóstico, melhorar o prognóstico e fornecer estratificação preditivo útil de cancro da próstata. Devido ao aumento do poder de computação na última década duas tecnologias amadureceram que poderia ajudar a alcançar estes objectivos. Estes são discutidos abaixo.

A análise morfológica é rotineiramente utilizada para diagnosticar cancro da próstata, apesar de IHC é utilizada para auxiliar no diagnóstico morfológico, particularmente em casos duvidosos, v.g. em amostras de tecidos a partir de biópsias de agulha, as amostras de ressecção transuretral e amostras de tumores metastáticos [19]. Uma questão que complica dificultando a descoberta de novos biomarcadores para o diagnóstico e doença estratificação da próstata (e outros) cancro (s) a partir de amostras de biópsia, tem sido uma carência de métodos imparciais, quantitativos para detectar mudanças significativas dos experimentos IHC para a identificação de biomarcadores. Há, no entanto, algumas excepções a esta abordagem. Rubin e seus colegas [20] concebeu uma abordagem quantitativa para identificar α-methylacyl-CoA racemase (AMACR). Estudos iniciais mostraram expressão quase uniforme desta proteína em tecidos cancerosos, mas no posterior análise da expressão foi encontrado para ser menor e, com reserva, esta proteína é utilizada como um marcador de diagnóstico.

Para abordar a questão de polarização e dependência de apreciação subjectiva da expressão de um dado biomarcador, foi desenvolvido um método, livre de preconceito experimentador, para quantificar a expressão da proteína no cancro da próstata [8], utilizando um software livremente disponível [21]. Ao contrário dos métodos de pontuação, convencionais (por exemplo, de coloração DAB) para estimar expressão em arranjos de tecido, a nossa abordagem permite a quantificação imparcial do sinal total DAB. Embora quantificar sinal total DAB pode não ser ideal, através da padronização de medição de sinal e eliminar pontuação arbitrária identificamos BTF3, NDRG1, HINT1 e os níveis de proteína ODC1 a ser sobre-expresso em carcinoma da próstata, quantificável e reprodutível, confirmando o gene sobre-expressão observado a partir de nossa lista gene preliminar. características operacionais (Figura 3 e Tabela S1) para BTF3, HINT1 e NDRG1 mostrar AUC de 0,71-0,76; uma AUC de 0,7 é considerado aceitável para um marcador de diagnóstico [22] o que indica que, individualmente, estes são biomarcadores adequados de doença. O poder de diagnóstico pode ainda ser melhorada quando estes marcadores são analisados ​​para poder diagnóstico agregada (Tabela 2). Além disso, BTF3, NDRG1 e HINT1, em quantitativos estudos de co-localização (Figura 5) parecem ser capazes de discriminar entre recidiva bioquímica e câncer de próstata não-recaída. Os biomarcadores aqui identificadas são novos para a sua utilização no diagnóstico e também nas combinações descritas para a recaída bioquímico de cancro da próstata. Os possíveis mecanismos pelos quais estes biomarcadores putativos de carcinoma da próstata podem contribuir para a carcinogénese são discutidos abaixo.

BTF3 é uma proteína de 27kDa, que forma um complexo estável com o ARN polimerase II B e é necessária para a iniciação da transcrição [23] e conhecida a ser sobre-expressos em células de carcinoma ductal pancreático tanto

in vitro Comprar e

in situ

[24]. NDRG1 (anteriormente conhecido como

Cap43

), um gene de resposta ao estresse, tem sido implicada em vários processos celulares na saúde e na doença. Ao contrário da expressão de outros biomarcadores aqui apresentados, a expressão do NDRG1 tem sido investigado no tecido prostático, mas é um assunto de controvérsia com relatos de que seja aumentado [25] e diminuiu [26] no cancro da próstata. É importante notar, contudo, que nenhum destes estudos empregou uma técnica quantitativa imparcial e, por conseguinte, a análise de expressão pode ser a razão para estas discrepâncias.

Temos demonstrado anteriormente que a via de sinalização Wnt desempenha um importante papel câncer de próstata [8,27]. NDRG1 também foi mostrado para influenciar a sinalização Wnt e há um

prima facie

caso para o envolvimento de NDRG1 na regulação da sinalização Wnt em linhas celulares de cancro da próstata [28]. NDRG1 gene é também um parceiro de fusão ETS-família no cancro da próstata ERG-expressando mas ao contrário TMPRSS2-ERG e SCL45A3-ERG fusões, prevalente em cancros da próstata, a fusão NDRG1-ERG Pensa-se que codificam para uma proteína quimérica [29]. Não existe nenhuma informação sobre a expressão da proteína NDRG1 no câncer de próstata; Verificou-se ser fundido com ERG ou não, NDRG1 poderia ser um biomarcador proteína útil para o cancro da próstata.

HINT1 pertence à tríade histidina (HIT) da família e uma proteína-quinase C que interage proteína [30]. Não existe qualquer informação sobre a expressão ou função HINT1 no cancro da próstata, embora possa actuar como supressor de tumor em ratos [31]. Numa linha celular de hepatoma, HINT1 inibe a actividade de Wnt /beta-catenina sinalização e a transcrição de genes através de TCF4 [32]. Mostrámos, anteriormente, que há uma supressão de SS-catenina transcrição do gene /TCF4 mediada de alvos de transcrição TCF4 [8]. É tentador especular que HINT1 pode contribuir para a inibição da sinalização de Wnt /beta-catenina no câncer de próstata [8].

L-ornitina descarboxilase 1 (ODC1) é uma enzima na via de síntese de poliamina [33] um factor-chave na proliferação de células normais e o crescimento neoplásico. ODC1 foi identificado como um marcador genético para o cancro do cólon [34] e a sobre-expressão de ODC1 tem sido associada a neuroblastomas de alto risco [35] e colo-rectais e da mama [36]. Estes dados correlacionam-se com

in vivo

experimentos com camundongos knock-out ODC1 que se desenvolveram menos tumores em resposta a vários promotores carcinogénicos em linha com o número reduzido de cópias do gene [37].

Nossos dados sugerem que o uso de uma abordagem imparcial, quantitativos para identificar biomarcadores específicos do epitélio em combinação com imunofluorescência pode ser útil no diagnóstico, estratificação e prognóstico do carcinoma da próstata.

Materiais e Métodos

array tecido da próstata

A seleção dos pacientes, estado da doença e construção detalhes de blocos de tecido são dadas em outros lugares [8,17]. Resumidamente, blocos de tecido foram construídos utilizando, espécimes de prostatectomia radical embebidos em parafina fixadas em formalina de arquivamento dos 82 pacientes com pT3a estágio patológico ou b e pré-operatório fase de PSA 3. 41 pares de casos foram pareados para as seguintes categorias: estágio patológico, grau Gleason e antígeno de concentração pré-operatório específico da próstata (PSA). Um paciente em cada par tinha recorrência bioquímica (definido como PSA ≥ 0,2 ng mL-1 dentro de 2 anos da cirurgia) ea outra permaneceu bioquimicamente livres de doença (definida como PSA indetectável pelo menos 3 anos após a cirurgia). Os núcleos foram diagnosticados (como benignos ou não-malignas e malignas) seções e marcada por um patologista e 5-6μm foram cortadas a partir dos painéis de tecido em lâminas revestidas. Para eliminar o preconceito, os pesquisadores estavam cegos para a coloração, tratamento de imagens e análise, com o último sendo automatizado (veja abaixo). detalhes clínicos de as amostras de tecido utilizadas são dadas na Tabela S2 e [17]; patologistas marcou a maioria das amostras ( 80%) na forma de Gleason de grau 4 + 3 + 4 e 3. Um cálculo do tamanho da amostra foi feita para diferenciar entre a sobre-expressão usando DAB-IHC; o tamanho da amostra para a expressão de proteínas foi calculada antes da construção da matriz de tecido (com um α e SS de 0,05 e diferença esperada de 2,5 dobras entre os meios de amostras malignas e não-malignas que ser 41 pacientes por grupo).

ética aprovação

a aprovação ética foi dada pelas comissões Joint UCL /UCLH sobre a ética da pesquisa com seres humanos. O conselho de revisão (RB) aprovou o uso de tecidos humanos para a investigação do cancro da próstata, em conformidade com o Comité Internacional sobre Harmonização de Boas Práticas Clínicas (ICH GCP). Para a construção de arranjo de tecido, as amostras foram anonimizados durante a construção das matrizes de tecido [17] e usado para vários estudos de imuno-histoquímica em um projeto aprovado pelo comitê de ética UCL /UCLH. O RB dispensou a necessidade de consentimento informado, porque as amostras utilizadas para arranjo de tecido eram amostras patológicas de arquivamento.

3,3-diaminobenzidina-peroxidase de rábano (DAB-HRP) coloração

Todos coloração foi realizada utilizando bond sistema automatizado de [8], de acordo com os protocolos do fabricante. Os detalhes do procedimento de coloração para IHC utilizando DAB e anticorpos (BTF3, HINT1, NDRG1 e ODC1) utilizados são dadas em Métodos S1.

imunofluorescência utilizando anticorpos 3 em matrizes de tecido da próstata

O protocolo para a coloração de imunofluorescência foi semelhante ao descrito para a coloração DAB, acima, excepto que BTF3, anticorpos HINT1 NDRG1 e incubadas simultaneamente com e coradas FITC, Cy5 e Cy3, respectivamente, de acordo com o protocolo do fabricante. As imagens foram adquiridas utilizando um microscópio confocal Leica 710 com o objetivo CE Plan-Neofluar (40x).

análise de partículas de imagem usando software ImageJ

Um, reprodutível, método de análise de partículas automatizado imparcial [8] foi utilizada para quantificar o sinal DAB sobre a não-maligno (benigno) e núcleos de tecido da próstata humana malignas utilizando o software ImageJ [21]. Macros foram escritos para executar a seguinte sequência de eventos para imagens JPEG adquiridas: 1. Abrir imagem 2. converter para 16-bit imagem limiar 3. Defina 4. Analisar partículas (Tamanho 0.5- Infinito, Circularity 0,00-1,00) 5. Guardar imagem 6. Guardar informações de partículas (contagem, área total, tamanho médio e fração de área) em uma planilha excel (rsb.info.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf). As unidades são de ajuste ImageJ padrão (pixels). Normalização para a quantidade de tecido por núcleo foi também quantificada utilizando a função inversa (imagem EditInvert) em ImageJ com o protocolo descrito acima. sinal quantificado DAB é expressa como sinal /quantidade de tecido em cada núcleo de tecido. Um diagrama de fluxo para a quantificação do sinal DAB é dada na Figura S1. Para todos os anticorpos testados, a expressão foi observada para ser em grande parte epitelial e análise também estava restrita à expressão epitelial; parâmetros limiar fixado foram escolhidos após análise manual de núcleos aleatórios para a quantificação subsequente do sinal. Uma planilha contígua para todos os núcleos utilizáveis ​​(entre 211 e 260 núcleos) para não-malignas vs comparação maligno, para diferentes anticorpos foi construído.