Abstract

rearranjos do gene ERG são encontrados em cerca de metade de todos os cancros da próstata. análises funcionais não explicam totalmente a pressão seletiva causando ERG rearranjo durante o desenvolvimento do câncer de próstata. Para identificar as alterações de transcrição no câncer de próstata, incluindo os tumores com rearranjos do gene ERG, foi realizada uma meta-análise sobre dados de expressão de genes publicados seguido de validações no mRNA e os níveis de proteína, bem como primeiras investigações funcionais. Oito estudos de expressão (n = 561) sobre os tecidos da próstata humana foram incluídos na meta-análise. alterações da transcrição entre o cancro da próstata e da próstata não-cancerosas, bem como rearranjo ERG positivo (+ ERG) e cancro da próstata rearranjo ERG-negativa (ERG-), foram analisados. Os resultados detalhados podem ser acessados ​​através de um banco de dados online. Nós validado a nossa meta-análise utilizando dados do nosso próprio estudo microarray independente (n = 57). 84% e 49% (fold-change 2 e 1,5, respectivamente) de todas as mudanças de transcrição entre ERG + e câncer de próstata ERG- determinados pela meta-análise foram verificados no estudo de validação. alvos selecionados foram confirmados por imuno-histoquímica: NPY e PLA2G7 (up-regulada no ERG + cânceres), e AZGP1 e TFF3 (down-regulada em cancros ERG +). Primeiras investigações funcionais para um dos genes associados ao rearranjo ERG mais proeminentes – neuropeptídeo Y (NPY) – revelou aumento da captação de glicose

in vitro

indicando o papel potencial do NPY na regulação do metabolismo celular. Em resumo, encontramos mudanças transcrição independente populacionais robustos no câncer de próstata e os primeiros sinais de rearranjos ERG induzindo alterações metabólicas em células cancerosas através da activação importante metabólica moléculas como NPY sinalização. Nosso estudo indica que as alterações metabólicas, possivelmente, contribuir para a pressão seletiva favorecendo rearranjos ERG no câncer de próstata

Citation:. Massoner P, Kugler KG, Unterberger K, Kuner R, Mueller LAJ, Fälth M, et al. (2013) Caracterização de transcrição Mudanças no ERG Rearranjo-positiva do cancro da próstata Identifica o Regulamento de Metabolic sensores como neuropeptídeo Y. PLoS ONE 8 (2): e55207. doi: 10.1371 /journal.pone.0055207

editor: Hari Koul, University of Colorado, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de agosto de 2012; Aceito: 27 de dezembro de 2012; Publicação: 04 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Massoner et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores reconhecer o apoio financeiro da Comet Centro Oncotyrol (Project 3.1), a província autónoma de Bolzano, Sudtirol, (Grant 37 /40,3), o austríaco Ciência Fundo FWF (Grant J3201) e do Fundo de Investigação tirolesa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: depois de discutir com Oncotyrol , Centro de Personalized Cancer Medicine GmbH, os autores gostariam de divulgar o seguinte: PM, KU e HK realizado este trabalho como funcionários /associados de Oncotyrol GmbH. O trabalho para este projecto foi co-financiado pelo Oncotyrol GmbH, no âmbito do programa de financiamento COMET austríaca. O Oncotyrol GmbH não planeja registrar uma patente ou comercialmente perseguir os resultados contidos neste manuscrito. Consequentemente qualquer interesse competindo puderam ser identificados no contexto do trabalho descrito. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Cerca de metade de todos os cancros da próstata abrigar um rearranjo de genes [1]. A última é formada por fusão de 5 ‘elementos reguladores de um gene regulado por androgénio para a região de codificação de um membro da família do gene da E vinte e seis (ETS) de factores de transcrição.

ETS

rearranjos resultar em andrógeno-driven sobre-expressão de fatores de transcrição ETS [1]. O rearranjo ETS mais comum é a translocação da regulada por androgénio transmembranar serina protease 2 (

TMPRSS2

) de genes, com o gene homólogo de v-ets vírus eritroblastose E26 oncogene (

ERG

) factor de transcrição representando cerca de 85% de todos os cancros da próstata ETS rearranjo-positivos [2] – [4]. ERG rearranjo é um evento precoce na gênese do câncer de próstata. Ele já está presente no câncer de próstata de baixo grau locais [5], [6] e persiste em tipos metastáticos e resistente à castração (CRPC) [1], [4], [7]. O aparecimento precoce ea alta frequência de rearranjos ERG indicam o benefício seletiva de células de rearranjo positivo no câncer de próstata.

Análises funcionais realizadas até agora não forneceram uma explicação abrangente para a pressão seletiva forçando ERG rearranjo nas fases iniciais de câncer de próstata. ERG rearranjo resulta em sobre-expressão do ERG [1]. Este último foi relatado para promover a migração e invasão de células de cancro, bem como desdiferenciação celular e transformação [8] – [11]. O papel do rearranjo ETS na progressão do câncer de próstata também não foi esclarecida. Enquanto alguns estudos indicam uma associação entre cânceres de rearranjo-positivas, tumores mais agressivos e um prognóstico pobre (ou seja, [12] – [14]), outros relatam este tipo de associação (ou seja, [15] – [17]); alguns até mesmo relatar um prognóstico favorável (ou seja, [18], [19]). Obviamente precisamos de mais informações sobre ETS cancros da próstata rearranjo-positiva, a fim de compreender a biologia do câncer de próstata.

A grande massa de dados de expressão gênica foi publicado desde o procedimento de análise de expressão utilizando microarrays foi estabelecida há mais de há uma década [20]. Estes estudos têm relatado uma variedade de alterações na expressão de genes associados com várias doenças, incluindo câncer de próstata. Validação da grande quantidade de dados obtidos a partir de experimentos de expressão gênica é um desafio. Apenas um pequeno número dos candidatos identificados foram funcionalmente validado. Estes dados estão longe de ser exaustiva e ainda contêm uma grande quantidade de informações a exploração aguardando. Meta-análises análises autorização combinada de estudos individuais, são menos influenciados pelos achados locais e permitir a redução dos dados para obter resultados robustos.

Nós apresentamos uma meta-análise sobre dados de expressão gênica publicados com vista a identificar transcricional mudanças no câncer de próstata. Nossa abordagem incluiu a comparação de câncer de próstata contra o tecido da próstata benigna e ERG rearranjo-positivo (ERG +) para cancros da próstata ERG rearranjo-negativo (ERG-). Nós validado os resultados da nossa meta-análise utilizando dados de um estudo microarray independente e confirmou alvos selecionados por imuno-histoquímica. Também realizamos investigações funcionais preliminares para um dos genes regulados mais proeminentes, ou seja, neuropeptídeo Y (NPY). Nossos resultados indicam que ERG-rearranjos possivelmente induzir alterações metabólicas em células cancerosas, ativando grandes moléculas metabólicas sinalização tais como NPY.

Materiais e Métodos

coortes de exemplo

As amostras de tecido usado para o meta-análise são descritos noutro local (estudos e referências na Tabela 1). As amostras de tecido para o estudo expressão de validação e imuno-histoquímico foram selecionados do biobanco cancro da próstata Innsbruck. Este biobank foi estabelecido no decurso do programa de detecção precoce do Tirol para o cancro da próstata no Departamento de Urologia da Universidade de Medicina de Innsbruck [21]. consentimento por escrito foi obtido de todos os pacientes e documentados no banco de dados do Hospital Universitário de Innsbruck, de acordo com as disposições legais e os requisitos do comitê de ética da Universidade de Medicina de Innsbruck. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Medicina de Innsbruck (Estudo nº. SOU 3174, a alteração 2). Coortes aqui analisados ​​foram os seguintes: a) estudo de validação Análise da expressão; 57 tecidos de câncer de próstata; GSC 5 N = 1, SGC 6 n = 5, n = 7 SGC 36, SGC 8 n = 3, 9 SGC n = 11, 10 SGC n = 1; A idade dos pacientes, a média ± desvio padrão (SD), 61,7 ± 6,9 anos; próstata no soro dos pacientes nível de antígeno específico (PSA), 7,4 ± 5,0 ng /ml. b) Estudo imuno-histoquímico; 93 tecidos de cancro da próstata, GSC 5 n = 19, n = 6 GSC 22, GSC 7 n = 32, n = 8 GSC 10, GSC 9 n = 10; A idade dos pacientes, a média ± desvio padrão (SD), 60,6 ± 6,4 anos; nível de PSA, 6,6 ± 5,4 ng /ml.

Meta-análise

Foram selecionados oito estudos de expressão, que compreende 561 tecidos da próstata humanos, para a meta-análise (Tabela 1, Figura S1). Estes estão listados na base de dados Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [22], uma matriz Express (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress) [23] e Oncomine (https://www.oncomine.org) [24]. Todos os estudos foram realizados utilizando a tecnologia Affymetrix microarrays.

Para a análise integrada de dados de microarranjos, dados brutos, como armazenados em arquivos CEL, foi normalizada usando o algoritmo gcRMA [25], [26]. Para obter informações detalhadas sobre o pré-processamento de dados específicos de estudo, consulte métodos suplementares. Para realizar uma comparação de estudo cruzado dos níveis de expressão do gene, gene sonda-definidos identificadores específicos da plataforma foram mapeados para um espaço de nomes comuns, como descrito anteriormente [27], [28]. Aqui os identificadores específicos da plataforma foram mapeados para identificadores Entrez Gene usando os mapeamentos de sondas /Entrez atuais de Biomart através do pacote Biomart [29]. Sempre que mais do que uma sonda-conjunto foi mapeado para um identificador de genes Entrez, foi usada a sonda-ajustou-se com a maior variância para análise. Para identificar genes diferencialmente regulados usamos uma abordagem em duas fases. Em primeiro lugar, derivados de valores de p combinado através dos estudos utilizando o método do qui-quadrado inversa de Fisher [30]. Em seguida, calculamos combinada (ponderada) prega mudanças. Em um estudo anterior, os autores usaram um teste de permutação para avaliar a significância [27]. Nós, por outro lado, a informação derivada a partir de uma distribuição do Qui-quadrado, tal como sugerido em [31]. Ver métodos suplementares para obter detalhes sobre os valores de p e cálculos fold-change. Funcional agrupamento anotação dos resultados da meta-análise foi realizada utilizando o banco de dados DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [32].

Validation Expression Analysis

Um independente dados de microarranjos set (GSE32571) gerados anteriormente por co-autores foi utilizado para validação da assinatura gene ERG-associado. Para as presentes análises, tecidos de cancro da próstata (n = 57) foram atribuídos aos grupos de ERG + ERG- e usando um marcador fluorescente para além quebra-ensaio de hibridação in situ (FISH), como descrito anteriormente [33]. As amostras de tecido foram isolados por macrodissection de criocortes de 10 uM. O ARN total foi isolado com o ARN EZ1 Mini Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante, verificada a sua qualidade utilizando o Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies), e quantificado. O ARN total foi preparado para hibridação em matrizes Ilumina humano Sentrix-12 BeadChip (Ilumina) de acordo com as recomendações do fabricante. dados de microarranjos Illumina foram processadas usando o pipeline de código aberto “Lumi” [34]. Após a normalização quantil, a expressão diferencial de genes foi determinada utilizando o pacote de R “limma” [35]. métodos detalhados e dados clínicos do estudo de validação de expressão são descritos em outros lugares [36]

Imunohistoquímica

Slides de tecido (n = 10) e microarrays de tecido (TMAs;. n = 92; diâmetro de 0,6 mm ) contendo o cancro (n = 3) e benigna (n = 1) foram usadas para núcleos de tecido da próstata de pacientes com cancro da próstata por análise imuno-histoquímica. Todas as amostras de tecido foram coradas para ERG. Nove amostras foram excluídas devido à sua pequena quantidade de tecido tumoral. 24 tecidos mostrou muito fraca ou heterogéneos coloração ERG, enquanto 69 tecidos com intermediária para a coloração ERG forte ou negativos foram atribuídos aos grupos ERG + e ERG-, respectivamente. 61 amostras de tecido foram utilizadas para comparação imuno-histoquímica de ERG + e ERG-. recuperação antigênica e imuno-histoquímica foram realizadas utilizando um sistema de slide-coloração automática Descoberta XT (Ventana Medical Systems). Todos os anticorpos foram testados alvo em uma micromatriz de tecido de teste contendo as amostras de tecidos humanos diferentes. coloração imuno-histoquímica foi avaliada por um experiente uropathologist (G.S.). condições de recuperação antigênica óptimas foram estabelecidas para todos os anticorpos alvo. anticorpos alvo, fornecedores, números de artigo, e as concentrações utilizadas foram como se segue: anti-AZGP1, Sigma, HPA-012582, 01:50; anti-ERG, Epitomics, EPR3864, 1:100; anti-GPR116, Imgenex, IMG-71635, 1:100; anti-neuropéptido Y, Abcam, ab30914, 1:200; anti-PLA2g7, Sigma, HPA-0035915, 1:400; anti-HPGD, Atlas, HPA004919, 1:75; anti-TFF3, Diagnósticos Estratégicos, 29.940.002, 1:5000. recuperação de antigénios para todos os anticorpos foi realizada pelo pré-tratamento térmico a 98 ° C durante 1 hora em CC1, um tampão à base de Tris com um pH ligeiramente básico. anticorpos alvo foram incubadas durante 1 hora a 37 ° C, seguido por detecção iView DAB (diaminobenzidina visualização, Ventana Medical Systems) e contrastação com hematoxilina. As imagens foram adquiridas utilizando um microscópio Axio Imager M1 (Zeiss) e software TissueFAXS (TissueGnostics). A análise imuno-histoquímica quantitativa foi realizada usando o software HistoQuest análise imuno-histoquímica (TissueGnostics), que é uma ferramenta baseado em células intensidade de coloração análise empregando um marcador de identificação celular nuclear (neste caso hematoxilina), seguido por análise quantitativa de um dado marcador marcado de uma forma diferente cor (neste caso marcação citoplasmática com diaminobenzidina, DAB, marrom).

experimentos de cultura celular

DU145, DUCaP, LNCaP, PC3 e VCaP são derivados de metástases do câncer de próstata. Estes foram adquiridas a partir da ATCC e cultivadas de acordo com as recomendações da ATCC. EP156T e RWPE-1 são células epiteliais imortalizadas benignas da próstata, ao passo que a CAF e PM151T são células estromais da próstata [37] – [39]. células benignas e de estroma foram cultivados como descrito anteriormente [37] – [39]. A identidade de linhas celulares de cancro foi confirmado por métodos de DNA fingerprinting forenses empregando o kit de amplificação AmpFlSTR® SGM Plus® PCR (Applied Biosystems).

As células foram semeadas em placas de 24 poços, privadas de soro, e tratou-se com 25 nM NPY recombinante /24 h (Sigma) por um período total de 48 horas. número total de células foram determinadas utilizando o contador de células CASY e sistema analisador (Schärfe System). Os níveis de glucose foram medidos em sobrenadantes de cultura de células que utilizam o sistema de monitorização de glucose celular Gluc (Thermo Fisher Scientific). qPCR e immunoblot foram realizados como descrito anteriormente [40]

Estatísticas

Os cálculos estatísticos para meta-análise e análise de expressão de validação foram realizados usando o R (http:. //www.r-project .org), pacotes de Bioconductor banco de dados de bioinformática de código aberto [41] e as funções da SENHORA [42].

Os cálculos estatísticos para imunohistoquímica e cultura de células experimentos foram realizados com o programa SPSS 18 para Windows. O teste de Kolmogorov-Smirnov foram utilizados para investigar a distribuição normal dos conjuntos de dados. Não-distribuídos normalmente dados e os dados com distribuição Gaussiana (normal) foram analisados ​​usando o teste-U de Mann-Whitney e o teste t de Student, respectivamente, a fim de calcular a significância das diferenças entre grupos. Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados significativos. As barras de erro nos histogramas representam o desvio padrão (SD) de um mínimo de três experimentos independentes.

Resultados

Meta-análise sobre dados publicados Gene Expression para o cancro da próstata

para investigar as mudanças na expressão do gene no câncer de próstata humano, foi realizada uma meta-análise de dados de expressão gênica publicados. Oito estudos independentes de microarray foram incluídos na meta-análise, que consistiu de 561 amostras de tecido de próstata (Tabela 1). As duas questões seguintes foram investigados: a) a comparação da expressão de genes em tecidos de câncer de próstata e tecidos benignas da próstata; e b) Comparação da expressão de genes em ERG rearranjo-positivo (ERG +) e rearranjo ERG-negativa (ERG-) cancros da próstata (plano de estudo na Figura 1).

meta-análise foi realizada em oito a expressão do gene independente estudos enfocando tecidos da próstata humanos. Foram utilizados dois tipos de análises comparativas. Genes que mostram ERG + e ERG- tecidos de câncer de próstata regulados diferencialmente foram validados utilizando uma análise independente expressão gênica (primeira validação) e coloração imuno-histoquímica (segunda validação; apenas para genes selecionados).

Os resultados de nossa meta -Análise estão apresentados nas Figuras 2A-B, e listados na Tabela S1A-B. Resultados da meta-análise e os estudos individuais também podem ser vistas on-line em https://prostatedb.eigenlab.net/. Em adição ao método do qui-quadrado menos conservadoras, que foi aplicado para derivar um valor de p resumo [31], a base de dados também lista um valor de p resumo mais conservadora derivada por uma abordagem permutacional [27].

genes diferencialmente regulados em cancro da próstata e no tecido da próstata benigna (a, C), e ERG + e tecido de cancro da próstata ERG- (B, D). A-B) parcelas vulcão. Diferencialmente genes regulados foram destacados quando pelo menos 2 vezes jusante (verde) ou sobre-regulada (vermelho), e tinha um p-valor ajustado inferior a 0,1. C-D) diagrama gráfico dos oito grupos funcionais topo do ranking determinadas pelo agrupamento anotação funcional, utilizando o banco de dados DAVID. O tamanho dos aglomerados de correlaciona com o número de proteínas identificadas associadas com anotação funcional (fold-change 1,5). Quando as proteínas estão presentes em mais do que um agrupamento, os agrupamentos estão ligados por linhas. A espessura das linhas de ligação reflecte o número de proteínas presentes em ambos os grupos ligados. Os dados relativos 561 amostras de tecido foram utilizados para a meta-análise. Tecidos de câncer de próstata

Em primeiro lugar, em comparação com tecidos benignas da próstata. No que diz respeito a genes, que foram, pelo menos, 1,5 vezes regulamentada e revelou um valor de p 0,1, verificou-se que 280 genes foram sobre-regulada (46 deles mais do que 2 vezes), enquanto que 275 genes foram regulados negativamente (mais 36 do que 2 vezes) em tecidos de cancro da próstata em comparação com tecidos benignos da próstata (Figura 2A, Tabela S1A). anotação funcional revelou que os genes diferencialmente regulados (fold-change 1,5) de código para moléculas sinalizadoras (trans-membrana e proteínas de sinalização extracelular), proteínas estruturais (proteínas do citoesqueleto e adesão celular) e as proteínas envolvidas na proteólise e cicatrização de feridas (Figura 2C) . As proteínas que se sabe estarem associados com o cancro da próstata (por exemplo AMACR [43], AGR2 [44], CRISP3 [45], HPN [46], HOXC6 [47], OR51E2 [48]), bem como proteínas não associados com o cancro da próstata assim longe (exemplos PPM1H, SLC4A4, CaMKK2) foram identificados na meta-análise.

Nós, então, comparada ERG + e tecidos de câncer de próstata ERG-. Não havia informações disponíveis sobre a situação rearranjo ERG das amostras de câncer de próstata utilizadas nos estudos de meta-análise. ERG rearranjo resulta em sobre-expressão do ERG e é observado em cerca de 50% de todos os tecidos de cancro da próstata [1], [3]. Dividimos todas as amostras de cancro da próstata dos estudos incluídos na meta-análise em três grupos, com base em seu nível de expressão ERG: amostras ERG superexpressão-positivas, amostras intermediárias ERG, e amostras superexpressão negativo ERG (Figura S2). Cada grupo consistiu em um terço de todas as amostras de um estudo. amostras ERG superexpressão-positivos foram assumidos como ERG rearranjo-positivas e atribuído à categoria ERG +, enquanto as amostras ERG superexpressão-negativos foram assumidos como ERG rearranjo-negativa e atribuída a categoria ERG-. Amostras atribuídos ao grupo intermediário ERG foram excluídos da análise para garantir uma comparação precisa de ERG + e amostras de câncer de próstata ERG-. A utilização da expressão do ERG como um substituto para o gene rearranjo-estatuto tenha sido descrito anteriormente [49] e foi verificado em nosso próprio estudo microarray como descrito abaixo. A meta-análise comparativa revelou 109-regulada e 58 genes regulados negativamente (fold-change 1,5; ajustado valor de p 0,1; 36 genes eram mais do que 2 vezes regulada) em ERG + em comparação com ERG- próstata cancro (Figura 2B, Quadro S1B). Diferencialmente genes regulados foram relacionados aos clusters funcionais de sinalização (péptidos extracelulares de sinalização e sinalização hormonal), a adesão (adesão celular e proteínas da matriz extracelular), e resposta de defesa (cicatrização de feridas e resposta inflamatória; Figura 2D).

A nossa meta-análise revelou alterações na expressão de genes em vários subgrupos, durante o desenvolvimento de cancro da próstata. Um número de estudos independentes compreendendo coortes de doentes foram incluídos na análise. Portanto, as alterações identificadas na expressão dos genes significam efeitos gerais independente populacionais relacionadas ao câncer de próstata.

Validação-análise Meta de Análise da expressão Independent

Em seguida, validados os resultados da nossa meta-análise. Estamos focados em uma comparação do ERG + e cancros da próstata ERG- porque esses subtipos foram descritos recentemente e não têm sido amplamente estudados até agora. Para a validação da meta-análise foram utilizados dados de um estudo expressão independente realizada em uma plataforma de expressão alternativa (Illumina). O estudo de validação difere dos estudos de meta-análise nos seguintes aspectos: a) coorte independente do paciente (n = 57) selecionados a partir do biobanco cancro da próstata Innsbruck; b) tecnologia de expressão do gene alternativo (estudo de validação, matrizes Illumina BeadChip, estudos de meta-análise, Affymetrix microarrays GeneChip); e c) ERG + e ERG- atribuição de grupo (Figura 3A). Na meta-análise, ERG + e tecidos ERG- foram atribuídos de acordo com os níveis de expressão do ERG. No estudo de validação do rearranjo-status ERG foi determinada por hibridização fluorescente in situ usando um ensaio de quebra-apart como descrito anteriormente [33] (Figura S3A).

84% de todos os genes encontrados a ser regulados diferencialmente em tecidos ERG + e ERG- (fold-change 2) foram verificadas por um estudo expressão independente. A) características do estudo. Os níveis de expressão B) ERG no tecido ERG rearranjo positivos e negativos do estudo de validação. rearranjos ERG foram determinados por hibridação in situ fluorescente. C) Os genes diferencialmente regulados no ERG + e tecidos ERG-. D) Validado genes regulados na meta-análise e estudo de validação. P-valor corrigido BH; p-valor combinado de Fisher, Benjamini-Hochberg corrigido.

Em primeiro lugar, confirmou que ERG rearranjo resultou em ERG sobre-expressão (Figura 3B, Figura S3A-C), indicando assim que o ERG + e ERG- grupos foram atribuídos corretamente na meta-análise, bem como o estudo de validação. Em seguida, analisamos a expressão dos 155 genes (12 genes foram excluídos devido a falta ou redundantes conjuntos de sondas) identificado como sendo regulados diferencialmente em tecidos ERG + e ERG- na meta-análise (FC 1,5; p 0,1). 49% (76/155) de todos os genes encontrados a ser regulados diferencialmente em ERG + e câncer de próstata ERG- na meta-análise foram verificados no estudo de validação. Quando a análise de validação foi confinado aos genes que foram regulados pelo menos duas vezes na meta-análise, estes ascendeu a 84% (27/32) (Figura 3C-D, Tabela S2). Quando analisamos o estudo expressão de validação como um estudo independente e investigados todos os genes nas matrizes, estes ainda foram de 20% e 41% para FC 1,5 e FC 2, respectivamente (Tabela S2). A concordância entre a meta-análise e estudo de validação independente mostrou que a nossa meta-análise gerado resultados robustos que eram independentes da coorte de exemplo, a atribuição de exemplo e tecnologia de expressão gênica empregada.

Análise de Proteínas Usando imunohistoquímica

O nosso estudo foi focado em níveis de expressão de mRNA até este momento. Em seguida investigamos se as proteínas codificadas pelos genes diferencialmente regulados são encontrados em diferentes quantidades em ERG + e tecidos de cancro da próstata ERG-. Nós selecionamos tecidos independentes (não utilizado para análise da expressão) do biobanco cancro da próstata Innsbruck, a fim de garantir ainda mais que a nossa investigação revelaria alterações relacionadas com o cancro da próstata + ERG gerais ao invés de diferenças específicas de cada paciente.

Para atribuir o tecidos para os grupos ERG + e ERG-, determinou-se os níveis de proteína ERG por imunohistoquímica usando um anticorpo previamente especificado para esta aplicação [50]. ERG imunohistoquímica permitida uma distinção clara entre ERG + e tecidos ERG-. De acordo com os dados publicados relativos tecidos ERG +, a intensidade da coloração da ERG variou de forte para fraco (Figura S4A) [50]. Alguns tecidos apareceu heterogêneo para ERG. Ambas as células cancerosas do ERG-ERG-positivos e negativos estavam presentes nestes tecidos (Figura S4B). controles de coloração foram realizados sobre a) células benignas da próstata, que são negativos para ERG (Figura S4C, a imagem à esquerda); b) células e linfócitos endoteliais, que mancha positiva para ERG [50] e que constituem um controle coloração interna (exemplo na figura S4C, imagem à direita); e c) linhas de células que representam ERG + (VCAP) ou câncer ERG- (DU145) de próstata (Figura S4D). De acordo com relatórios anteriores, aproximadamente metade (aqui 60%) de todos os tecidos da próstata investigados apareceu ERG positivo (resumo dos casos de câncer de próstata 93 na Figura S4E) [1], [3]. Para refletir a meta-análise, tecidos com alta de coloração ERG intermediária foram comparados com tecidos com coloração ERG negativo; tecidos com coloração ERG heterogêneo e baixa foram excluídos

Seis genes alvo foram submetidos à validação de proteína:.

GPR116

,

NPY

e

PLA2G7

, três genes sobre-expressos em ERG + tecidos e

AZGP1, HPGD

e

TFF3

, três genes regulados negativamente no ERG tecidos + câncer de próstata. Em quatro dos genes testados, os níveis de proteína refletiu a regulação dos mRNAs: NPY e PLA2G7 foram regulados positivamente em tecidos ERG + enquanto AZGP1 e TFF3 apareceu regulada para baixo (Figura 4). TFF3 foi relatado para ser regulados diferencialmente em tecidos ERG + [51]; Por conseguinte, apenas 11 amostras foram utilizadas para comparação. De acordo com os nossos dados, PLA2G7 foi recentemente relatado para ser relacionada com tumores ERG + [52]. Os níveis de proteína dos genes-alvo

GPR116

e

HPGD

não foram alterados na comparação de ERG + e câncer de próstata ERG- (dados não mostrados). Ainda não está claro se as discrepâncias observadas entre mRNA e os níveis de proteína destes dois genes refletem biológica (regulação diferente em mRNA e nível de proteína) ou (o desempenho do anticorpo) técnico variações.

A) slides consecutivos de tecidos da próstata de dois pacientes representativas. B) Quantificação de amostras de tecido obtidas a partir de 61 pacientes com cancro da próstata diferentes usando o software HistoQuest quantificação imuno-histoquímica. O HistoQuest não distinguir entre as células epiteliais e estromais. As diferenças na intensidade de coloração em células epiteliais ultrapassar as diferenças mostradas na caixa-blots. Bar, a 100 uM. Estatísticas, Mann Whitney U-teste; *, P 0,05; ** P 0,01; *** P . 0.001

Expression ERG-associado de NPY induz aumento do Glucose Captação em células cancerosas da próstata

Para ganhar novos insights sobre o papel do ERG-rearranjos no cancro da próstata , investigamos as funções de genes diferencialmente regulados em células de câncer de próstata ERG +. NPY foi selecionado para análise funcional. NPY é um neuropeptídeo com pequena foi descrita como um regulador central do equilíbrio de energia no corpo humano (revisto em [53]). Medimos a captação de glicose

in vitro

para determinar se NPY induz alterações metabólicas em células de câncer de próstata.

Nós confirmamos a superexpressão de NPY em + linhas de células do cancro da próstata ERG usando qPCR e immunoblotting. qPCR níveis de NPY de expressão mais elevado revelaram expressão do mRNA de NPY no linhas celulares ERG + DUCaP e VCaP em comparação com outras linhas de células de próstata (Figura 5A). NPY proteína foi detectada por imunotransferência unicamente em DUCaP e VCaP (Figura 5B). Quando se trataram células de cancro da próstata que não expressam o NPY endógena (DU145, LNCaP e PC3) com NPY recombinante (48 h, 25 nM), observou-se uma maior captação de glicose nas células tratadas com NPY do que nas células não tratadas (Figura 5C). Este efeito não foi observado em células que expressam o NPY endógena (VCaP, Figura 5C). Para investigar se os tecidos da próstata humanos são potencialmente NPY sensível, que, finalmente, em comparação a expressão do NPY e os receptores de NPY-responsivo NPY1R, NPY5R e NPY2R (NPY afinidade classificados, [54]) na próstata com os de outros órgãos humanos, usando o banco de dados Oncomine (https://www.oncomine.org) [24]. Encontrámos NPY seja mais abundante no tecido da próstata benigna e cancerosa em comparação com tecidos benignos e cancerosos derivados de outros órgãos, enquanto NPYRs foram expressos numa extensão semelhante na próstata e outros tecidos (estudos representativos são mostrados na figura S5). Assim, vários tecidos pode ser responsivo NPY. A próstata, no entanto, produz níveis significativos de NPY endógena. Tomados em conjunto os nossos dados demonstram que ERG-rearranjos de cancro da próstata estão associados com uma variedade de alterações de transcrição em células de cancro, incluindo a expressão de sensores metabólicos como NPY.

NPY foi medida por qPCR (A) e imunotransferência (B ) em linhas de células de próstata. expressão NPY foi maior no ERG + DuCAP e células cancerosas da próstata VCaP. C) estimulação do NPY (48 h, 25 nM) aumentou a captação de glicose em células de cancro da próstata que não expressam o NPY endógena (DU145, LNCaP, PC3). PC, linhas celulares de cancro da próstata; BP, linhas de células benignas da próstata; PS, linhas de células estromais da próstata.

Discussão

Este estudo foi realizado para determinar mudanças na expressão genética no câncer de próstata, que são devido a alterações gerais relacionados com a próstata e independente do paciente coortes, variações técnicas e da metodologia aplicada. Estamos focados em mudanças de transcrição no câncer de próstata ERG rearranjo-positivo (ERG +), porque estes tumores constituído um subgrupo menos caracterizado dos cancros da próstata. Esperávamos que os resultados desta investigação para produzir um banco de dados acessível ao público para alterações de expressão do gene no câncer de próstata e fornecer novos insights sobre a biologia dos cânceres de próstata ERG +. Observou-se, pela primeira vez, que rearranjos ERG está possivelmente associada com alterações metabólicas em células de cancro da próstata.

A nossa meta-análise consistiu de 561 tecidos derivados de oito estudos independentes.