Humana

Abstract

caixa de forkhead M1 (FoxM1) fator de transcrição oncogênico representa um atraente alvo terapêutico na luta contra o câncer, porque ele é abundante em um maioria dos tumores humanos. Recentemente, utilizando um sistema de ensaio à base de células foram identificados tiazole Siomycin antibiótico A, tal como um inibidor da actividade transcricional FoxM1. Aqui, nós relatamos que antibiótico tiazol estruturalmente semelhante, tiostreptona também inibe a atividade transcricional de FoxM1. Além disso, verificou-se que estes tiopéptidos não inibiu a actividade de transcrição de outros membros da família forkhead ou alguns factores de transcrição não-relacionadas. Experiências adicionais revelaram que tiazole antibióticos também inibir a expressão FoxM1, mas não a expressão de outros membros da família forkhead box. Além disso, verificou-se que os antibióticos de tiazole eficientemente inibiu o crescimento e potente induziu a apoptose em linhas celulares de cancro humano de origem diferente. apoptose correlacionado com a supressão da expressão FoxM1 tiopéptido-induzido, enquanto que a sobre-expressão de FoxM1 parcialmente protegido contra células cancerosas da morte celular mediada antibiótico-tiazole. Estes dados sugerem que Siomycin A e tiostreptona podem objetivar especificamente FoxM1 para induzir a apoptose em células cancerosas e inibidores FoxM1 /antibióticos de tiazole poderia ser potencialmente desenvolvidos como novos medicamentos anticancerígenos contra neoplasia humana

Citation:. Bhat UG, Halasi M, Gartel AL (2009) antibióticos tiazole alvo FoxM1 e induzir a apoptose em células cancerosas humanas. PLoS ONE 4 (5): e5592. doi: 10.1371 /journal.pone.0005592

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Março, 2009; Aceito: 14 de abril de 2009; Publicado em: 18 de maio de 2009

Direitos de autor: © 2009 Bhat et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede 1RO1CA1294414-01A1 e 1R21CA134615-01 e Ticket IDPH para a cura Research Grant para ALG. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

caixa de forkhead M1 (FoxM1) [1], um factor de transcrição da família forkhead [2] é um dos reguladores positivos chave do ciclo celular. Tanto a expressão e a actividade de transcrição de FoxM1 está associado com o estado proliferativo das células [1]. Ela é expressa em todos os tecidos embrionários e em células de origem epitelial e mesenquimal proliferando [3], [4]. FoxM1 desempenha um papel no desenvolvimento do sistema nervoso [5] e é necessário para a diferenciação hepatoblast para linhagens de células epiteliais biliares [6] e para o desenvolvimento embrionário da vasculatura pulmonar [7]. expressão FoxM1 também é induzida durante pulmão e fígado regeneração e reparação de tecidos. A actividade de transcrição de FoxM1 oncogénicas depende de vias Ras-MAPK e Sonic Hedgehog [8], [9]. FoxM1 regula positivamente a transcrição de genes alvo que participam na progressão do ciclo celular e é crítica para G1 /S e G2 transição /M, e também para a execução do programa mitótico porque as células FoxM1-empobrecido falhar a avançar para além da fase de profase da mitose [10] .

Enquanto FoxM1 é um dos genes mais sobre-expressos em tumores sólidos humanos (revisto em [11], [12]), a sua expressão é desligada nas células terminalmente diferenciadas, que não se dividem [1]. FoxM1 é sobre-expresso em carcinoma hepatocelular [13], carcinomas de pâncreas [14], os cancros da mama [15], [16], não-pequenas carcinomas de pulmão de células [17], astrocitoma anaplásico e glioblastomas [18], carcinomas basocelulares [9] e colangiocarcinoma intra-hepática [19]. Uma vez que a função de FoxM1 é inibida por vários supressores de tumor, tais como p19-IRA, pRb, p16 e p53 e activada por várias vias de sinalização oncogénicos, FoxM1 pode ser classificada como um proto-oncogene. A inibição da expressão FoxM1 por pequenos RNAs interferentes [20], [21] ou por um péptido contendo os aminoácidos 24-46 de p19

IRA [22], [23] reduziu o crescimento celular independente da ancoragem in vitro e retardada tumor hepático crescimento em ratinhos. Da mesma forma, a supressão de FoxM1 em células de cancro do pâncreas por interferência de ARN conduziu à inibição do seu potencial metastático [24]. Estes estudos demonstraram que FoxM1 é essencial para a viabilidade da célula cancerosa e a sua inibição pode impedir o desenvolvimento de cancro, sugerindo que a segmentação FoxM1 por moléculas pequenas podem representar uma nova estratégia para o desenvolvimento de novos fármacos anti-cancerígenos [25], [26], [27] , [28].

Anteriormente, utilizando um sistema de rastreio baseado em células desenvolvida pelo nosso laboratório, foi identificado um tiopéptido, Siomycin a (NSC-285116) como um potente inibidor da FoxM1 [25]. Além disso, mostrámos que Siomycin Um e outro antibiótico semelhante tiazole, tiostreptona, que já foi aprovado pela FDA para utilização em animais, inibir FoxM1 e induzir a apoptose em células de melanoma [26], [29]. Aqui, demonstramos que tiazole antibióticos, Siomycin A e tiostreptona inibir a actividade de transcrição e expressão FoxM1. Também descobrimos uma correlação directa entre a supressão da expressão FoxM1 e indução de apoptose por os tiopéptidos em diferentes linhas celulares de cancro humano. Além disso, foi estabelecido que FoxM1 pode proteger contra a morte celular induzida pelos antibióticos tiazole, sugerindo que estas drogas podem parcialmente exercem a sua actividade anticancerígena através da supressão de FoxM1.

Resultados

Recentemente, obtivemos evidência de que um outro antibiótico tiazole, tiostreptona, que estruturalmente diferente da Siomycin a por apenas dois dos resíduos (Fig. 1A) possui actividade anti-cancro [30] e propriedades anti-FOXM1 [29] similar ao Siomycin A. para avaliar os efeitos de tiostreptona sobre FoxM1 actividade de transcrição e também para estudar o modo como os antibióticos de tiazole afectar a actividade de transcrição de outros membros da família forkhead, desenvolveu-se a linha celular C3-Luc2.3-FOXO1. células C3-Luc2.3-FoxO1 são um derivado de células de osteossarcoma U2OS com uma proteína indutivel doxiciclina-FoxM1-GFP fusão [25], um FOXO1 constitutivamente activa tamoxifeno induzível (AAA) -er proteína de fusão e um FoxM1 /FOXO1-dependente luciferase de vaga-lume. Neste sistema, fomos capazes de induzir selectivamente a actividade de transcrição, quer FoxM1 pela adição de doxiciclina ou a actividade de transcrição FOXO1 pela adição de tamoxifeno. Em primeiro lugar, para testar o quão tiostreptona afecta a actividade de transcrição em comparação com FoxM1 Siomycin A, as células foram tratadas com uma combinação de doxiciclina e os antibióticos de tiazole e 16 horas mais tarde, a actividade da luciferase foi medida. Descobrimos que a repressão da actividade transcricional FoxM1 por tiostreptona é comparável à de Siomycin A (Fig. 1B), o que indica que ambos os antibióticos tiazole inibir a actividade de transcrição FoxM1. Em seguida, para determinar se os antibióticos tiazole inibir a actividade de transcrição de outros membros da família, tais como forkhead FOXO1 [31], que a linha de células tratadas C3-Luc2.3-FOXO1 com uma combinação de tamoxifeno e os tiopéptidos. Nós descobrimos que a adição de tamoxifeno levou à indução de actividade de luciferase dependente da FOXO1, mas o tratamento com os antibióticos de tiazole não reduzir este valor (Fig. 1B). Uma vez que todos os membros da família compartilham forkhead um domínio de ligação ao DNA conservado forkhead /alado-hélice, que é responsável pela ligação aos locais de consenso, nossos dados sugerem que os tiopéptidos não têm como alvo este domínio e eles podem regular negativamente única FoxM1, mas não outra membros da família forkhead

(a) a estrutura química do antibiótico tiazole, tiostreptona que difere de a por Siomycin apenas dois resíduos (tioestreptona-R1-R2:. Isoleucina-alanina; Siomycin- R1-R2: valina- desidroalanina). (B) Os ensaios de luciferase após o tratamento da linha de células C3-Luc2.3-FOXO1 com a combinação de ambos 1 ug /ml de doxiciclina (Doxy) ou 300 nM tamoxifeno (Tam) e 3 uM de Siomycin A (Sio) ou (tiostreptona Tio), respectivamente, revelou que tiostreptona também é um regulador negativo da actividade de transcrição e FoxM1 antibióticos tiazole inibir a actividade de transcrição FoxM1 entre os membros da família forkhead. antibióticos (C) tiazole regulada negativamente os níveis de proteína FOXM1, mas não os níveis FoxA1, FoxO1 e FOXO3a como detectado por imunotransf erência. (D) A linha de células HCT116-p53RE-Luc, que expressam estavelmente luciferase de pirilampo sob o controlo de vários elementos de resposta a p53 tratados com a concentração indicada de Siomycin A ou tiostreptona. Após o tratamento durante a noite a actividade da luciferase foi medida. linha de células de cancro (E) SW480 cólon foi transitoriamente transfectadas com o TOPFlash Tcf /Lef-dependente e pelo controle FOPFlash constrói. Vinte e quatro horas após a transfecção as células foram tratadas com 3 uM de Siomycin A ou tiostreptona. No dia seguinte, a actividade da luciferase foi medida. (F) as células cancerosas de pulmão A549 foram transfectadas transientemente com o dependente de GLI GLIBS-Luc, o controle miniTK construções repórter e o plasmídeo de expressão GLI. As células foram tratadas com a concentração indicada de os tiopéptidos de 24 horas após transfecção e a actividade da luciferase foi medida no dia seguinte. Bares em B, D-F são valores médios representativos dos ensaios em triplicado +/- SD.

Em nossos relatórios anteriores encontramos inesperadamente que Siomycin Um não apenas reprimidos atividade transcricional FoxM1, mas também reduziu o mRNA e os níveis de proteína de FoxM1 [25], [29]. Neste estudo, foi demonstrado que tiostreptona também regula negativamente os níveis de proteína FOXM1 para um grau semelhante ao Siomycin A (Fig. 1C). Além disso, verificou-se que os antibióticos de tiazole não diminuiu os níveis de proteína de outros membros da família forkhead como FoxA1, FoxO1 e FOXO3a (Fig. 1C), apoiando ainda mais a ideia de que tiazole antibiótico Siomycin A e tiostreptona são inibidores específicos da FoxM1. Para explorar ainda mais a especificidade potencial dos antibióticos para a transcrição FoxM1-dependente, testamos como Siomycin A e tiostreptona afetar a atividade transcricional de outros fatores de transcrição, tais como p53, Tcf /Lef e GLI. Para este fim, a linha de células HCT116-p53RE-Luc (com p53 de tipo selvagem e vários elementos de resposta a p53 a montante do gene da luciferase), linha celular de cancro SW480 de cólon (transientemente transfectadas com o TCF /Lef-dependente TOPFlash construção [32] ; uma oferta do Dr. Randall Lua) e pulmão A549 (células cancerosas transfectadas transitoriamente com as dependente de GLI GLIBS-Luc construção repórter e o plasmídeo de expressão de GLI; presentes do Dr. David Robbins) foram tratados com Siomycin a ou tiostreptona e a luciferase a actividade foi medida 16 horas após o tratamento. Nós descobrimos que o tratamento com os antibióticos não reduziu p53, Tcf /Lef ou GLI- transcrição dependente (Fig. 1D-F). No entanto, as nossas experiências adicionais mostraram que os antibióticos de tiazole também afectar a actividade de NF-kB, mas não a actividade de outros factores de transcrição estudados (dados não mostrados).

Para avaliar o potencial anti-cancro dos antibióticos de tiazole foram analisados ​​seus efeitos sobre linhas celulares de cancro humano de origem diferente que tinham nível de expressão elevado de FoxM1. Em primeiro lugar, investigou-se o circuito apoptótico extrínsecos ou intrínsecos está envolvida na apoptose induzida por tiopéptido. Nós tratado caspase-8 linhas de células de neuroblastoma NB7 deficientes e reconstituídos com os antibióticos durante 24 horas (Fig. 2A). Descobrimos que a caspase-8 NB7 células deficientes que não podem sofrer apoptose extrínseca eram quase tão sensíveis aos tiopéptidos como células NB7 reconstituído com a caspase-8 activa, sugerindo que a apoptose induzida por tiopéptido envolve, principalmente, a via apoptótica intrínseca.

(a) Tratamento de caspase-8 linhas de células de neuroblastoma NB7 deficientes e reconstituídos com os antibióticos de tiazole revelou que tiopéptido induzida apoptose envolve, principalmente, a via apoptótica intrínseca. (B) linhas celulares do cancro da leucemia CEM [IC

50 /? M: Sio-0,73 (0,08); Tio-1,47 (0,1)], HL60 [IC

50 /iM: Sio-0,68 (0,06); Tio-1,78 (0,4)], e U937 [IC

50 /iM: Sio-0,53 (0,1); Tio-0,73 (0,3)], e de linhas celulares de cancro do fígado Hep-3B [IC

50 /iM: Sio-3,6 (1,3); Tio-2,3 (0,8)], Huh7 [IC

50 /iM: Sio-2,3 (0,5); Tio-1,8 (0,2)], e SK-Hep [IC

50 /iM: Sio-3,7 (0,4); Tio-6,0 (1,4)], mostrou sensibilidade na gama micromolar baixa para os antibióticos de tiazole como determinado por ensaios de inibição de crescimento. (C-D) Siomycin A e tiostreptona inibir a expressão FoxM1 e induzir potente apoptose em células de leucemia e câncer de fígado.

Para avaliar quantitativamente o grau de sensibilidade dos diferentes linhas celulares de cancro humano aos antibióticos de tiazole Siomycin A e tiostreptona foram realizados ensaios de inibição de crescimento em vários leukemia (CEM, HL60, U937) e fígado células cancerosas (Hep-3B, Huh7, SK-Hep). Estas linhas celulares de cancro foram tratadas com diferentes concentrações dos antibióticos durante 48 horas e o grau de inibição do crescimento foi determinada pela contagem do número de células vivas (Fig. 2B). Todas as linhas de células exibido IC

50s na gama micromolar baixa, o que sugere que estas células de cancro humano são bastante sensíveis às tiopéptidos. Além disso, avaliou-se a resposta apoptótica a Siomycin A e tiostreptona nestas células cancerosas humanas por imunotransferência para a caspase-3 clivada. Descobrimos que tanto Siomycin A e tiostreptona reprimir a expressão da proteína FoxM1, e induzir a apoptose nestas células de leucemia e cancro do fígado (Fig. 2C e D). Estes dados suportam ainda mais a nossa conclusão de que tiazole antibióticos não só antagonizam a capacidade de transactivação FoxM1, mas também inibir a sua expressão por causa do ciclo de feedback positivo FoxM1 [33]. Além disso, observou-se correlação direta entre a supressão FoxM1 e caspase-3 de clivagem (marca da apoptose) após o tratamento com estes compostos. A estreita ligação entre FoxM1 repressão e indução de apoptose sugere que os tiopéptidos pode exercer a sua actividade pró-apoptótica pelo menos parcialmente, através da inibição da FoxM1 em células cancerosas humanas.

Para investigar o papel potencial da FoxM1 na tiopéptido mediada apoptose, nós tratamos U2OS células de osteosarcoma com 10 uM de Siomycin a e colhidas as células em diferentes pontos de tempo (Fig. 3A). Encontrámos considerável diminuição na expressão da proteína FoxM1 tão cedo quanto 18 h, que foi correlacionada com o aparecimento de sólidos caspase-3 clivada bandas. Também se observou correlação entre forte regulação negativa de FoxM1 e apoptose mais intensa após tratamento de 24 h com tiostreptona na presença do ciclohexamida bem conhecido inibidor de translação (Chx) em comparação com o tratamento individual com as drogas, novamente indicando que a supressão de FoxM1 pode ser necessária para a apoptose induzida por tiopeptídeo (Fig. 3B). Para explorar melhor o papel da FoxM1 na apoptose mediada por tiopéptido utilizou a linha celular C3 [25]. FoxM1 expressão foi induzida com a adição de doxiciclina e no dia seguinte as células foram tratadas com ciclo-hexamida tiostreptona e durante 24 horas (FIG. 3C). Observou-se que a expressão de FoxM1 endógenos diminuiu de um modo dependente do tempo após o tratamento, enquanto que os níveis de FoxM1 exógenas não foram afectados (Fig. 3C). Nós também descobrimos que a sobre-expressão de FoxM1 protegidos contra a morte celular induzida por tiostreptona como detectado por imunotransf erência para caspase-3 (Fig. 3C). Estes dados apoiam a ideia de que a regulação negativa da FoxM1 pode contribuir para a apoptose induzida por tiopéptido. Do mesmo modo, verificou-se que as células que sobre-expressam C3 FoxM1 eram resistentes ao tratamento com Siomycin Um tal como analisado por imunotransf erência para caspase-3 (Fig. 3D). As experiências adicionais revelaram que a sobreexpressão de FoxM1 também protege contra a apoptose induzida por uma Siomycin na presença de ciclo-hexamida (Fig. 3E). Tomados em conjunto, todos estes dados sugerem que a regulação negativa da FoxM1 por Siomycin A e tiostreptona pode ser necessária para a apoptose induzida por tiopéptido.

(A) Análise de imunotransferência após o tratamento com Siomycin Um revelou uma correlação estreita entre a regulação negativa de FoxM1 e indução de apoptose. (B) após tratamento com tioestreptona, a apoptose induzida por tiopéptido e a inibição da expressão da proteína FoxM1 são mais proeminentes na presença de ciclo-hexamida (Chx) como descrito por imunotransf erência para FoxM1 e caspase-3 clivada. (C) A expressão da FoxM1 endógenos diminuiu de uma forma dependente do tempo, na presença de tiostreptona e Chx, enquanto os níveis de FoxM1 exógenas não foram afectados. A sobre-expressão de FoxM1 protegidos contra a morte celular induzida por tiostreptona como detectado por imunotransf erência para a caspase-3 clivada. células que sobre-expressam (D) FOXM1 eram resistentes ao tratamento com o aumento da quantidade de Siomycin Um tal como analisado por imunotransf erência para a caspase-3 clivada. (E) a análise Immunoblot revelou que a superexpressão de FoxM1 também protegidos contra a apoptose induzida por A Siomycin na presença de Chx.

Discussão

Anteriormente, relatou que tiazole antibióticos Siomycin A [ ,,,0],25] e tiostreptona [29] inibir FoxM1 e induzir a apoptose em células cancerosas humanas. Neste estudo, foi demonstrado que os antibióticos de tiazole inibir a actividade de transcrição FoxM1, eles também regular negativamente a expressão FoxM1 e induzir a morte celular em células de neuroblastoma, leucemia e cancro do fígado. Sabe-se que os antibióticos de tiazole exercem a sua actividade antibacteriana, inibindo a tradução bacteriana através da interacção com o ARN ribossómico 23S, mas eles não bloqueiam a síntese de proteínas eucarióticas [34]. O mecanismo exacto da inibição da actividade de transcrição FoxM1 permanece por elucidar, mas não está relacionada com a sua capacidade para inibir a síntese de proteínas. Curiosamente, também descobrimos que tiazole antibióticos não só suprimem a actividade de transcrição, mas também a expressão de FoxM1 (Fig. 1, 2), o que sugere que pode regular positivamente FoxM1 sua própria transcrição [33].

Aqui, verificou-se que a apoptose induzida tiazole-antibiótico em células de cancro de origem diferente foi correlacionada com a regulação negativa da FoxM1 (Fig. 2, 3). Os tiopéptidos inibiu o crescimento celular com IC semelhante

50 e morte celular induzida com concentrações comparáveis ​​em tais tipos de células diferentes como neuroblastoma, leucemia e de hepatoma (Fig. 2). Uma vez que já relataram que Siomycin A e alvo tiostreptona FoxM1, inibir o crescimento celular e induzir a apoptose em células de melanoma [29], estes dados confirmam ainda que tiazole antibióticos podem afectar uma grande variedade de células cancerosas humanas. Além disso, mostramos que a sobre-expressão de FoxM1 poderiam proteger as células cancerosas contra a apoptose mediada por tiopeptídeo (Fig. 3C, D, E). Uma vez que os antibióticos de tiazole suprimir a expressão e a actividade de FoxM1 e, ao mesmo tempo FoxM1 superexpressão protege as células cancerosas de Siomycin A e toxicidade tiostreptona, FoxM1 pode ser um alvo válido de tiazole apoptose induzida por antibiótico. Recentemente, Kwok et. ai. mostrou que reprime a expressão de tiostreptona FoxM1 e induz a apoptose em células de cancro da mama [35]. Estes dados suportam ainda mais nossos resultados atuais e os resultados de nossas publicações anteriores que tiazol antibióticos, Siomycin A [25], e tiostreptona [29] induzir a apoptose e suprimir a expressão FoxM1 em células cancerosas humanas. No entanto, este grupo não ligar supressão da expressão FoxM1 à inibição da sua actividade de transcrição por tiostreptona [35]. Além disso, eles afirmam que só constitutivamente ativo, mas não de tipo selvagem FoxM1, pode inibir a atividade antiproliferativa tiostreptona [35]. São necessários mais estudos para resolver essas diferenças.

Em resumo, demonstramos que tiazole antibióticos Siomycin A e tiostreptona são potentes inibidores da atividade transcricional FoxM1 e expressão. Além disso, eles induzem a morte celular programada em células de cancro humano de origem diversa. O grau de apoptose induzida por os tiopéptidos correlaciona-se com a supressão de FoxM1, enquanto que a sobre-expressão de tipo selvagem FoxM1 parcialmente protegido a partir de células cancerosas tiopéptido induzida por apoptose. Estes dados sugerem que a inibição da FoxM1 por Siomycin A e tiostreptona em certa medida, é responsável pela morte celular induzida por antibióticos de tiazole. As experiências descritas neste suporte manuscrito nossos relatórios anteriores [25], [26], [27], [29] que FoxM1 é um alvo apropriado para fármacos anti-cancerígenos e que tiazole antibióticos podem representar alternativas promissoras para usado atualmente tratamentos anticancerígenos.

Materiais e Métodos

As linhas celulares, mídia e compostos químicos

U2OS células de osteossarcoma; C3 células [22], uma linha de células U2OS C3 clone com a proteína de fusão GFP-FoxM1 doxiciclina induzível; U2OS do osteossarcoma derivado C3-Luc2.3-FOXO1, expressando estavelmente a doxiciclina induzível FoxM1-GFP [25], o FOXO1 (AAA) -er proteína de fusão tamoxifeno induzível e luciferase de pirilampo sob o controlo de vários elementos responsivos FoxM1 /FoxO1; HCT116-p53RE-Luc cólon, que expressam estavelmente luciferase de pirilampo sob o controlo de um promotor com vários elementos de resposta a p53 (p53RE); linhas celulares de cancro do fígado e do pulmão A549 Huh7, Hep3B e SK-Hep foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen). SW480 cólon, caspase-8 deficiente e neuroblastoma NB7 reconstituído (generosas doações de Dr. Jill M. Lahti, Research Hospital St. Jude Children, Memphis), CEM, HL60 e linhas celulares de cancro da leucemia U937 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) . Em todos os casos, os meios foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals) e 1% de penicilina-estreptomicina (GIBCO) e as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2. Tiazole antibióticos Siomycin A (ICN) e tiostreptona (Sigma) foram dissolvidos em DMSO (dimetilsulfóxido), o tamoxifeno (Sigma) em etanol, a doxiciclina (Clontech) em PBS e ciclo-hexamida (Sigma) em DMSO.

Construções e transfecções

o Super8xTOPFlash eo controle Super8xFOPFlash plasmídeos repórter estavam presentes generosos de Dr. Randall T Moon (Universidade de Washington, Seattle, WA). O plasmídeo de expressão SRαGLI1 eo GLI-BS-Luc, miniTK construções repórter estavam presentes amáveis ​​do Dr. David J. Robbins (Dartmouth Medical School, Hanover, NH). As transfecções transientes foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

A análise de imunotransferência

células do cancro de origem diferente tratadas como indicado foram colhidas e lisadas usando tampão IP ( 20 mM de HEPES, 1% de Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 100 mM, Na4P2O7 10 mM, othrovanadate de sódio 1 mM, 0,2 mM de PMSF suplementado com comprimido inibidor de protease (Roche Applied Sciences)) . A concentração de proteína foi determinada pelo reagente de Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad). proteínas isoladas foram separados em 8% ou 10% SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF (Millipore). Immunoblotting foi realizado conforme descrito em 34, 35 com anticorpos específicos para FoxM1 (um presente do laboratório do Dr. Costa), FoxA1 (um presente do laboratório do Dr. Costa), FoxO1 (Cell Signaling), FOXO3a (Upstate), caspase clivada 3 (de sinalização celular) e β-actina (Sigma).

os ensaios de luciferase

células C3-Luc2.3-FoxO1 foram cultivadas em placas de 6 poços e tratadas durante a noite com a combinação de ambos 1 ug /mL de doxiciclina ou 300 nM de tamoxifeno e 3 uM de Siomycin A ou tiostreptona. Além disso, a linha de células HCT116-p53RE-Luc foi cultivado em placas de 6 poços e tratadas com 3 uM de Siomycin A ou tiostreptona durante 16 horas. Além disso, a linha de células de cancro do cólon SW480 crescidas em placas de 6 poços foi transientemente transfectadas com o TOPFlash e o FOPFlash constrói. Vinte e quatro horas após a transfecção as células foram tratadas com 3 uM de Siomycin A ou tiostreptona. No dia seguinte, a actividade da luciferase do pirilampo foi medida utilizando o Sistema de Ensaio de Luciferase (Promega). A concentração de proteína medida por o reagente de Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad) foi utilizado para normalização. células de cancro do pulmão A549 cultivadas em placas de 6 poços foram transientemente co-transfectadas quer com o dependente GLI-os de controlo miniTK construções repórter GLIBS-Luc ou, o plasmídeo de expressão GLI e pRL-null (Promega) que expressa luciferase de Renilla. As células foram tratadas com 3 uM de Siomycin A ou tiostreptona 24 horas após a transfecção e a actividade da luciferase foi medida com o Reporter Assay Sistema Dual-Luciferase (Promega) de acordo com as instruções do fabricante no dia seguinte.

Reconhecimento

Este manuscrito é dedicado à memória do Dr. Robert H. Costa. Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Randall Moon (Universidade de Washington, Seattle) para o TOPFlash e os plasmídeos FOPFlash, Dr. David Robbins (Dartmouth Medical School, Hanover) para fornecer as efetoras e repórter plasmídeos GLI. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Jill M. Lahti (Research Hospital St. Jude Children, Memphis) para as linhas de células caspase-8 deficientes e reconstituídos NB7 neuroblastoma. Agradecemos ao Dr. Angela Tyner (Universidade de Illinois em Chicago, Chicago) e Dr. Senthil Radhakrishnan (Caltech, Pasadena) para a leitura do manuscrito e por seus valiosos comentários. Agradecemos também a Dr. Nissim Hay (Universidade de Illinois em Chicago, Chicago) para fornecer os anticorpos FoxO1 e FOXO3a, e por suas sugestões úteis.