Abstract

Aciculatin, um composto natural extraído da erva medicinal

Chrysopogon aciculatus

, mostra a potência anti-câncer potente. Este estudo é o primeiro a demonstrar que aciculatin induz a morte celular em células de cancro humanas e xenoenxertos de ratinho HCT116 devido a paragem em G1 e apoptose subsequente. A principal razão para a paragem do ciclo celular e morte celular foi acumulação de p53, seguido por um aumento do nível de p21, a desfosforilação da proteína Rb, expressão PUMA, e indução de sinais apoptóticos tais como clivagem de caspase-9, caspase-3 e PARP. Foi demonstrado que a p53 alelo nulo (- /-) (p53 KO) células HCT116 foram mais resistentes à aciculatin de células com p53 de tipo selvagem (+ /+). O mesmo resultado foi obtido com a derrocada das p53 com ARNsi em células p53 de tipo selvagem, indicando que a p53 desempenha um papel crucial na apoptose induzida por aciculatin. Embora o dano ao DNA é o evento mais comum que leva à ativação p53, encontramos apenas uma fraca evidência de dano ao DNA após o tratamento aciculatin. Curiosamente, a regulação negativa induzida pelo aciculatin de MDM2, uma importante regulador negativo do p53, contribuiu para a acumulação de p53. A actividade anti-cancro e a importância de p53 após o tratamento aciculatin também foram confirmados em modelos de xenoenxerto de HCT116. Colectivamente, estes resultados indicam que aciculatin tratamento induz a paragem do ciclo celular e a apoptose através da inibição de expressão de MDM2, induzindo, assim, a acumulação de p53 sem danos no ADN e toxicidade significativa genoma

citação:. Lai CY, Tsai AC, Chen MC, Chang LH, Sun HL, Chang YL, et al. (2012) Aciculatin Induz p53-dependente apoptose via MDM2 Esgotamento em células cancerosas humanas

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 7 (8): e42192. doi: 10.1371 /journal.pone.0042192

editor: Marie-Josée Boucher, da Universidade de Sherbrooke, Canadá |

Recebido: 26 Janeiro, 2012; Aceito: 04 de julho de 2012; Publicado: 13 Agosto 2012 |

Direitos de autor: © Lai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência da República da China (NSC 99-2628-B-002-024-MY3 e NSC 99-2320-B-400-008-MY3) (https://web1.nsc.gov. tw /). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

descoberta e desenvolvimento de drogas anti-câncer é um desafio sem fim para bioquímicos e farmacologistas em todo o mundo. Os produtos naturais são abundantes fontes de novas estruturas e citotóxicos que têm o potencial de ser compostos de chumbo promissores para fármacos antineoplásicos.

Aciculatin é um composto natural isolado a partir da erva medicinal,

Chrysopogon aciculatus

, que é amplamente utilizado para o tratamento de edemas, resfriado comum, febre e diarreia. Aciculatin foi relatada pela primeira vez em 1991, mostrando atividade e citotoxicidade de ligação de DNA

in vitro

[1], [2]. Um estudo recente demonstrou que aciculatin exerce efeitos inibidores duais em induzível da sintase do óxido nítrico (iNOS) e da ciclo-oxigenase-2 (COX-2), devido à regulação da NF-kappaB e c-Jun quinase N-terminal (JNK) /vias p38 [ ,,,0],3]. No entanto, o mecanismo exato pelo qual a aciculatin exerce o seu efeito inibidor do tumor permanece obscura.

supressor de tumor p53 desempenha um papel crucial na resposta a tensões despertando celulares, tais como a hipóxia, danos no ADN, e a activação do oncogene. Em circunstâncias normais, o p53 é rapidamente degradada pela E3 ubiquitina-ligase double minutos murino 2 (MDM2); a meia-vida de p53 é assim curto e o seu nível de proteína é difícil de detectar [4]. Uma vez que as células são expostas às tensões acima mencionadas, a degradação de p53 é desligado. p53 acumulados forma então tetrâmeros e liga-se a domínios de ADN específicas, que conduz a transcrição de genes de regulação. Os efeitos mais comuns são a reparação do ADN, interrupção do ciclo celular, a senescência, e apoptose. As respostas celulares a jusante de p53 podem suprimir o crescimento não controlado e, se necessário, para eliminar as células danificadas [5]. Esta estratégia tem sido utilizada em terapias de cancro actuais para induzir a apoptose dependente de p53, utilizando, por exemplo, agentes de danos no DNA. No entanto, os efeitos secundários deste tratamento são graves devido a genotoxicidade. Além disso, apesar de quase 50% dos cancros humanos tem p53 de tipo selvagem, alguns sobre-regulada função de p53 vias de bloco tal como p14ARF deficiência de amplificação de MDM2 e [6]. Portanto, os agentes que podem induzir ou restaurar a função do p53 do tipo selvagem e corrigir o percurso anormal com efeitos colaterais menores são candidatos ideais para drogas anti-câncer inovadoras [7], [8].

MDM2 oncoproteína é uma E3 ligase de ubiquitina que controla o nível de p53 em células. MDM2 é um regulador negativo mediar a degradação ubiquitina de p53; MDM2 também inibe a actividade transcricional de p53 e facilita a sua exportação nuclear [9]. A sobre-expressão de MDM2 que prejudica a função de p53 tem sido encontrada em muitos tumores humanos. Além disso, MDM2 interage com diversas proteínas supressoras de tumor, incluindo Rb, p21, p19 /14

ARF, E2F1, p73 e MTBP [10], [11], [12], [13], [14].

neste estudo, buscou-se identificar o mecanismo anti-tumoral de aciculatin com

in vitro

e

in vivo

experimentos usando células de câncer colorretal humano HCT116. Os resultados fornecem evidências da importância do p53 e os seus alvos a jusante na parada do ciclo celular induzida por aciculatin e apoptose dependente da caspase. Os efeitos sobre a redução de aciculatin MDM2 e p53 acumulação relacionado também são descritos. Os mesmos resultados foram também confirmados utilizando A549, uma linha de p53 do tipo selvagem não-pequenas do pulmão de células de células de cancro. Colectivamente, estes resultados sugerem que aciculatin é um produto natural promissor para a terapia antineoplásica.

Materiais e Métodos

Materiais

Aciculatin foi extraída e purificada a partir

Chrysopogon aciculatus

pelo professor CC Chen, Departamento de Biotecnologia da Universidade Hungkuang, Taiwan, com uma pureza superior a 98%. Meio RPMI 1640, soro fetal de bovino (FBS), penicilina, estreptomicina, e todos os outros reagentes de cultura de tecidos foram obtidos a partir de Life Technologies (Grand Island, NY, EUA). kit de detecção de quimioluminescência aumentada foi de Amersham. Trizol reagente foi a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA); iniciador aleatório e M-MLV RT foram adquiridos a Promega (Madison, WI EUA.); pró-Taq era de Protech (Taipei, Taiwan). HRP reagente conjugado de polímero foi de SuperPictureTM Zymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA, EUA).; anticorpo Nuceolin, iodeto de propídio (PI), 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio, sulforrodamina B, e todos os outros reagentes químicos foram obtidos de Sigma Chemical (St. Louis, MO, EUA)

cultura celular

A linha de células de cancro colo-rectal humano HCT116 e pulmão de células linhagem celular de câncer A549 não pequenas humano foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC;. Manassas, VA , EUA). p53-KO (p53 nocaute) células HCT116 foram gentilmente cedidas pelo Dr. B. Vogelstein (Johns Hopkins). Ambos foram cultivadas em RPMI 1640 com 10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (v /v) e penicilina (100 unidades /mL) /estreptomicina (100 ug /mL). As células foram mantidas numa incubadora humidificada a 37 ° C em 5% de CO

2/95% de ar.

Ensaio MTT

As células foram incubadas com veículo (0,1% DMSO) ou compostos durante 48 h. Lavadas uma vez e incubadas com 0,5 mg /ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio a 37 ° C durante 1 h. Após a incubação, as células foram lisadas com DMSO e a absorvância foi obtido utilizando um leitor de ELISA (550 nm). Os resultados foram calculados como: viabilidade celular (%) = D. O. média de poços /média O.D. dos poços de controlo.

citometria de fluxo FACScan

Após o tratamento de veículo (0,1% DMSO) ou compostos para os cursos de tempo indicados, as células foram recolhidas por tripsinização, para análise do ciclo celular, as células eram fixadas com 70% (v /v) de álcool a 4 ° C durante a noite. Após centrifugação, as células foram incubadas em 0,1 mol /L de tampão de ácido cítrico fosfato-[0,2 mol /l NaHPO

4, 0,1 mol L /ácido cítrico (pH 7,8)] durante 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram centrifugadas e ressuspensas com 0,5 ml de solução PI contendo Triton X-100 (0,1%, v /v), ARNase (100 ug /mL), e PI (80 ug /mL). teor de ADN foi analisada com o software CellQuest e FACScan (Becton Dickinson). Para anexina V-FITC e PI dupla coloração, a Anexina V FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences; San Jose, CA, EUA) foi realizada. As células foram centrifugadas e incubadas com estes reagentes imediatamente. Após incubação durante 15 min, as células marcadas por fluorescência foram então analisadas com o software de FACScan e CellQuest.

TUNEL

Células semeadas em câmaras de corrediça 8 poços foram deixados em jejum durante a noite e tratadas com veículo (0,1 % de DMSO) ou aciculatin durante 24 h. As células e as fatias de tecido de tumor foram fixadas em paraformaldeído a 4% e lavadas duas vezes com PBS. Foram identificadas as células em apoptose

in situ

usando o terminal desoxinucleotidil transferase para transferir triphosphatase biotina-desoxiuridina (TUNEL, Roch Diagnostics, Mannheim, Alemanha) para a livre 3′-OH de DNA clivada. Os locais de clivagem foram marcadas por biotina e visualizado por meio de reacção com avidina conjugada com fluoresceína (avidina-isotiocianato de fluoresceína). Microfotografias foram obtidas pela Leica TCS SP2 microscópio confocal espectral.

análise de Western blot

Western blot para ligado celular total e extração nuclear foram realizados conforme relatado anteriormente [15], [16] com o anti- p53, anti-pRB e anti-caspase-8 (BD Biosciences; San Jose, CA, EUA); anti-α-tubulina, anti-actina, anti-p21, anti-p27, anti-poli (ribose de ADP) polimerase, H2AX anti-fosforilado (Ser139), anti-MDM2, anti-PUMA, conjugado com HRP anti-murganho , e anti-IgG de coelho (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA, EUA); anti-caspase-3 (Imgenex; San Diego, CA, EUA); anti-caspase-9 e fosfo-ser15-p53 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA)

extração de RNA e reverter reação em cadeia de polimerase (RT-PCR)

total. o ARN foi extraído com o reagente de Trizol por o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A transcrição reversa foi realizada com 5 ug de mRNA e iniciadores aleatórios a 65 ° C durante 5 min, em seguida, misturado com Moloney vírus da leucemia murina de transcriptase reversa (RT) para reagir a 37 ° C durante 1 h para se obter ADNc. A amplificação do gene foi seguido com a reacção em cadeia com RT-polimerase (PCR). As sequências dos iniciadores utilizados para a amplificação foram como se segue: GAPDH, 5′-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3 ‘/5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3′; p53, 5’-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3 ‘/5′-CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC-3′; MDM2, 5’-GGGAGATATGTTGTGAAAGAAGC3 ‘- /5’-CCCTGCCTGATACACAGTAACTT. parâmetros de amplificação padrão foram usados ​​com os seguintes processos: para p53, 94 ° C durante 3 min, 35 ciclos com desnaturação a 94 ° C durante 30 s, emparelhamento a 60 ° C durante 45 s e extensão a 72 ° C durante 1 min , finalmente, a 72 ° C durante 10 min. Para GAPDH e MDM2, 95 ° C durante 10 min; 35 ciclos (MDM2: 40 ciclos) com desnaturação a 95 ° C durante 15 s, emparelhamento a 60 ° C durante 5 s e extensão a 72 ° C durante 12 s; seguido por uma extensão final a 75 ° C durante 15 s. Os produtos de PCR foram analisados ​​em gel de agarose a 1,5% na presença de 1 ug /ml de brometo de etídio.

transfecção transiente

células HCT116 foram semeadas em placas de 3,5 cm dia para o outro, e, em seguida, transfectadas com TP53 siRNA ou plasmídeo MDM2 utilizando Lipofectamine 2000 de acordo com o protocolo do fabricante. TP53 siRNA e Lipofectamine 2000 são de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) e o plasmídeo de MDM2 (N ° 16233) é de Addgene (Cambridge, MA, EUA). Depois de 6 h a transfecção e re-soro, as células foram deixados em jejum e, em seguida, tratados com veículo (0,1% DMSO) ou aciculatin durante os tempos indicados. Os lisados ​​celulares foram recolhidos para análise de Western blot.

análise imuno-histoquímica

As fatias de tecido (FFPE) tumorais embebidos em parafina fixadas em formalina foram desparafinados em xilol e reidratados em uma série graduada de etanol. Submergir fatias de tecido com água oxigenada a 3% para extinguir a actividade da peroxidase endógena. Para desmascarar antigénio, fatias de tecido foram aquecidos em 95 ° C, tampão de Tris-EDTA (10 mM Tris Base, EDTA mM Solução 1, 0,05% de Tween 20, pH 9,0) durante 30 min. As fatias foram bloqueadas com leite magro a 4% durante 40 minutos e incubadas com o anticorpo indicado durante 1 hora à temperatura ambiente. HRP conjugado de polímero reagente A (SuperPictureTM) foram aplicados às fatias e reagente B para peroxidase subsequentemente catalisação que visualiza a localização do antigénio. solução de hematoxilina de Mayer foi para contracoloração. Os resultados foram capturados por Zeiss Axioskop-2 microscópio.

modelos de xenotransplante tumoral

s.c. Masculino imunodeficientes combinada severa (SCID) ratos foram implantados com células tumorais HCT116. Quando os tumores atingiram o volume médio de 90 mm

3, os ratos foram divididos em dois grupos (

N

= 5) e o agente de tratamento foi iniciado. Veículo (Cremophor EL /etanol, 01:01; 0,2 mL /ratinho) ou aciculatin (30 mg /kg) foram administrados por via intraperitoneal (i.p.) por cinco vezes por semana. O comprimento (

L

) e largura (

W

) do tumor foram medidos a cada 3 a 4 dias, e o volume do tumor foi calculado como

LW

2/2. Os protocolos da

in vivo

estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal na Universidade Nacional de Taiwan.

A análise estatística

Os dados foram expressos como média ± SEM do número indicado por experiências separadas. A análise estatística dos dados foi realizada com o one-way ANOVA seguido pelo

t

teste, e

p

. 0,05 foram considerados significativos

Resultados

Aciculatin induz a paragem do G0 /G1 e subsequente morte celular por apoptose em células cancerosas humanas

Aciculatin é um romance de flavonóides C-glicosídeo derivado de

C. aciculatus

extracto (Figura 1A) .A ligação carbono-carbono apertado faz um C-glicosídeo mais estável do que um O-glicosídeo no ambiente ácido ou a presença de glicosidases

in vitro

e

In vivo

. Utilizou-se um ensaio de sulforrodamina B (SRB) para demonstrar que aciculatin causou inibição do crescimento, não só na linha celular de cancro colorrectal humano HCT-116 (GI

50 = 2,81 ^ M), mas também em outras linhas de células de cancro (Tabela S1). A citotoxicidade de células HCT116 na aciculatin foi determinada por mitocondrial 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio ensaio (MTT) redução brometo com um IC

50 de 5,88 jiM (Figura 1B) . Para determinar a distribuição do ciclo celular, as células foram tratadas com sincronizados aciculatin e analisadas com citometria de fluxo FACScan e coloração com iodeto de propídio (PI). Os resultados mostraram que aciculatin pode induzir G0 /paragem em G1 e subsequente acumulação de células em fase sub-G1 de um modo dependente do tempo. O aumento das proporções G1 após o tratamento nos pontos de tempo indicados, são mostrados no gráfico da curva (Figura 1C). A seguir, investigou a indução de apoptose por aciculatin utilizando o ensaio TUNEL. A Figura 1D mostra que a fragmentação do ADN aumentada após 24 h de 7,5 uM aciculatin tratamento. As percentagens de células positivas TUNEL neste ensaio foram calculados e os dados de quantificação foi mostrado. Estes dados indicam que aciculatin pode induzir significativamente a apoptose em células HCT116

A, Estrutura de aciculatin:. 8- (2,6-dideoxy-

β Restaurant –

ribo viajantes – hexopiranosil) -5-hidroxi-2- (4-hidroxifenil) -7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona sesquihidrato. B, células HCT116 foram incubadas com as concentrações indicadas de aciculatin (5-10 uM) durante 48 h. A viabilidade das células foi então determinada por ensaio MTT. C, as células HCT116 foram deixados em jejum durante a noite, e, em seguida, incubadas com veículo (0,1% DMSO) ou aciculatin (10 uM) durante o período indicado. O teor de ADN foi subsequentemente analisada através de coloração de PI utilizando um ensaio de citometria de fluxo FACScan. O gráfico mostra que a curva aciculatin aumento da população de células G1 de um modo dependente do tempo. Os valores médios ± DP de 3 experiências independentes. *

P Art 0,05 e ***

P Art 0,001, em comparação com células não tratadas. D, as células HCT116 foram tratados com veículo (0,1% DMSO) ou aciculatin (7,5 mM) e, em seguida coradas com TUNEL e DAPI. O aumento da fluorescência verde indicaram que as células sofreram apoptose após o tratamento aciculatin (TUNEL, painel da direita). Os núcleos foram coradas com DAPI (painel da esquerda). O gráfico de barras mostra a proporção de células positivas TUNEL em cada tratamento normalizado para DAPI. ***

P

. 0,001

Aciculatin induz a paragem do ciclo celular e apoptose através da sobre-regulação de p21

WAF1 /CIP1 e indução da atividade da caspase

a seguir, examinou o efeito de aciculatin em proteínas reguladoras do ciclo celular prisão G0 /G1. O inibidores da quinase p21 dependente de ciclina e p27 são reguladores cruciais da prisão G0 /G1. Como mostrado na Figura 2A, a p21 foi significativamente regulada positivamente e a proteína do retinoblastoma (Rb) foi desfosforilado sem qualquer alteração aparente na p27 após 4 h de tratamento aciculatin. Ambos intrínsecas (caspase-9) e extrínsecos (caspase-8) vias apoptóticas foram detectados após 8 horas de tratamento, e o efector a jusante de apoptose da caspase-3 foi também activada (Figura 2B). aumento dependente da concentração na apoptose também foi identificado em 24 h após tratamento aciculatin (Figura 2C). Estes resultados demonstram que o tratamento aciculatin pode desencadear a paragem do ciclo celular HCT116 na fase G0 /G1 e, subsequentemente, induzir a apoptose.

A, as células HCT116 foram tratadas com aciculatin (10 uM) para os períodos indicados e, em seguida, colhidas para detecção proteínas de G0 /G1 de prisão relacionada-(p21, pRb, e p27) por imunotransferência. B, células HCT116 foram tratadas com aciculatin (10 uM) para os períodos indicados e, em seguida, colhidas para a detecção da activação de caspase e clivagem de PARP. C, as células HCT116 foram tratadas com várias concentrações de aciculatin (5, 7,5 e 10 uM) durante 24 h. Após tratamento aciculatin, proteínas apoptóticas foram detectadas concentrações para cada tratamento. A estrela marca uma banda de não-específica.

Aciculatin aumentou a expressão da proteína p53 e seus efetores a jusante através de uma via de degradação mediada por proteassoma

Os fenômenos nossos dados anteriores reveladas são acredita-se estar associada com a proteína supressora de tumor p53. Assim, a expressão de p53 foi examinada numa série de pontos de tempo. Como mostrado na Figura 3A, aciculatin expressão de p53 induzida significativamente de um modo dependente do tempo. A p53 MDM2 produto a jusante, o que também é um importante regulador da degradação de p53 mediada por ubiquitina, verificou-se ser regulada positivamente após a acumulação de p53. Curiosamente, havia uma diminuição da MDM2 durante as primeiras horas de tratamento aciculatin. Em seguida, confirmou a correlação entre aciculatin e danos ao DNA. Os nossos dados indicam que aciculatin apenas um ligeiro aumento de fosfo-ser15-p53, que é a jusante do efeito de danos no ADN. O DNA de fita dupla ruptura marcador fosforilada 2AX histona (γ-H2AX) apareceu até os últimos estágios da aciculatin tratamento. Além disso, para verificar DNA quebras de fita simples e dupla, foi realizada uma única célula de ensaio de eletroforese em gel (teste do cometa). Os resultados mostraram que não há danos no ADN óbvio após 6 horas de tratamento de 10 uM aciculatin com um novo agente danos no ADN QS-ZYX-1-61 (publicado por nosso grupo anteriormente) como controlo positivo, [17]. (Figura S1). Estes resultados indicam que os danos do ADN não é um efeito óbvio no início do tratamento aciculatin. Nós que verificaram esse efeito dependente de p53 em outro p53 tipo selvagem células cancerosas A549. Aciculatin também desencadeou a acumulação de p53, MDM2 esgotamento precoce (3 h) e a subsequente via de apoptose, incluindo caspase-9 clivada e PARP clivada em A549. Para investigar o nível de proteína de factor de transcrição p53 acumulado no núcleo por aciculatin, as fracções nucleares foram extraídas e analisadas. A Figura 3B mostra que a p53 foi aumentada no núcleo de uma forma dependente do tempo após aciculatin tratamento. Para determinar o mecanismo de acumulação de p53 induzida por aciculatin, determinou-se em primeiro lugar o nível de ARNm de p53. A Figura 3C mostra que não houve alteração no nível proeminente de ARNm de p53. Em circunstâncias normais, a proteína p53 tem uma meia-vida muito curto (aproximadamente 15-30 min) devido à rápida degradação do proteassoma. Portanto, verificou-se se aumenta aciculatin meia-vida de p53. Quando cicloheximida foi usada para inibir a biossíntese de proteínas, observou-se que a p53 induzida por aciculatin foi estabilizado e teve uma meia-vida mais longa (Figura 3D). Além disso, nós introduzimos o MG132 inibidor do proteassoma para bloquear a via de degradação. A Figura 3E mostra que o nível de proteína de p53 não foi aumentada por tratamento aciculatin MG132 após pré-tratamento em células HCT116 e A549. Estes resultados demonstraram que a via de degradação mediada por proteassoma é importante para a acumulação de p53 induzida por aciculatin.

A, células HCT-116 e A549 foram tratadas com aciculatin (10 uM) para os períodos indicados e, em seguida, colhidas para a detecção de p53 proteínas relacionados com. Os níveis de p53, fosfo-p53-ser15, γ-H2AX, e o alvo a jusante da p53 MDM2 foram, em seguida, determinada em células HCT116. Os níveis de p53, MDM2, γ-H2AX clivada, caspase-9 e PARP foram determinadas em células A549. A estrela marca uma banda de não-específica. B, extracção nuclear de células HCT116 foi realizada após aciculatin tratamento nos pontos de tempo indicados. acumulação nuclear induzida por Aciculatin de p53 foi demonstrado ser dependente do tempo. C, as células HCT116 foram tratadas com aciculatin (10 uM) em diferentes pontos de tempo, seguido por extracção de ARN total. O ARNm de p53 foi co-amplif içado com GAPDH. D, células HCT116 foram pré-tratados com aciculatin (10? M) durante 3 h, seguido de tratamento com ciclo-heximida (20 ug /ml) com ou sem aciculatin (10 uM) para os períodos indicados. E, células HCT-116 e A549 foram co-tratados com 10? M e 10 MG132 aciculatin uM durante 6 horas e, em seguida, colhidas para a detecção de p53 por imunotransferência.

Aciculatin MDM2 diminui a um nível da transcrição, o qual é crítico para p53 acumulação

Em nosso estudo anterior, não há sinais de danos ao DNA óbvias foram encontrados. Isto pode implicar que esta via não é o único mecanismo que contribui para a acumulação de p53. MDM2 p53 medeia ubiquitinação, levando à degradação de p53 proteossoma. MDM2 também controla a sua própria degradação por auto-ubiquitinação [18]. Neste estudo, a depleção de MDM2 foi encontrado nas fases iniciais do tratamento aciculatin (Figura 3A). Assim, ao lado avaliou o mecanismo de MDM2 ablação para determinar se este decréscimo foi envolvido na acumulação de p53 induzida por aciculatin. Após o co-tratamento com aciculatin e MG132, um inibidor de proteassoma, o nível de proteína MDM2 ainda diminuiu notavelmente em HCT116 e células A549 (Figura 4A). Estes resultados indicam que outras vias de regulação independente de proteassoma estão ativos. Em seguida, examinaram o nível de mRNA e descobriu que MDM2 mRNA começou a diminuir após 1 h de tratamento aciculatin. O mesmo resultado pode ser conseguido em p53-KO HCT116, sugerindo que aciculatin induzida depleção de MDM2 não é um efeito p53-relacionado (Figura 4B). Para identificar a importância de MDM2 no acúmulo de p53, investigamos aciculatin induzida pelo acúmulo de p53 após a sobre-expressão MDM2 em células HCT116. Seguindo aciculatin tratamento, a sobre-expressão de MDM2 inverteu o nível de p53 (Figura 4C). Colectivamente, estes resultados indicam que aciculatin podem induzir acumulação de p53 através da depleção de ARNm de MDM2.

A, células HCT-116 e A549 foram co-tratados com 10? M e 10 MG132 aciculatin uM durante 6 h (HCT116) e 3H (A549), em seguida, colhidas para a detecção de MDM2 por imunotransferência. As células HCT-116 do p53-KO B, HCT116 e foram tratados com aciculatin (10 uM) em diferentes pontos de tempo, seguido por extracção de ARN total. O mARN MDM2 foi co-amplif içado com GAPDH. C, O plasmídeo MDM2 foi introduzido nas células HCT116 para induzir a sobre-expressão da proteína MDM2; as células foram então tratadas com aciculatin durante 3 h. Os níveis de proteína de p53 e MDM2 foram detectados por western blot.

Papel do p53 na parada do ciclo celular mediada por aciculatin e apoptose

Em seguida, teve como objetivo identificar o papel da p53 em aciculatin induzida por interrupção do ciclo celular HCT116 e apoptose. Em primeiro lugar, nós comparamos a citotoxicidade de aciculatin em um HCT116 sistema p53-KO (knockout) p53-WT (tipo selvagem) e. Como mostrado na Figura 5A, encontramos uma diferença significativa no IC

50 entre estas linhas celulares 2; as células WT (IC

50 valor, 5,88 mM) foram mais sensíveis à aciculatin do que as células p53-KO (IC

50 valor, 9,13 uM). Além disso, a proporção de prisão G0 /G1 induzida por aciculatin WT nas células era cerca de 3 vezes mais elevada do que nas células p53-KO depois de 18 h de tratamento aciculatin (Figura 5B). Em seguida, usamos western blot para examinar proteínas p53 e apoptóticos em células HCT116 p53-KO p53-WT e durante aciculatin tratamento. A Figura 5C mostra que as células p53-KO expressaram níveis mais baixos de caspase-3 clivada e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP). A indução de sub-G1 foi também examinada após aciculatin tratamento e os resultados indicam que as células p53-KO eram mais resistentes a aciculatin induzida por incremento sub-G1 (inferior gráfico de barras). A p53 dirigir alvos transcricionais, p21 e PUMA (p53 upregulated modulador da apoptose) estão relacionados com a paragem do crescimento e apoptose. Ambos foram regulados positivamente, após 24 h e 48 h de tratamento aciculatin de um modo dependente da concentração. (Figura 5D). A Figura 5D mostra também knockdown do nível de proteína p53 por ARNsi em p53 células do tipo selvagem e HCT116 A549; isto resultou na inibição significativa da expressão de p53 após aciculatin tratamento, um efeito que durou até 24 h. Esta depleção de p53 levou a revogação de p21 induzida por aciculatin e desfosforilação de Rb; também as proteínas apoptóticas PUMA, caspase-9, caspase-3 e PARP. Depois as células foram duplamente coradas com anexina V-FITC e PI para a apoptose e a necrose, os resultados revelaram que a p53 HCT116 knock-down e as células A549 foram mais resistentes à apoptose induzida aciculatin do que as células do tipo selvagem (Figura 5E). Com base nestes dados, sugerimos que p53 é um mediador crucial da apoptose induzida por aciculatin.

A, células HCT116 p53-KO foram incubadas com aciculatin (5-10 �) durante 48 h. A viabilidade das células foi então determinada por ensaio MTT. Os resultados foram comparados com as células HCT-116 do tipo selvagem. A média ± DP de 3 experiências independentes. *

P Art 0,05 e **

P Art 0,01. B, células HCT-116 do p53-KO foram deixados em jejum durante a noite e, em seguida, incubadas com veículo (0,1% DMSO) ou aciculatin (10 uM) durante diferentes períodos. A proporção de ADN foi subsequentemente analisada por coloração com PI. Os ciclos celulares de p53 wt e células HCT-116 do p53-KO após o tratamento de 18 horas são mostradas. As proporções G1 de ambas as linhas celulares foram comparadas. Os valores médios ± DP de 3 experiências independentes. *

P Art 0,05 e ***

P Art 0,001. C, p53 e p53-WT-KO células HCT116 foram incubadas com aciculatin (10 uM) durante 24 h e 48 h e, em seguida, colhidas para a detecção de p53, a activação de caspases, clivagem de PARP e (superior). células p53 e p53-WT-KO foram tratadas com veículo (0,1% DMSO) ou aciculatin (10 uM) durante 24 h e foram subsequentemente analisados ​​por coloração com PI. A indução da fase sub-G1 de cada grupo foi determinada (inferior bar gráfico). **

P Art 0,005. D, células HCT116 foram tratadas com várias concentrações de aciculatin (5, 7,5, e 10 uM). Após 24 h e 48 h aciculatin tratamento, os níveis de p53, p21, pRb e PUMA foram então determinados (superior). p53 siARN foi usada para derrubar o nível de p53 das células HCT-116 e A549, que foram em seguida tratados com aciculatin durante 24 h. As células foram colhidas para a detecção de p53 e proteínas relacionadas apoptóticos (inferior). células E, p53 HCT116 e A549 knock-down foram tratados com aciculatin (10 mM) durante 40 h e, em seguida coradas com anexina V-FITC e PI. As percentagens de células fluorescente etiquetado foram determinadas por citometria de fluxo.

Aciculatin inibiu o crescimento de células tumorais HCT116 nos modelos de rato de xenotransplante

Para examinar o

in vivo

anti -Câncer actividade de aciculatin, estabelecemos modelos de xenoenxerto derivado de HCT116 em ratinhos imunodeficientes combinados graves (SCID). Ambos controlo e murganhos tratados foram sacrificados e os tecidos tumorais HCT116-xenoenxertado foram examinados. Como mostrado na Figura 6A, os nossos resultados demonstraram que a administração intraperitoneal de aciculatin (30 mg /kg) uma vez por dia o crescimento do tumor inibiu significativamente a partir de 8 dias, sem qualquer perda de peso corporal; isto sugere que não houve citotoxicidade óbvio

in vivo

. Nós também corados os tecidos tumorais HCT116-xenoenxertado com hematoxilina e eosina (Figura 6B-a, b), anticorpo p53 (Figura 6B-c, d) e Ki-67 (Figura 6B-E, F). Os resultados revelaram que o tratamento com aciculatin aumento significativo da expressão de p53 e o marcador de proliferação celular Ki67. Estes observação correlaciona-se com o

in vitro

estudos. As fatias de tecido de tumor, também foram corados com o reagente TUNEL e os resultados indicam que aciculatin-tumor tratado fez sofrer apoptose (Figura 6C).

células HCT116 foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos imunodeficientes combinados graves. Os ratos foram divididos em dois grupos (

N

= 5) e quando os tumores atingiram o volume médio (90 mm

3) o tratamento foi iniciado. Os ratinhos foram sacrificados no dia 12 depois disso. A, As curvas mostram a média tamanhos (± SE) de tumor medidos dentro de cada grupo. As diferenças no tamanho do tumor entre o controlo e os ratos tratados foram estatisticamente significativos (*

P

0,05). Peso corporal foi medido todos os dias desde o dia 1 de administração. Não houve diferenças significativas após o tratamento, em qualquer um dos grupos (dados não apresentados). B, tratado e não tratado fatias de tumor foram avaliadas por H E (a, b) e coloração IHC para a proteína p53 (c, d) e a proteína Ki-67 (E, F). As amostras de tumor foram observados menos de 100 × (por H E) e 200 × (por IHC) ampliação. C, As fatias de tecido de tumor foram avaliadas pelo kit de ensaio TUNEL e os gráficos de barras indica a alteração dobra da fase sub-G1. **

P

. 0,01

Discussão

O p53 proteína supressora de tumor tem sido um alvo promissor da terapia anti-câncer durante décadas. Ela desempenha um papel essencial na regulação do ciclo celular e apoptose. Aqui, demonstramos que aciculatin é um indutor p53 atraente e também activa os efectores a jusante de p53. p21, alvo transcricional bem conhecido de p53, é o principal regulador do ciclo celular fase G0 /G1. Como mostrado na Figura 2A e 5D, a expressão de p21 foi aumentada e pRb foi hipofosforilado aciculatin após tratamento. p21 foi demonstrado anteriormente que se ligam a complexos de Cdk /ciclina, induzindo hipofosforilado pRb para sequestrar E2 região promotora gene do factor 1 (E2F-1) de ligação, inibindo desse modo a capacidade de E2F-1 para levar a cabo o ciclo celular [19].