Abstract

pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer no mundo todo. Apesar de décadas de pesquisa, as opções de tratamento para pacientes com câncer de pulmão continuam a ser insuficientes, quer para oferecer uma cura ou mesmo uma vantagem de sobrevivência substancial devido à sua resistência intrínseca à quimioterapia. Os nossos resultados sugerem a eficácia de capsaicina na expressão de VEGF-regulação para baixo em células de carcinoma de pulmão de células não pequenas (NSCLC), em ambiente hipóxico. Capsaicina-tratamento re-activada de p53-SMAR1 circuito de realimentação positivo nestas células para persuadir mediada por p53 degradação HIF-1α e repressão induzida SMAR1 de expressão de Cox-2, que conteve localização nuclear HIF-1α. Esse sinal-modulações consequentemente baixo regulados expressão de VEGF para impedir a migração de células endoteliais e formação de rede, pré-requisitos da angiogênese no tumor microambiente. Os resultados acima defender a candidatura de capsaicina na segmentação exclusivamente angiogênese pela regulação para baixo VEGF nas células tumorais para alcançar a terapia mais eficiente e convincente de NSCLC resistentes

Citation:. Chakraborty S, Adhikary A, Mazumdar M, Mukherjee S , Bhattacharjee P, Guha D, et al. (2014) Activation capsaicina-induzida da p53-SMAR1 Auto-Regulamentação laço sub-regula VEGF em Non-Small Cell Lung Cancer para conter Angiogenesis. PLoS ONE 9 (6): e99743. doi: 10.1371 /journal.pone.0099743

editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute, da Universidade de Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de dezembro de 2013; Aceito: 16 de maio de 2014; Publicação: 13 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chakraborty et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. SC- University Grants Comissão-UGC 2-8 /2002 (SA I) (SA-I), datado de 06.11.2008. Departamento AA- da Ciência e Tecnologia DST R /3393/06 datado de 16.10.2006. MM- Departamento de Biotecnologia-DBT-RA datado de 05.06.2009. SM Conselho da Scientific and Industrial Pesquisa-CSIR 09/015 (0386) /2010 EMR-1 datado de 22.02.2010. PB- Departamento de Biotecnologia-DBT-RA datado de 01.06.2010. DG-University Grants Comissão-UGC 2-8 /2002 (SA I), datado de 21.04.2011. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma do pulmão de não pequenas células Altamente resistente (NSCLC), que compreende 80% de todos os cânceres de pulmão é intrinsecamente resistentes à quimioterapia e /ou radioterapia. Uma vez que, a angiogénese é essencial para o crescimento e metástases NSCLC, controlando, por conseguinte, a angiogénese associada ao tumor pode ser uma tática promissora em limitar a progressão do NSCLC. Vários factores pró-angiogénicos tais como factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) são altamente expressos no microambiente do tumor e induzir fortemente angiogenesishttp tumor: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3827603/- b3 [1] . Esta mudança do microambiente tumoral para um estado angiogénico, ou “interruptor angiogénico” [1], [2], é importante uma taxa de factor limitante no desenvolvimento de tumores.

A expressão do gene de VEGF tem sido mostrado para ser regulada por hipóxia [3] – [5] e rotatividade do VEGF é mediada pela hipoxia-inducible factor-1 (HIF-1) [2], [3]. Sob condições de normóxia, os níveis de HIF-1α são fortemente regulada pela tensão de oxigénio através da hidroxilação de resíduos prolilo, enquanto que as condições hipóxicas impedir a hidroxilação prolil de HIF-1α [4] e a proteína é estabilizada, o que lhe permite transactivar genes alvo tais como VEGF [3] . A riqueza de relatórios firmemente ligar HIF-1α para p53 em uma relação inversa em que p53 inibe a transcrição HIF-1α [6] e induz a sua degradação sob diversas condições sub-celulares de estresse [7], assim http: //www.jbc. org /search author1 = Joanna + Zawacka-Pankau ? sortspec = data submit = Submitresulting em sua potente repressão. Curiosamente, p53 é estabilizada por SMAR1, uma proteína de ligação à região associado à matriz de andaime, através do deslocamento de proteínas MDM2 de bolso p53 de terminal-N e, portanto, o resgate de p53 a partir da degradação mediada por Mdm2 proteossómica [8]. Relatos contemporâneos [9], [10] demonstram que, em danos no DNA leve SMAR1 promove p53 deacetylation através do recrutamento de HDAC1 e, especificamente, reprime a expressão Bax e Puma inibindo assim a apoptose. Estes relatórios não só confirmam a candidatura de SMAR1 na modulação da actividade de p53, mas também aumentam a possibilidade de envolvimento de p53 em outras funções celulares no micro-ambiente que danificam o ADN leve da célula. É importante ressaltar que vários estudos também identificaram complexos cruzadas conversações entre p5

3 Comprar e Cox-2, em que Cox-2 suprime p53-rede em células de câncer [11], [12] e

[12]. Todas estas informações tentado nós para processar uma visão sobre a existência de uma relação interactiva entre SMAR1, p53, COX-2 e HIF1-α, se houver, que decide o destino da expressão de VEGF durante a angiogénese tumoral em NSCLC. A inibição do crescimento do tumor por agentes anti-angiogénicos tem sido alcançada, onde as respostas antitumorais promissores foram relatados para uma variedade de agentes anti-VEGF. No entanto, a toxicidade da maior parte destes fármacos, bem como o desenvolvimento de resistência a esses agentes significar a necessidade de identificar os agentes não tóxicos alternativos para alcançar a inibição da angiogénese contínuo para a terapia de NSCLC eficaz.

A evidência crescente indicou a anticancerígeno efeitos da capsaicina (8-metil-

N

-vanillyl-6-nonenamida), o componente activo de pimenta, contra vários cancros [13] – [18]. A capsaicina tem sido relatado para provocar a apoptose e restringe o benzo (a) pireno induzida tumorigénese do pulmão em ratinhos Swiss albinos [19] e alivia o desequilíbrio em enzimas metabolizadoras de xenobióticos e marcadores tumorais [20]. De acordo com Anandakumar

et al.

[20] capsaicina modula o sistema de defesa antioxidante pulmonar durante o benzo (a) cancro do pulmão induzida por pireno em ratos albinos suíços [19]. Além disso, a capsaicina exibe actividade anti-proliferativa contra o cancro do pulmão de células pequenas humano em cultura de células e modelos de ratinhos nus por meio da via de E2F [21]. relatório recente do nosso laboratório mostrou o efeito apoptogénica de capsaicina em células NSCLC humanos [22]. No entanto, não existe qualquer relato sobre o papel deste fitoquímicos na angiogénese induzida por NSCLC. Além disso, embora capsacin foi mostrado para suprimir a angiogénese induzida por fibrossarcoma humano no ensaio de membrana corioalantóica de pintainho [23], através da inibição da proliferação induzida por VEGF, e do tipo capilar formação do tubo de células endoteliais humanas de cultura principal, o efeito deste fitoquímicos na a expressão de VEGF em células NSCLC ainda não tem sido explorado em detalhe.

Os resultados significam que, apesar de impedimento de p53-SMAR1 circuito induzida a expressão de VEGF em células NLCSC favorecendo, assim, de células endoteliais (CE) de migração e formação de rede no ambiente tumoral , reenquadramento destes sinais pró-angiogénicos por capsaicina bloqueou a produção de VEGF, mesmo sob condição hipóxica, restringindo, assim, induzida por NSCLC formação trabalho líquido pelas células endoteliais. Essa evolução na compreensão pode oferecer o panorama da segmentação exclusivamente factores pró-angiogénicos e caminhos para alcançar a terapia mais eficiente e convincente câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

cultura celular

linhas celulares de cancro humano, A549, células MCF-7, HeLa, HCT-15, e fibroblastos de pulmão normais WI-38, foram obtidos a partir de National Center for Cell Science, índia e mantidos a 37 ° C e 5% de CO

2 em meio DMEM suplementado com FBS a 10% (Lonza, NH), L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (100 ug /mL), aminoácidos não essenciais (100 uM), estreptomicina (100 ug /ml), penicilina (50 U /ml; Invitogen, CA) [24]. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram obtidas a partir de HIMEDIA de Cultura Celular (Bombaim, índia), e mantida a 37 ° C e 5% de CO

2 em M199 (Gibco, Grand Island, NY) suplementado com FBS a 20% e suplemento CE crescimento (ECGS; BD Biosciences, Bedford, MA). Todas as experiências foram realizadas com células HUVEC entre as passagens 2-5. o número de células viáveis ​​foram determinadas por Trypan teste de exclusão de azul [11].

Para imitar hipóxia, células A549 foram cultivadas em presença de 100 mmol /L CoCl

2 (Sigma, St Louis). As células foram tratadas com capsaicina (Sigma, St. Louis) como exigido no experimento. Quando necessário, as células A549 foram tratadas com Brefeldina A (1 ug /ml, Calbiochem, NJ) e /ou Mg 132 (10 uM, Sigma, St. Louis) e /ou VEGF recombinante (0,8 ng /ml, para manter a quantidade equivalente de VEGF que estava presente nos meios de Hy-A549 gastos que foi utilizado a 01:01 proporção com M199 em células endoteliais; Peprotech, CA) e /ou anticorpo neutralizante de VEGF (25 ng /ml, R D Biosystems, MN), 6 horas antes que as células colheita.

cicatrização de feridas ensaio

ensaio de cicatrização de feridas foi realizada para avaliar a migração de HUVECs. As células foram semeadas em placas de 12 poços e deixou-se formar monocamadas confluentes. As monocamadas foram então riscado horizontalmente usando um estéril 100 mL ponta da pipeta. Em seguida, as células foram cultivadas em meio contendo FBS a 0,5% durante a noite e expostas a diferentes concentrações de agentes. As células foram lavadas com PBS e cultivadas em meio DMEM. imagens de campo claro de os pontos de vista selecionados aleatoriamente ao longo da linha raspada foram tomadas. A migração foi quantificado através de um processo assistido por computador semi-automatizado por uma pessoa cega no que diz respeito ao tratamento experimental-. Os dados a partir de poços em triplicado foram calculados como a média +/- SEM. A taxa de migração de células de controlo foi tomado como 100% e o de outras placas foram comparados com as células de controlo [25].

Sprout ensaio de formação de

Matrigel Matrix (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) foram descongeladas a 4 ° C durante a noite. placa de 12 poços foi revestido com 500 ul de Matrigel /por poço e incubou-se a 37 ° C durante 20 min para a polimerização. HUVECs (1 × 10

5) foram re-suspensas em 500 ul de M199 contendo 2% de FBS e diferentes concentrações de agentes, e semearam-se sobre a placa de Matrigel-revestido. Depois de 6-8 horas de incubação, HUVECs no grupo de controle formado estrutura tubular, que foram definidas como formações medula endoteliais que ligados em ambas as extremidades. formação do tubo foi visualizada por microscopicamente (Olympus IX71) e fotografias de 10 campos selecionados aleatoriamente foram capturados pela câmera CCD.

Western blotting e co-imunoprecipitação

As células foram homogeneizadas em tampão Hepes (20 mM Hepes, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM

2, 1 mM de Na-EDTA, 1 mM de Na-EGTA e DTT 1 mM) suplementado com misturas de inibidores da protease e fosfatase [24]. A concentração total de proteína de lisado celular foi estimada pelo método de Lowry. Quantidades iguais de proteína foram sujeitos a SDS-PAGE, e, em seguida, electricamente transferidas para membranas de PVDF (Millipore, Darmstadt, Alemanha). Subsequentemente, a membrana foi bloqueada durante 1 h com leite magro a 5% em TBS-0,1% Tween 20 (TBST) e sondadas com anticorpos específicos como, anti-VEGF, anti-TGF-β, anti-EGF, anti bFGF, anti-HIF-1α, anti-p53, anti-COX-2, anti-SMAR1 /PNAB, anti-H1-Histona e anti-α-Actina (Santa Cruz, CA), anti-fosfo-ser15-p53, anti- EGFR (sinalização celular, MA). A proteína de interesse foi visualizado por quimioluminescência (GE Biosciences, NJ) [24]. Para a co-imunoprecipitação, imunocomplexos de lisado de células inteiras foram purificados utilizando o anticorpo específico e pérolas de proteína A-Sepharose ‘(Invitrogen, MD) e coradas imunologicamente. A proteína de interesse foi visualizada por quimio luminescência. carga de proteína equivalente foi verificada utilizando anticorpos anti-alfa-actina.

A citometria de fluxo

Para a determinação da morte celular por apoptose, as células foram coradas com iodeto de propídio (PI) e anexina-V-FITC ( BD Pharmingen, CA) e analisadas num citómetro de fluxo (FACS Callibur, BD Biosciences, CA). compensação electrónica do instrumento foi feita para excluir a sobreposição dos espectros de emissão. Total de 10000 eventos foram adquiridos por análise utilizando o software CellQuest (BD Biosciences, CA) [26]. células de Anexina-V-positivos foram considerados como células apoptóticas precoces [24]. Para a quantificação do VEGF intracelular, as células pré-tratadas com Brefelidin A foram colhidas, lavadas com PBS, fixadas com 4% de paraf ormaldeido durante 10 minutos e permeabilizadas com 0,1% de Triton-X-100 durante 5 minutos e incubou-se com anticorpo anti-VEGF seguido pelo anticorpo secundário conjugado com TRITC-. A fluorescência foi determinada fluxo cytometrically usando software CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA).

imagens de fluorescência

As células cultivadas em uma lamela foram fixadas com 4% de para-formaldeído e foram coradas com anticorpo específico após permeabilização com Triton X-100, seguido por anticorpo secundário TRITC /conjugada com FITC e visualizadas com o microscópio confocal (Carl Zeiss, Alemanha).

ELISA

O meio condicionado das células foi recolhido e clarificado por centrifugação a 2000 rpm durante 10 min. A concentração da proteína de interesse foi medida utilizando o kit de ELISA de acordo com as instruções do fabricante (Biotech Ray, GA).

RT-PCR ensaio

Seguindo Saha

et ai

. [11], 2 ug dos ARNs totais extraídos com Trizol reagente (Invitrogen, CA, EUA) foi transcrito reversamente e sujeito a PCR usando o sistema RTplus PCR (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), um sistema de PCR GeneAmp 2720 (Applied Biosystems; Foster City , CA). Os ADNc resultantes foram amplificadas com os iniciadores específicos para VEGF 5′-GAGATGAGCTTCCTACAGCAC-3 ‘(directo) e 5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3′ (inverso), p53 5’-CCCACTCACCGTACTAA-3 ‘(directo) e 5’-3-GTGGTTTCAAGGCCAGATGT ‘(reverso), HIF-1α 5′-TGGTGACATGATTTACATTTCTGA-3′ (para a frente) e 5’-AAGGCCATTTCTGTGTGTAAGC-3 ‘(reverso), SMAR1, 5′-GCATTGAGGCCAAGCTGAA-AGCTC-3′ (para a frente) e 5’-GGAGTTCAGGGTGATGAGTGTGA C -3 ‘(inverso), a COX-2 5′-TGAT-CGAAGACTACGTGCAACA-3′ (directo) e 5’-GCGGATGCCAGTGATAGAGTG-3 ‘(inverso) e GAPDH (padrão interno) 5′-CAGAACATCATCCCTGC-CTCT-3′ (para a frente ), 5’-GCTT-GACAAAGTGGTCGTTGA-G-3 ‘(inverso).

plasmídeos e transfecções siRNA

p53 pcDNA3.1, pcDNA3.1 e pcDNA3.0 SMAR1 COX-2 ou SMAR1-shRNA (300 pmol /milhão de células), e vectores de pcDNA3.0 de controlo (2 ng /milhão de células) foram introduzidos em células cancerosas em crescimento exponencial utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen, CA) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Estavelmente clones que expressam foram isolados por diluição limitante, por selecção com G418 (400 ug /ml; Cellgro, EUA) e puromicina (1 jag /ml; Cellgro, EUA) durante 14 dias, e as células sobreviventes neste tratamento foram clonados e avaliadas para a p53, SMAR1 e Cox-2 por imunotransferência. Por endógeno silenciamento de genes específicos, as células foram transfectadas com 300 pmol de HIF-1α- /Cox-2 -siRNA (Santa Cruz, CA) e p53 shRNA (Santa Cruz, CA) utilizando lipofectamina-2000 durante 12 h. Os níveis de ARNm e de proteína foram determinadas por RT-PCR e transferência de Western.

Cromatina imunoprecipitação e PCR

O ensaio chip foi realizada como descrito anteriormente pelo nosso laboratório [9]. Resumidamente, contas de agarose foram bloqueadas com BSA a lavagem e, a seguir, os grânulos foram pré-incubadas com o anticorpo contra SMAR1 /PNAB (BTG-3 proteína nuclear associado; Santa Cruz, CA). Os lisados ​​celulares foram sonicados para cortar o ADN para comprimentos entre 200 e 1000 pares de bases e, em seguida, centrifugados a 13000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram diluídos 10 vezes em tampão de diluição chip e adicionado às contas de agarose peletizadas que foram pré-incubadas com anticorpos. A seguir à incubação durante a noite a 4 ° C, as esferas foram lavadas com baixo teor de sal, elevado teor de sal, LiCl e tampões Tris /EDTA. Finalmente, a cromatina foi eluída por incubação das esferas com 5 M de NaCl a 65 ° C e as proteínas foram removidas por tratamento com proteinase K. chip de ADN foi então purificado usando um kit de purificação adequada e armazenado a -20 ° C. ADN ChIP SMAR1-ligado foi amplificado utilizando PCR. As sequências prováveis ​​de locais de ligação SMAR1 sobre a COX-2 do promotor são como se segue: Local-1: 5′-TGA-CCAGCATCCCAAATGTA-3 ‘(directo) e 5′-TGAGGGA-AAAACAGGGCATA-3′ (inverso); Site-2 5’-CAAAAAGAAAATGA-TCCACGC-3 ‘(para a frente) e 5′-TCATGAGACACGGATGCCTA-3′ (reverso); Site-3 5’-CCGTGTCTCA-TGAGGAATCA-3 ‘(para a frente) e 5′-ATCATGGGTAGTGCTCAGGG-3′ (reverso); Site-4 5’-TGCT-GTCATTTTCCTGAATGC-3 ‘(para a frente) e 5′-GGGGATTTTGACAGTTGGAA-3′ (reverso); Site-5 5’-GCCCAGGCA-ACTGAAAAGTA-3 ‘(para a frente) e 5′-CTCCCTGATGCGTGGATTAT-3′ (reverso); local-6 5’-TTT-TGGACATTTAGCG-TCCC-3 ‘(para a frente) e 5′- TGTTCTCCGTACCTTCA -CCC-3′ (reverso); Site-7 5’-TACCTTTCCC-GCCTCTCTTT-3 ‘(para a frente) e 5′-TGGGGCGAGTA-AGGTTAAGA-3′ (reverso); Site-8 5’-AAC-CTTACTCGCCCCAGTCT-3 ‘(para a frente) e 5′- CAGA-AGGACACTTGG-CTTCC-3’ (reverso).

Quantitative PCR em tempo real

Quantitative reais -tempo de PCR foi feito para quantificar os níveis de expressão dependentes do tempo de VEGF e HIF-1α em células Hy-A549 tratados com capsaicina (22). Quantitative PCR em tempo real foi realizada em gradiente de Mestrado cycler (Applied Biosystems 7500 Sequence Detection System) utilizando SYBR verde-mistura Rox (ABgene, Epsom, Reino Unido). Os iniciadores utilizados para o VEGF são 5′-TCACAGGTACAGGGATGAGGACAC-3 ‘(directo) e 5′-CAAAGCACAG-CAATGTCCTGAAG-3′ (inverso) e de HIF-1α 5’-TGGTGACATGATTTACATTTCTGA-3 ‘(directo) e 5’-3-AAGGCCATTTCTGTGTGTAAGC ‘(reverso).

análise estatística

Os valores foram apresentados como erro padrão da média (SEM) ou representante da experiência típica, exceto quando indicado em contrário. Os dados foram analisados ​​e, quando apropriado, a significância das diferenças entre os valores médios foi determinada por

t

teste de Student. foram consideradas significativas para os resultados

p Art 0,05. Todos os experimentos foram realizados de forma independente por três vezes

Resultados

A capsaicina inibe a migração e rede de formação CE induzida por NSCLC

Desde a migração CE é um passo crucial para a angiogênese induzida por tumor.; investigou-se a migração de células HUVEC na presença do meio gasto a partir de culturas de ambas as células normais e NSCLC. Em essência, HUVEC foram cultivadas na ausência ou na presença de meio gasto de células de fibroblasto de pulmão normal (WI-38) e células NSCLC (A549), bem como células A549

2-estimuladas COCl (HY-A549). Resultados do ensaio de cicatrização da ferida apresentou invaginação não significativa de células HUVEC na presença de meio gasto de células WI-38, ao passo que, a migração significativa foi observada na presença de meios A549 passado, uma situação simulando a condição portador de tumor (Figura 1A) . Percentagem de migração de HUVEC era ainda mais em Hy-A549 meios gastos (Figura 1A), indicando que a condição hipóxica favorece a angiogénese. células Hy-A549 foram, por conseguinte, utilizado para o descanso das experiências para especificar condição hipóxica.

(A) A migração de HUVEC em presença ou ausência de meio gasto de NME, WI-38, A549 e A549-Hy (CoCl

2-estimuladas para mimetizar a condição hipóxica necessário para a angiogénese induzida por tumor) foram submetidos a ensaio de cicatrização da ferida bidireccional durante 24 h (

esquerdo do painel

). O número de células que migraram na área da ferida são representados graficamente (

painel direito

). (B) Imagens representativas da migração HUVEC mediante incubação com tratados com capsaicina (0-50 mm) de células Hy-A549 médio gasto (

painel esquerdo

). celular cento migraram na área da ferida foi representado graficamente (

painel direito

). células (C) Hy-A549 foram tratados com capsaicina numa forma dependente da dose durante 24 horas e a viabilidade celular foi marcado por ensaio de azul de tripano de corante de exclusão (

esquerdo do painel

). células Hy-A549, tratados com capsaicina (37,5 ^ M), foram submetidos a Anexina V-FITC /PI ligação e analisados ​​fluxo cytometrically para a determinação da percentagem de apoptose precoce (

painel direito). (D) Efeito citotóxico de diferentes doses de capsaisin em células HUVEC foram medidos por ensaio de azul de tripano de corante de exclusão. (E) representação gráfica de migração de HUVEC após incubação com meio gasto a partir tratados com capsaicina (37,5 uM) HBL-100, HCT-15, HeLa e A549. (F) Imagens representativas de capilar-como formação de broto por HUVECs na presença dos meios de comunicação sozinho ou gastos de mídia de WI-38 /A549 /Hy-A549 /tratados com capsaicina Hy-A549. Os valores são média ± SEM de três experiências independentes em cada caso, ou um representante de experiência típica.

Curiosamente, passou-media dos doentes tratados com capsaicina Hy-A549 inibiu significativamente a migração de HUVEC induzida por tumor em uma dose de capsaicina forma dependente, o efeito óptimo estar em 37,5 mM de capsaicina em 24 h para além do qual nenhuma outra mudança significativa poderia ser obtidos (Figura 1B). O efeito da capsaicina sobre a viabilidade das células Hy-A549 foi examinado por ensaio de azul de tripano de corante de exclusão. Figura 1C (

painel da esquerda)

representado o efeito dependente da dose de capsaicina sobre a viabilidade das células Hy-A549, bem como de HUVEC (Figura 1D). Os resultados indicaram que a exposição durante 24 h, a capsaicina não induziu qualquer morte significativa em qualquer das células, até concentrações de 37,5 pM. Estes resultados, assim, descartou a possibilidade de retardo da migração CE devido à morte celular Hy-A549 nesta concentração de capsaicina. No entanto, concentrações superiores de 37,5 uM foram considerados tóxicos para ambas as células A549 e Hy-HUVEC (Figura 1C,

painel da esquerda

e 1D). Experiências adicionais foram por conseguinte, restritos a 37,5 uM. Para avaliar se a redução no número de células é devido à apoptose precoce, o número de células positivas para a Anexina-V foi determinada por citometria de fluxo. Resultados da Figura 1C (

painel direito

) demonstraram 37,5 doses � de capsaicina como dose sub-apoptótica para células Hy-A549. Estes resultados em conjunto assegurada a ausência de “interferência” de células apoptóticas em 37,5 uM dose de capsaicina utilizada nas experiências subsequentes. Que o efeito da capsaicina não é restrita a um tipo específico, foi validada utilizando uma bateria de linhas de células, isto é, HBL-100, HCT-15, HeLa e MCF-7 (Figura 1E). No entanto, para estudos mecanísticos detalhados experiências foram realizadas com células Hy-A549.

Em seguida, o ensaio de formação de rebento de ECs foi realizada em Matrigel, um ensaio de angiogénese bem estabelecida. HUVECs formado redes tubulares dentro de 8 h (Figura 1F). formação de rebento angiogénico de HUVEC era mais alto na presença de meio gasto de células Hy-A549 seguido por aquele de células A549 e células WI-38 (Figura 1F). No entanto, a capsaicina pré-tratamento da Hy-A549 efetivamente impedido a formação de broto por HUVECs (Figura 1F), onde estruturas tubulares foram reduzidos, tanto em largura e em comprimento e mostrou incompleta, bem como estruturas de rede quebrados (Figura 1F).

a capsaicina inibe VEGF para retardar induzida por migração de células de cancro

CE

Todas as reacções ocorreram até agora definida independente do contacto directo das células HUVEC com células tumorais ou mesmo proximidade, aumentando assim a possibilidade de a presença de tumor -shed fatores pró-migratórias solúveis nos meios gastos. Apoiando isto, passou médio de tratados com Brefeldin-A Hy-A549 não conseguiu induzir migração significativa CE (Figura 2A) e capsaicina não poderia introduzir qualquer outro efeito (Figura 2A). Para voltar a confirmar a nossa hipótese, efeito de capsaicina na regulação factores pró-angiogénicos, como o VEGF, bFGF, EGF, TGF-β, foi monitorizado em Brefeldin-A-Hy células A549 pré-tratada. Embora capsaicina não conseguiu alterar o bFGF, EGF e TGF-β significativamente regulada negativamente a expressão de VEGF (Figura 2B). Estudos adicionais revelaram que os meios gastos das células Hy-A549 (10

6 células /ml de meio) continham uma média de 1,6 ng de VEGF que reduziu significativamente após capsaicina tratamento (Figura 2C,

painel da esquerda)

. Para julgar o efeito da capsaicina na regulação do VEGF em células Hy-A549, adotamos algumas abordagens. Na primeira abordagem, células Hy-A549 quando Brefeldina A pré-tratados foram tratados com capsaicina durante 24 h, o VEGF foi revogada intracelular tanto em ARNm e os níveis de proteína (Figura 2C,

meio painel

). Estas observações foram ainda apoiada pela nossa quantitativa em tempo real de dados de PCR representando uma diminuição na expressão relativa de mRNA VEGF em células Hy-A549 após o tratamento capsaicina (Figura 2C,

painel direito

) e re-confirmada por microscopia confocal (Figura 2D). Na segunda abordagem, os meios de controlo suplementado com VEGF recombinante (0,8 ng /ml) aumento da migração de células endoteliais e formação de broto (Figura 2E 2F). Na terceira abordagem, quando o meio gasto pré-tratados com capsaicina Hy-A549 foi completada com proteína recombinante de VEGF (0,8 ng /ml), a reversão do efeito de capsaicina sobre a migração CE e germinar formação foi observada (Figura 2E 2F). Na quarta abordagem, células HUVEC mostrou redução significativa na migração (Figura 2E) e a formação de rebento (Figura 2F) quando o meio gasto de células Hy-A549 foi pré-tratada com o anticorpo anti-VEGF. No entanto, o anticorpo anti-VEGF não apresentou qualquer efeito significativo adicional inibitório sobre a migração HUVEC e formação de broto em capsaicina media Hy-A549 gastos pré-tratados (Figura 2E 2F). Estes resultados, juntamente validou a hipótese de que células-derramado Hy-A549 VEGF desempenha um papel crucial na migração CE induzida por câncer e formação de broto. observações supra-mobilados tentado-nos para demarcar o mecanismo completo subjacente à regulação da angiogénese tumoral pela capsaicina.

(A) microfotografias de contraste de fase Representante demonstrando HUVEC migração mediante a incubação com meio gasto de-Brefeldin-A pré-tratados, a capsaicina ( 37,5 mM) tenha sido tratada com células Hy-A549 (

painel esquerdo

). celular cento migraram na área da ferida foi representado graficamente (

painel direito

). (B) Imunotransferência mostrando os perfis de factores pró-angiogénicos expressão de VEGF, bFGF, EGF, TGF-β, na presença ou ausência de capsaicina. (C) de VEGF segregada a partir do sobrenadante isento de células de Hy-A549 foi quantificada por ensaio ELISA (

painel da esquerda

). perfis de expressão dependente do tempo do VEGF-mRNA /-protein em células Hy-A549 tratados com capsaicina foram determinados por Western blot e RT-PCR, respectivamente (

painel do meio

). células Hy-A549 tratado com capsaicina foram examinadas para a variação dependente do tempo nos perfis de expressão de VEGF por análise quantitativa por PCR em tempo real e representada graficamente (

painel direito). (D) as imagens imuno-fluorescente (60x de ampliação) mostra o teste padrão dependente do tempo da proteína de VEGF (TRITC-fluorescente) em células Hy-A549 tratado com capsaicina foram representado juntamente com coloração nuclear (DAPI: azul). (E) Imagens representativas da migração de HUVEC após incubação com meio de controlo suplementado com VEGF recombinantes (I), ou meios gastos suplementado por VEGF de células Hy-A549 tratado com capsaicina, ou com (ii) tratados com anti-VEGF Hy-A549 passado media (

painel esquerdo

). celular cento migraram na área da ferida é uma representação gráfica (

painel direito

). (F) Imagens representativas de capilar-como formação de broto por HUVECs mediante incubação com meio gasto com suplemento de VEGF recombinantes de células Hy-A549 tratados com capsaicina ou com meios gastos anti-tratados com VEGF Hy-A549. GAPDH /α-actina foi utilizado como controlo de carga interna. Os valores são média ± SEM de três experiências independentes em cada caso ou representante da experiência típica.

A capsaicina inibe a transcrição de VEGF, visando HIF-1α

Como a capsaicina reduz VEGF tanto no transcricional bem como os níveis de translação a hipótese de que esta fitoquímicos pode ter um efeito regulador sobre a HIF-1α, o principal factor de transcrição de VEGF durante hipoxia [4]. Curiosamente, a capsaicina reduzida HIF-1α ao nível da proteína, mas não no nível de ARNm em células Hy-A549 (Figura 3A,

esquerdo do painel

), o qual foi adicionalmente confirmada pela nossa quantitativo em tempo real de dados de PCR (Figura 3A,

painel direito

). células Hy-A549 Além disso, HIF-1α-siRNA-transfectadas decorados diminuição na expressão de VEGF (Figura 3B) e meios gastos destes transfectantes demonstrou significativamente menor migração CE (Figura 3C). Estes resultados indicaram que a capsaicina inibida por baixo VEGF-modulando a sua chave de factor de transcrição HIF-1α (Figura 3C). No entanto, uma vez que a capsaicina tratamento destes transfectantes demonstrou redução adicional em VEGF, o envolvimento da via de HIF-1α-independente (s) da inibição do VEGF por capsaicina não pode ser negada.

(A), os perfis de expressão dependente do tempo do HIF -1α ARNm e -protein foram determinados por Western blot e RT-PCR, respectivamente, em células Hy-A549 tratados com capsaicina (

esquerdo do painel

). células Hy-A549 tratado com capsaicina foram examinadas para a variação dependente do tempo nos perfis de HIF-1α expressão por análise quantitativa por PCR em tempo real e representada graficamente (

painel direito). (B) As células Hy-A549, transientemente transfectadas com um controlo não-segmentação siRNA ou HIF-1α-siRNA, foram incubadas com /sem capsaicina durante 24 h; as células foram então analisadas para determinar a expressão de VEGF em proteína e os níveis de ARNm (

painel da esquerda

). Immunoblot mostrando a eficiência de transfecção de HIF-1α (

painel direito

) (C) de células-sobrenadantes Control-siRNA /HIF-1α-siRNA-transfectadas Hy-A549 foram utilizados para avaliar a migração HUVEC pela cicatrização de feridas ensaio depois de capsaicina -Tratamento (37,5 mM; 24 h) e representada graficamente. (D) o perfil de expressão dependente do tempo do ARNm de p53 e -protein foi determinada por transferência de Western e por RT-PCR em células Hy-A549 tratados com capsaicina (

esquerdo do painel

). fosforilação p53 na serina-15 posição também foi avaliada (

painel direito

). células (E), Hy-A549 transfectadas com controlo-shRNA /p53-shRNA foram incubadas com capsaicina durante 24 h e HIF-1α VEGF-mRNA e -protein foram determinados por Western blot e RT-PCR (

painel da esquerda

). eficiência de transfecção foi verificada por análise de nível de expressão da p53 (

direito painel

). (F) HIF-1α foi imunoprecipitada a partir de lisados ​​de células Hy-A549 tratado com capsaicina e imunotransferidas com anticorpo anti-Ub para ensaiar ubiquitinação HIF-1α. A escada de bandas representadas ubiquitinadas HIF-1α. Na experiência paralela, os imunoprecipitados foram ensaiados quanto a níveis de HIF-1a por Western blot. entrada proteína comparável foi confirmada por transferência de Western directa com anti-α-actina utilizando 20% dos lisados ​​das células que foram utilizadas para imunoprecipitação. células Hy-A549 pré-tratados com a droga (L) de controlo e MG-132 foram submetidas a capsaicina-tratamento durante 24 horas e depois foram examinados quanto à expressão de HIF-1α /VEGF por Western blotting. α-actina /GAPDH foi usada como controlo de carga interna. Os valores são média ± SEM de três experiências independentes em cada caso ou representante da experiência típica.

A capsaicina tem como alvo HIF-1α em um dependente de p53 maneira

Desde p53 visa diretamente HIF- 1α para a degradação proteossomal [9], avaliamos o papel de p53, se houver, na regulação induzida por capsaicina de HIF-1α e VEGF.