Abstract

Uma das características do microambiente do tumor é a flutuação de oxigênio, que resulta de hiper-proliferação e metabolismo anormal de células tumorais, bem como desorganizado neo-vascularização. Reoxigenação de tumores pode induzir o stress oxidativo, o que conduz a danos no ADN e a instabilidade do genoma. Embora as respostas celulares a hipóxia são bem conhecidos, pouco se sabe sobre a resposta dinâmica após reoxigenação. A fim de investigar as respostas transcripcionais de adaptação tumor a reoxigenação, cancro da mama MCF-7 foram cultivadas em 0,5% de oxigénio durante 24 h seguida por 24 h de reoxigenação em normoxia. As células foram colhidas às 0, 1, 4, 8, 12 e 24 h durante a reoxigenação. O perfil de transcrição de células MCF-7 após a reoxigenação foi examinada utilizando Humanos Ilumina-6 BeadChips V3. Foram identificados 127 genes diferencialmente expressos, dos quais 53,1% foram up-regulamentados e 46,9% foram regulados negativamente sobre a reoxigenação. A análise revelou que a via rede factor de transcrição HIF-1-alfa e alvos validados de activação da transcrição de C-MYC foram significativamente enriquecida nestes genes expressos diferencialmente. Entre estes genes, um subconjunto de genes de interesse foi ainda validado por PCR quantitativa de transcrição reversa. Em particular, humana N-MYC gene 1 regulada para baixo (

NDRG1

) foi altamente reprimida após reoxigenação. NDRG1 está associada com uma variedade de condições de crescimento-regulação do stress e de células. Para determinar se

NDRG1

desempenha um papel na reoxigenação, proteína NDRG1 foi sobre-expresso em células MCF-7. Após a reoxigenação, superexpressão de

NDRG1

migração celular significativamente inibido. Nossos resultados revelaram a natureza dinâmica da expressão de genes em células MCF-7 sobre reoxigenação e demonstrou que

NDRG1

está envolvido na adaptação tumor a reoxigenação

Citation:. Lai LC, Su YY, Chen KC , Tsai MH, Sher YP, Lu TP, et al. (2011) Down-Regulamentação do

NDRG1

Promove migração das células cancerosas durante a reoxigenação. PLoS ONE 6 (8): e24375. doi: 10.1371 /journal.pone.0024375

editor: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de julho de 2011; Aceito: 05 de agosto de 2011; Publicado: August 30, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Lai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado em parte por doações da China Medical University, Taiwan (não darão nenhuma 97F008-119;. 99F008-308; https://english.cmu.edu.tw/) e do Centro de Medicina Genômica da Universidade Nacional de Taiwan (não darão nenhuma . 99R81400; https://www.cgm.ntu.edu.tw/chinese2007/eng_index.asp) e Conselho Nacional de Ciência (Grant No. 98-2320-B-002-044-MY3, http: //web1. nsc.gov.tw/mp.aspx?mp=7). Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

populações tumorais precisam superar barreiras microambiente distintos antes da metástase para outros órgãos. cancros invasivos, por conseguinte, pode ser visto como uma série de adaptações no fenótipo às suas microambientes. Todos os microambiente do tumor são caracterizadas pela privação de nutrientes, de pH baixo, e hipoxia [1]. Essas mudanças estavam ligados à perfusão déficits em tumores sólidos, que vinham do crescimento tumoral rápida e vasculatura profundamente desorganizada [2]. Tem sido sugerido que o microambiente do tumor é um local único para a progressão do tumor, o que requer adaptações genéticas em células cancerosas para posterior sobrevivência e proliferação. stress celular induzida pelo microambiente, especialmente hipoxia [3], [4] e reoxigenação [5], [6], pode fazer com que essas alterações genéticas.

Regiões de hipóxia são uma característica comum em tumores sólidos. O oxigênio é um fator limitante devido ao desequilíbrio entre O

2 entrega e consumo [7]. O

deficiência de O 2 é atribuído ao vasculatures insuficientes e consumo de oxigénio em camadas de células sucessivas distal ao lúmen do vaso; simultaneamente, há um aumento em O

2 consumo devido à alta taxa metabólica de células tumorais. Muitos estudos têm relatado que os tumores hipóxicos foram mais maligno e resistente à terapia, e, portanto, tinha um pior prognóstico [8]. Este fenómeno foi demonstrado em muitos tipos de tumor [9], [10].

Além disso, a concentração de oxigénio no interior de uma região de hipoxia é altamente variável. Desde vasculaturas tumorais são altamente ineficiente e instável, as células vermelhas do sangue de fluxo para as regiões de hipoxia, o que resulta na reperfusão ou reoxigenação [11]. Reoxigenação não só aumenta o suprimento de oxigênio, mas também induz o estresse oxidativo nas células. Este estresse oxidativo pode causar danos ao macromoléculas celulares e levar a instabilidade genômica aumentada [12]. Se as células tumorais sobrevivem após exposição a insultos hipoxia /reoxigenação, eles podem demonstrar aumentos na malignidade [13], o ADN sobre-amplificação [14], resistência a drogas [15], e o potencial metastático [16].

Cellular adaptação à hipóxia é bem documentada, mas pouco se sabe sobre os mecanismos adaptativos a reoxigenação. Portanto, usamos microarrays de expressão do genoma para investigar a dinâmica da criação de perfil transcricional durante a reoxigenação em células MCF-7 de cancro da mama. Nossos resultados microarray mostrou que N-MYC gene 1 regulada para baixo (

NDRG1

) tiveram a resposta máxima após reoxigenação. Portanto, nós nos concentramos em investigar o seu papel funcional na reoxigenação. Os ensaios funcionais revelaram que a migração de células de células de câncer de mama durante a reoxigenação foi impulsionado por down-regulação da

NDRG1

. Por último, foi proposto o modelo regulatório do

NDRG1

usando

in silico

análise para posterior investigação.

Resultados

Identificação de genes que respondem a reoxigenação

7 células MCF-cancro da mama humano foram incubadas em condições de hipoxia (0,5% S

concentração 2) durante 24 h e, em seguida, deslocado para a normoxia. As células foram colhidas, respectivamente, a 0 (controlo hipoxia), 1, 4, 8, 12 e 24 h após a reoxigenação. Cada série temporal foi realizada de modo independente, em triplicado. Depois de extrair RNA total, Illumina Humanos-6 v3 BeadChips foram utilizados para examinar a dinâmica do perfil transcricional após reoxigenação. sinais ajustados ao fundo foram normalizadas por um algoritmo de normalização quantil. De forma a identificar genes expressos diferencialmente, o teste t de Student foi utilizado para examinar os niveis de expressão a cada ponto de tempo após reoxigenação versus aquela de tempo zero. Os genes responsivos a reoxigenação foram seleccionados por genes que escolhem cuja média

P

-valor num dado ponto de tempo foi de 10

-4. No total, foram identificados 127 genes cujos níveis de transcrição se desviaram significativamente desde o tempo zero. Entre eles, 53,1% eram sobre-regulada e 46,9% foram regulados negativamente sobre a reoxigenação. A maioria destes genes (n = 112) foram identificados em apenas um ponto de tempo, mas 13 foram identificados em dois pontos de tempo, e dois genes foram identificados em mais de dois pontos de tempo.

Em seguida, a análise de componentes principais ( APC) foi aplicada para analisar a reprodutibilidade entre os diferentes repetições e os tempos em que os genes específicos foram activadas. Como se mostra na Figura 1a, replica do mesmo ponto de tempo agregados em conjunto, indicando elevada reprodutibilidade dos nossos dados. Além disso, diferentes pontos de tempo distribuídos sequencialmente de acordo com a quantidade de tempo sob reoxigenação. Os pontos de tempo de 8 h, 12 h e 24 h foram agrupados, indicando padrões de expressão gênica semelhantes em momentos posteriores.

(a) Análise de Componentes Principais (PCA) de O

2-responsive genes em células MCF-7 durante 24 h de reoxigenação após hipóxia. Os eixos são os dois primeiros componentes principais (PC), o que pode explicar a maior parte do perfil de expressão génica. Três experiências independentes foram realizados em cada ponto de tempo. As formas diferentes representam diferentes repetições; diferentes cores representam diferentes pontos de tempo. (B) Número de O

2 genes que respondem em cada ponto de tempo durante a reoxigenação. Tanto a sobre-regulada e genes regulada para baixo são traçadas como uma função de tempo. As barras pretas indicam o número de genes que foram identificados pela primeira vez, enquanto que as barras cinzentas indicam o número de genes que foram identificadas em pontos de tempo anteriores. (C) Os perfis de expressão relativa do O

genes 2-responsivos depois mudando para reoxigenação. Os valores de cada ponto de tempo foram normalizados para a expressão de que o tempo zero. A barra de escala à esquerda indica 20 genes, e a barra de cores na parte inferior indica o grau de mudança de expressão do gene em relação ao tempo zero. (D) a validação quantitativa RT-PCR dos dez melhores O

genes 2-responsivos em seus respectivos tempos de resposta máxima.

respostas dinâmicas de perfil de expressão gênica em cima reoxigenação

para caracterizar quantitativamente os o

genes 2-responsivos em cada ponto de tempo durante a aclimatização de reoxigenação, análise estatística (Student

t

-teste) de cada ponto de tempo em relação ao tempo 0 foi aplicado para cada gene. O número de genes que foram significativamente diferentes (

P

0,0001) a partir do controlo de hipoxia foram representados graficamente na Figura 1b. Os números de O

2-genes, incluindo genes que respondem tanto cima e para baixo-regulado, foram de 0 a 1 h, 17 h, a 4, 44, 8 h, 49 h a 12, e 35 a 24 h. Às 8 h, apenas 7% de genes (3/44) tinha sido identificada em 4 horas, enquanto que, 22% de genes (11/49) a 12 h tinha sido identificada em 4 ou 8 horas. Assim, este resultado mostrou que as respostas de transcrição foram ativados entre 8 e 12 horas após a reoxigenação, em seguida, diminuiu em 24 h após a reoxigenação.

A fim de compreender os perfis destes O

genes 2-responsivos expressão , os seus valores de expressão em cada ponto de tempo foram normalizados para a do tempo 0 (Figura 1C). O heatmap mostrou que, em geral, a intensidade dos genes para cima ou para baixo-regulado aumentou à medida que as células ficado mais tempo sob reoxigenação. Em seguida, foram selecionados os 10 genes com as maiores mudanças de expressão após a reoxigenação para validar os resultados de microarranjos utilizando RT-PCR quantitativo. Tal como mostrado na Figura 1D, os valores de expressão destes genes, excepto uma, nos pontos de tempo com resposta máxima eram bastante consistentes com os resultados de microarray.

análise de caminho de genes responsivos a reoxigenação

a fim de compreender que as vias estavam envolvidos na adaptação a reoxigenação, análise de caminho foi realizada utilizando o banco de dados Interação NCI-Nature pathway [17]. Entre os 127 genes identificados, a análise via revelou que, como esperado, a mais significativa (

P

0,01) foi enriquecida via a rede de factor de transcrição HIF-1-alfa, e o segundo caminho mais significativa foi validado objectivos de activação da transcrição de C-MYC (Tabela 1). Além disso, para investigar o qual foi activado via em cada ponto de tempo, via análises foram feitas separadamente, utilizando O

2 genes responsivos identificados em cada ponto de tempo. Os resultados mostraram que os genes activados em 8 h foram envolvidos em alvos validados de activação da transcrição de C-MYC (Tabela 1). Genes ativados em 12 h foram principalmente envolvidos na rede de fator de transcrição HIF-1-alfa, via de sinalização de ceramida, e co-regulação da actividade do receptor de andrógeno.

Down-regulação da NDRG1 promove a migração de células sob reoxigenação

Desde

NDRG1

, que é regulada pela via de sinalização MYC, teve a maior mudança na expressão seguinte reoxigenação, e que estes genes reoxigenação foram enriquecidos em alvos validados de activação da transcrição C-MYC, nós queria investigar ainda mais a resposta de

NDRG1

a reoxigenação. Não ficou claro se

NDRG1

poderia afetar a capacidade metastática de células tumorais. Portanto, Transwell ensaios foram realizados para examinar a capacidade de migração de células MCF-7 em S diferente

2 concentrações. Como mostrado na Figura 2, os níveis de transcritos de

NDRG1

foram significativamente diminuída mediante reoxigenação (Figura 2a), ao passo que a capacidade de migração de células MCF-7 aumentou significativamente (Figura 2b). Um Western blot confirmou que o C-MYC e N-MYC aumentada, e NDRG1 diminuiu, sob condições reoxigenação (Figura 2c). Estes resultados indicam que

NDRG1

pode afetar a migração de células transformadas, através da via de sinalização MYC.

(a) níveis de

expressão relativa NDRG1

sob S diferente

2 condições. Os níveis de ARNm de

NDRG1 medido por RT-PCR foram primeiro normalizados por 18s rRNA, e, em seguida, em comparação com aqueles em normoxia (*

P

0,01). (B) a capacidade de migração relativa do MCF-7 sob diferentes O

2 condições. Um ensaio Transwell foi usada para medir a migração de células MCF-7. capacidade de migração foi expressa como mudanças vezes relativamente ao normóxia. (C) As transferências de Western de HIF1α, C-MYC, N-MYC e NDRG1 em hipóxia e reoxigenação. GAPDH foi o controle de carregamento.

Em seguida, uma vez que

NDRG1

foi regulada para baixo em cima de reoxigenação, que overexpressed

NDRG1

em células MCF-7 para investigar a sua fisiológica função. Para confirmar a sobre-expressão, os níveis de mRNA e proteína de NDRG1 foram examinadas por RT-PCR quantitativo (figura 3a) e Western blot (Figura 3b). A transcrição da proteína e níveis de NDRG1 em células NDGR1-transfectadas foram significativamente mais elevados do que aqueles em células transfectadas com o vector vazio de controlo. MCF-7 transfectadas com o

NDRG1

ou vector vazio foram então inoculados em transwells para uma segunda rodada de ensaios de migração celular sob reoxigenação. Os resultados mostraram que a superexpressão de NDRG1 significativamente (

P

0,001). Inibiu a migração de células sob reoxigenação (Figura 3c)

(a) Análise RT-PCR quantitativa de

NDRG1

sobreexpressão em células MCF-7. Os níveis de mRNA de

NDRG1

foram normalizados por 18s rRNA. EV: vector vazio. (B) Western blot de NDRG1 overexpressed. A proteína de lisados ​​de células inteiras foi colocados a hibridar com anticorpo específico para o NDRG1, e p-actina foi o controlo de carga. (C) capacidade de migração relativa de células MCF-7 que sobre-expressa após NDRG1. capacidade de migração foi expressa como dobra muda em relação ao MCF-7 sob reoxigenação.

Previsão de fatores de transcrição associado-myc e microRNAs relacionados com hipóxia na regulação da

NDRG1

a fim de compreender os mecanismos de regulação

NDRG1

expressão, usamos ferramentas de bioinformática e uma revisão da literatura para prever os motivos de ligação de fatores de transcrição associado-myc no promotor de

NDRG1

ea vinculação locais de microRNAs relacionados com hipóxia (miRNAs) na 3’UTR. Usando MatInspector e critérios enunciados nos Materiais e Métodos, 170 motivos de ligação de fatores de transcrição foram identificados no promotor de

NDRG1

. Entre estes factores de transcrição, factores de transcrição foram seleccionados associada-Myc que foram relatados anteriormente. Estes fatores de transcrição incluiu ativador E2F-MYC, dedos de zinco MYC associados, e os fatores de ligação E-box. Sua ligação motivo, localização e logótipo sequência estão listadas na Tabela S1. Estes resultados indiciados

NDRG1

pode ser regulada por estes fatores de transcrição, embora mais experimentos são necessários.

Por fim, os níveis de miRNAs de expressão são conhecidos por mudar sob hipóxia. Para investigar a possibilidade de

NDRG1

estar sujeitos à regulamentação miRNA sob diferentes O

2 condições, locais de ligação dos miRNAs relacionadas com a hipóxia foram pesquisados ​​na 3’UTR de

NDRG1

. Os critérios de pesquisa permitiu uma incompatibilidade, balanço, exclusão ou lacuna entre o segundo eo sétimo nucleotídeos dos miRNAs. Como mostrado na Tabela S2, seis locais de ligação para as regiões de sementes de quatro relacionados com hipoxia miARNs-miR-25, miR-93, o miR-106a, e miR-210-foram identificados na UTR 3 ‘de

NDRG1

, sugerindo que

NDRG1

poderia ser regulada por estes quatro miRNAs. Esse resultado pode ser usada para projetar experimentos que investigam a regulação pós-transcricional de

NDRG1

por miRNAs.

Discussão

Vários estudos relataram que as células tumorais exibem aumento da resistência aos medicamentos e potencial metastático após a exposição a insultos hipóxia /reoxigenação [13], [15]. Embora adaptações celulares à hipóxia estão bem documentados, pouco se sabe sobre os mecanismos adaptativos a reoxigenação. Aqui, nós examinamos a dinâmica da expressão do gene do genoma durante a reoxigenação, e descobriram que os genes diferencialmente expressos foram envolvidos na rede fator de transcrição HIF-1-alfa e activação da transcrição C-MYC.

Neste estudo , análise de componentes principais dos genes de oxigênio e responsivos mostraram alta reprodutibilidade ao longo do tempo. Com base no número de O

2 genes que respondem a diferentes pontos de tempo, o período activo de transcrição em resposta a reoxigenação parece estar compreendida entre 8 e 12 horas. Além disso, a análise via revelou que o O

2 genes responsivos às 12 horas estavam envolvidos na rede de factor de transcrição HIF-1-alfa, a via de sinalização de ceramida, e co-regulação da actividade do receptor de androgénio. Não é de surpreender que a rede de factor de transcrição HIF-1-alfa estava envolvido na reoxigenação, porque tem sido relatada numa situação semelhante, isto é, a irradiação. Seguindo radioterapia, reoxigenação do tumor conduz a acumulação nuclear do HIF-1 em resposta a espécies de oxigénio reactivas [18]. Um dos genes, ou seja,

NDRG1

, na rede fator de transcrição HIF-1-alfa chamar a nossa atenção porque tinha a maior mudança na expressão a seguir reoxigenação.

NDRG1

é expressa ubiquamente em tecidos estimulados sob uma grande variedade de tensões e condições de crescimento-regulação de células, tais como a hipoxia [19], [20], danos no ADN [21], a diferenciação celular [22], [23], [24], a proliferação e crescimento de detenção [23]. Tem sido relatado que o

NDRG1

é fortemente regulado para cima em condições de hipóxia. Um oncogénica e papel de

indutor de tumores NDRG1

também tem sido relatado, porque foi sobre-expressa em vários cancros humanos, incluindo o pulmão, cérebro, pele, rim, e cancros da mama [25], [26]. No entanto,

NDRG1

funcionava como um supressor de metástase em cancros do cólon e da próstata [24], [27]. Os papéis contraditórios de

NDRG1

no câncer permaneceu de ser clarificados, embora possam ser explicadas por suas múltiplas localizações celulares e regulação complexa por diversos fatores fisiológicos e patológicos. Recentemente, Toffoli et ai. indicou que

NDRG1

pode ser induzida sob hipóxia intermitente para promover a migração de células [28]. Vários estudos também sugerem que

NDRG1

é induzido por hipoxia e associado com metástase, mas o mecanismo de regulação da

NDRG1

permanece indefinida e sua função sob reoxigenação ainda é incerto.

NDRG1

teve a resposta transcricional máxima de reoxigenação, neste estudo, que foi sentida justifica uma investigação mais aprofundada. Observou-se que a expressão de

NDRG1

teve uma relação inversa com a migração celular em cima reoxigenação. Estes resultados implicam NDRG1 como um supressor de metástase, consistente com as descobertas de Maruyama et ai. [8]. A discrepância entre os nossos resultados e os de Toffoli et al. [28] pode ser devido a diferentes tipos de células e configurações experimentais.

A fim de compreender melhor os possíveis mecanismos de regulação da

NDRG1

sob reoxigenação,

in silico

a análise da sequência foi realizada para prever motivos de factores de transcrição de ligação a DNA no promotor de

NDRG1

. Entre os motivos de ligação associado-Myc identificados, proteínas dedo de zinco, E2F-MYC ativadores /reguladores do ciclo celular e fatores podem afetar a expressão genética [29] vinculativo e-caixa, [30], [31], [32]. Estes factores de transcrição candidato pode ser adicionalmente validado pela construção de vários promotores que utilizam ensaios de luciferase. Além disso, os níveis de vários miARNs expressão têm sido mostrados para mudar em hipoxia [33], [34], [35]. Em particular, o miR-210 é induzida durante a hipóxia através de um mecanismo dependente de HIF1, e a expressão de miR-210 teve uma forte correlação com a expressão de

NDRG1

[34]. Portanto, a hipótese de que a expressão de

NDRG1

também foi regulamentada pelo miRNAs. Com efeito, os locais de ligação das regiões de sementes de quatro miARNs relacionados com hipoxia (miR-106a, miR-93, o miR-25, e miR-210) foram identificadas na 3 ‘UTR de

NDRG1

. Por isso, propusemos um modelo de trabalho com base na previsão de bioinformática e pesquisa bibliográfica (Figura 4). Este modelo fornece uma estrutura para futuros experimentos biológicos

TSS:. Sítio do início da transcrição. caixa branca: fator de transcrição site em + fio de ligação; caixa preta: fator de transcrição site em ligação – vertente; caixa cinza: sítio de ligação miRNA

Materiais e Métodos

celular cultura

linha de células de cancro da mama humano MCF-7 foi obtido a partir Coleção Bioresource e Centro de Pesquisa (. Hsiuchu, Taiwan). As células MCF-7 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) contendo 1,5 g /L de bicarbonato de sódio, suplementado com 10% (v /v) de soro fetal bovino (Hyclone, Gibco) e com 1% solução de antibiótico (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Para as culturas de hipoxia, as células foram incubadas em uma câmara de hipóxia (INVIVO

2-200, Ruskinn Tecnologia, Leeds, Reino Unido) durante 24 horas com uma mistura gasosa contendo 5% de CO

2, 95% N

2 a 37 ° C. A concentração de oxigénio na câmara de hipoxia foi mantida a 0,5%. Após 24 h de crescimento hipóxica, as células foram incubadas numa incubadora humidificada bem com 5% de CO

2 e 95% de ar ambiente a 37 ° C. Seis amostras foram recolhidas, respectivamente, 0, 1, 4, 8, 12 e 24 h após a reoxigenação. As células foram lavadas com PBS frio, em N líquido

2, e armazenado a -80 ° C para o isolamento de ARN depois congelado-flash. Cada experiência foi efectuada em triplicado.

ARN extracção

O ARN total foi extraído com Reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e foi purificado por meio de kit de limpeza de Micro RNeasy (Qiagen, Valencia, CA ) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de RNA e qualidade foram determinados utilizando um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) e um Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), que calcula um número de integridade do RNA (NIR). O ARN total (500 ng) com A

260 /A

280 = 1,7-2,1 e Rin . 7.0 foram usadas para sintetizar a primeira cadeia de ADNc através de transcrição reversa

Ilumina humano expressão de todo o genoma beadchips

o ARN total foi preparado com a T7 oligo (dT) e amplificada por amplificação de ARN Ilumina TotalPre kit (Ambion Inc., Austin, TX) para sintetizar o ADNc contendo uma sequência promotora de T7. Após a síntese da primeira cadeia de ADNc, a segunda cadeia de cDNA foi sintetizado através da conversão do ADNc de cadeia simples em um molde de ADN de cadeia dupla (dsDNA) para a transcrição. A polimerase de ADN de reacção empregue e ARNase H para degradar o ARN em simultâneo e sintetizar ADNc de segunda cadeia. O ADNc de cadeia dupla foi então submetido a um processo de limpeza para remover o excesso de ARN, iniciadores, enzimas, e os seus sais que possam inibir a transcrição in vitro. A partir daí, a transcrição in vitro foi realizada utilizando o ADNc de cadeia dupla como um molde e de ARN-polimerase de T7 para sintetizar múltiplas cópias de cRNA biotinilado. Após a amplificação, o ARNc foi misturado com um volume igual de tampão de hibridação e hibridado com Ilumina Humano-6 v3 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) a 58 ° C durante 16 h. Após a hibridação, o BeadChip foi lavadas e coradas com estreptavidina-Cy3 corante. A intensidade de fluorescência do grânulo foi detectado pelo Ilumina BeadArray leitor, e os resultados foram analisados ​​utilizando o software v3.1 BeadStudio. Todos os dados são Miame compatível e que os dados brutos foi depositado em um banco de dados compatível Miame. dados de microarranjos deste estudo foram submetidos ao GEO (Gene Expression Omnibus) de banco de dados (número de acesso GSE30019).

A mineração de dados e análise estatística

Após a digitalização, os dados de intensidade de Illumina Humano- 6 V3 BeadChips foram analisadas pelo software comercial Partek® (Partek, St. Charles, MO) para análise da expressão do ARNm. sinais ajustados ao fundo foram normalizadas por um algoritmo de normalização quantil, que normalizou as intensidades de sonda com base na distribuição da intensidade entre todas as lâminas. Após a normalização, Análise de Componentes Principais (PCA), que reduz de dados de alta dimensão em um gráfico 2D, foi utilizada para avaliar a semelhança entre os perfis de expressão gênica. De forma a identificar genes expressos diferencialmente, t-testes que examinam os níveis de cada ponto de tempo após a reoxigenação de expressão versus aquela de tempo zero foram utilizados. Genes cuja

P

-valor de três réplicas em um ou mais pontos de tempo foi 10

-4 foram identificadas e definidas como O genes

2-responsivos. O programa Genesis [36] foi utilizada para gerar uma representação visual dos perfis de expressão. Além disso, NCI-Nature Pathway interação com o banco [17] foi aplicado para identificar as funções biológicas dos genes diferencialmente expressos.

superexpressão do

NDRG1

em MCF-7

A humana

gene NDRG1

foi inserido entre o

EcoR I

e

BamH I

sites dos pcDNA3.1 vector de expressão eucariótico + (Invitrogen, Carlsbad, CA). MCF-7 /NDRG1 células foram criadas por transfecção de células MCF-7 com pCDNA3.1 + codifica o

NDRG1

gene utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). células /NDRG1 MCF-7 foram então selecionados por 200 ug /mL de Zeocine durante duas semanas. A expressão de ARNm de

NDRG1

quantitativa foi examinada por PCR em tempo real, e a expressão da proteína NDRG1 foi analisada por Western blotting.

quantitativa de transcrição reversa-PCR

O ARN total foi extraídos utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A transcrição reversa do RNA total foi realizada com um kit de ADNc de alta capacidade de RT (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando iniciadores aleatórios e 1 ug ARN total como molde. A mistura de reacção foi incubada a 25 ° C durante 10 min, 37 ° C durante 2 h e 85 ° C durante 5 seg. PCR em tempo real foi detectada por SYBR Green (Sigma) e foi realizada utilizando o ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). As reacções foram realizadas utilizando o seguinte programa: 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 s e 1 min de recozimento e alongamento a 60 ° C. Para cada amostra de cDNA, um controlo interno, do rRNA 18S, também foi medida pela sonda de SYBR Green para assegurar quantidades comparáveis ​​de cDNA em todos os poços. A expressão relativa de NDRG1 comparação com rRNA 18S em cada amostra foi calculada (△ TC) e a expressão relativa da NDRG1 entre amostras foi determinada através do cálculo da diferença na △ Ct entre amostras (△△ Ct). Todas as medições foram feitas em triplicado (5 ng de ARN total por poço).

blotting

Os extractos celulares totais de Western foram preparadas utilizando tampão de lise RIPA suplementado com 1% de Nonidet P-40 (NP- 40) e Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche, Mannheim, Alemanha). Os detritos celulares foram recolhidos por centrifugação a 8000 x g a 4 ° C durante 20 minutos. A concentração de proteína foi medida pelo método do ácido bicinconínico (ensaio BCA), e 20-50 | ig de proteína foram carregadas num gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio a 10% desnaturante. Após a electroforese, a proteína foi transferida electroforeticamente para membranas PVDF durante a noite a 55 mA. As membranas foram bloqueadas com Tris-Soro Fisiológico Tamponado com Tween-20 (TBST) com 5% de leite em pó não gordo, à temperatura ambiente durante uma hora. A detecção de proteínas específicas foi feito através de sondagem das membranas com anticorpos primários em TBS com 0,1% de Tween-20 durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Estes anticorpos incluídos NDRG1 (Abcam, 1:500), HIF1α (Millipore, 1:1000), C-MYC (Millipore, 1:1000), N-MYC (Millipore, 1:250), e GAPDH controlo de carga (GeneTex, 1:10000) ou β-actina (1:5000). Após incubação com os anticorpos de peroxidase de rábano conjugada com IgG secundários (1:5000), a imunorreactividade foi visualizada por quimioluminescência aumentada com luminol Reagente (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EUA).

ensaio de migração celular

Os ensaios de migração foram realizados com 24 poços transpo� câmaras de migração (Corning, Corning, Nova York, EUA) com 8 membranas de polietileno tamanho de poro. As células foram primeiro faminto 24 h e foram colhidas por Accutase (PAA Laboratories, Linz, Áustria). As câmaras superiores foram inoculadas com 5 x 10

4 células /ml de solução de células DMEM isento de soro bem em 0,1, e as câmaras inferiores foram cheias com 0,6 ml de DMEM contendo 10% de FBS como quimioatractor. As células foram deixadas migrar durante 24 h a 37 ° C. Para medição das células que migraram, 2 ug /ml de Calcein-AM (Trevigen, Gaithersburg, MD, EUA) /dissociação celular Solução (Trevigen) foi adicionado para dentro da câmara inferior. Após incubação a 37 ° C durante 60 min, as inserções foram removidas e as placas foram lidas a 485 nm para excitação e 520 nm para emissão. Os números de células foram calculados comparando a absorvância com a curva padrão. Células MCF-7 transfectadas com vector vazio foram utilizados como controle para cada experimento.

In silico

análise do

NDRG1

Para identificar o potencial de ligação motivos de factores de transcrição associada-myc no promotor de

NDRG1

, o programa MatInspector foi utilizado [37]. Dois grupos predefinidos de factores de transcrição, incluindo elementos promotores núcleo geral e vertebrados, foram analisadas na biblioteca matriz versão 8.3, utilizando os seguintes parâmetros: (1) as famílias foram emparelhados de matriz em vez de sequências individuais; (2) O núcleo de similaridade foi, pelo menos, 0,75; (3) matrizes semelhantes foi otimizado. A região central foi definida como quatro nucleotídeos consecutivos com as pontuações mais altas de conservação [38]. O núcleo de matriz de similaridade e foram calculadas por comparação da sequência de consulta com as sequências de nucleótidos mais conservados na matriz. Após a identificação dos potenciais candidatos de fatores de transcrição, os fatores de transcrição associado-myc foram ainda selecionados com base em uma pesquisa de literatura.

Para identificar os locais de ligação de miRNAs relacionadas com a hipóxia, o

NDRG1 Sims 3 ‘ sequência de UTR foi baixado a partir do navegador do UCSC Genome (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway; GRCh37 montagem /hg19), e foi alinhado com miRNAs relacionadas com a hipóxia. Os critérios para pesquisar sítios de ligação da região de sementes foram permitindo uma incompatibilidade, balanço, exclusão ou lacuna entre o segundo eo sétimo nucleotídeos de miRNAs relacionadas com a hipóxia.

Informações de Apoio

Tabela S1.