Abstract

O fosfato de oseltamivir é um inibidor da sialidase anti-influenza amplamente utilizado. Sialilação, governada por sialiltransferases e sialidases, é fortemente implicada na oncogênese e progressão do câncer de mama. Neste estudo foi avaliado o comportamento biológico das células tumorais mamários caninos após tratamento com fosfato de oseltamivir (um inibidor da sialidase)

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. Nossos

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resultados mostraram que o fosfato de oseltamivir prejudica a atividade sialidase levando ao aumento da sialilação em células cancerosas mamários CMA07 e CMT-U27. Surpreendentemente, fosfato de oseltamivir estimulada, a CMT-U27 migração celular e capacidade de invasão

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, de uma forma dependente da dose. CMT-U27 tumores de xenoenxerto de ratinhos nus tratados com fosfato de oseltamivir mostraram aumento da sialilação, nomeadamente α2,6 estruturas terminais e LES (x) expressão. Notavelmente, a tendência para o aumento metástases pulmonares foi observada em ratinhos nus tratados com fosfato de oseltamivir. Tomados em conjunto, os nossos resultados revelaram que oseltamivir prejudica a atividade sialidase de células de câncer mamário canino, alterando o padrão sialilação de tumores mamários caninos, e levando, surpreendentemente, a

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aumento mamário a agressividade do tumor

Citation:. de Oliveira JT, Santos aL, Gomes C, Barros R, Ribeiro C, Mendes N, et al. (2015) Anti-Influenza Neuraminidase inibidor Fosfato de Oseltamivir Induz Canine Câncer Mamário Agressividade celular. PLoS ONE 10 (4): e0121590. doi: 10.1371 /journal.pone.0121590

Editor do Academic: David Wai Chan, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 12 de setembro de 2014; Aceito: 13 de fevereiro de 2015; Publicação: 07 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 de Oliveira et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e a sua arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela agência de Português “Fundação para a Ciência e Tecnologia, Programa Operacional Ciência e Inovação 2010 (POCI 2010) do Quadro Comunitário de Apoio III “e projeto de subsídio não. PTDC /CVT /117610/2010. RB (SFRH /BPD /68276/2010) e GC (SFRH /BPD /96510/2013) reconhecem a Fundação Português para a Ciência e Tecnologia. Instituto de Patologia e Imunologia Molecular é um Laboratório Associado do Ministério do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior Português e é parcialmente financiado pela Fundação Português de Ciência e Tecnologia

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

Cancro continua a ser um grande fardo económico e social no mundo ocidental. Na verdade, apesar de todos os esforços para reduzir tal aflição, o número de pacientes tem aumentado exponencialmente nos últimos anos. O câncer de mama, em particular, é o câncer mais comum em mulheres e a causa mais frequente de morte relacionada ao câncer, principalmente devido ao desenvolvimento de metástases distantes [1].

Os mecanismos envolvidos no estabelecimento de colónias de câncer em órgãos distantes está longe de ser compreendido, como são os verdadeiros motivos que levam à morte relacionada com metástase. Assim, identificar e investigar actualmente medicamentos utilizados clinicamente que possam ter um impacto sobre a progressão do tumor é obrigatória [2]. Por exemplo, por interferir com inúmeros caminhos celulares que são comuns ou semelhantes entre patógenos e anfitriões, drogas como a rapamicina e niclosamide (que inicialmente foram usadas como anti-fúngicos e anti-helmíntico drogas, respectivamente) têm acabou por ser agentes anticancerígenos promissores [3, 4] .

o fosfato de oseltamivir é um medicamento anti-gripe que se tornou amplamente utilizado como terapia profilática desde o tempo das pandemias de H1N1 [5]. É administrado como o fosfato de oseltamivir pró-fármaco, que é convertido por enzimas carboxil-esterase no carboxilato de oseltamivir activo. O fosfato de oseltamivir é um análogo de ácido siálico, que interage com e bloqueia os locais activos das enzimas de sialidase do vírus da gripe, liga-se aos enzimas de vírus, bloqueando a sua capacidade para clivar os resíduos de ácido siálico na superfície da célula infectada que resulta numa incapacidade para liberar virions de progênie [6].

Algumas sugestões foram feitas anteriormente sobre os efeitos farmacológicos potencialmente relevantes deste e de outros inibidores de sialidases virais usados ​​nas clínicas, em sialidases endógenos humanos [7]. Enquanto baixas concentrações nanomolares de carboxilato de oseltamivir são suficientes para bloquear a actividade de sialidases virais, esta droga demonstrou quase nenhuma inibição significativa da sialidases humanos [7, 8]. No entanto, os resultados conflitantes foram obtidos quando o fosfato de oseltamivir foi testada em células de câncer usando tanto

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modelos [9, 10]. Com efeito, algumas observações indicou um possível efeito inibidor de fosfato de oseltamivir em sialidases endógenos de ratos e ratinhos [11-14]. Mais recentemente, foi sugerido que o fosfato de oseltamivir tinha a capacidade de reverter a epitelial para mesenquimal processo de transição (EMT) e aumentar a sensibilidade droga de células cancerosas humanas quimiorresistentes [10].

Glicanos

sialiladas estão epidemiologicamente associado a um pior prognóstico em diferentes tipos de cancro, incluindo o cancro da mama [15]. Os ácidos siálicos são normalmente ácidos monossacarídeos encontrados na posição terminal da cadeia de hidrato de carbono presentes em glicoproteínas e glicolípidos [16]. Através de interacções complexas com selectinas e siglecs entre outras moléculas, ácidos siálicos estão fisiologicamente presentes em diferentes tipos de interacções célula-célula. Os ácidos siálicos aumentar a força de densidade de carga em toda a cadeia de glicano, devido à presença da sua porção de ácido carboxílico, associando-se a alterações nas propriedades de adesão dos glicanos [17]. Os ácidos siálicos são transferidas a partir de um substrato dador para uma estrutura de glicano presentes numa dada por glicoconjugado sialiltransferases [18, 19]. Por outro lado, a sua remoção a partir de cadeias de glicano é catalisada por sialidases. Acredita-se que a atividade dessas enzimas para afetar a conformação de glicoproteínas e, portanto, contribuir para qualquer aumento do reconhecimento ou mascaramento de sítios biologicamente relevantes em moléculas e células [20].

O aumento de grupo sanguíneo sialilada do tipo Lewis antigénios tais como sialil Lewis X (SLE (x)) e pequenas glicanos truncadas, tais como sialil Tn (STN) estão entre as alterações mais comuns de glicano em células cancerosas [21-24]. Vários ensaios funcionais nos quais sialiladas glicanos são mostrados a desempenhar um papel no aumento da migração e invasão ambos

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são encontrados na literatura [19, 24]. Por outro lado, adulteração de sialilação

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também foi mostrado t por vezes, reduzir a capacidade invasiva de células de câncer [25]. Como resultado, a modulação de glicanos sialilados foi preconizada como um alvo putativo para a terapia neo-adjuvante em cancro [26]. No entanto, devido à grande variedade e complexidade das sialiltransferases e todas as outras glicosiltransferases envolvidas no processo de sialilação, existem dificuldades com giro ácidos siálicos em alvos terapêuticos clinicamente relevantes [27, 28] bem reconhecida. No entanto, mesmo que não haja mais do que 20 sialiltransferases diferentes conhecidos, existem apenas quatro sialidases de mamífero identificados e caracterizados [20]. Curiosamente, todos os quatro sialidases de mamíferos conhecidas são homólogos aos de vírus que contêm, em alguns casos, resíduos idênticos aos encontrados no local enzimático activo [29].

Existe, portanto, uma necessidade premente para estudar neoplásicas em contextos que o fosfato de oseltamivir pode inibir competitivamente sialidases de mamíferos [30]. Diferentes resultados possam surgir e pode depender do alvo de inibição presente e a matriz de glicoconjugados afetadas [20]. Neste trabalho foram estudados os efeitos da inibição sialidase como um modulador de mecanismos relacionados com a sialilação de invasão em tumores de células mamárias utilizando tanto

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abordagens.

material e Métodos

linhas de células e condições de cultura

a fim de avaliar possíveis diferenças de tratamento com fosfato de oseltamivir em linhas de células benignas e malignas, duas linhas de células mamárias foram utilizados neste estudo: um linha de células derivadas de adenoma (CMA07 estabelecido no nosso laboratório a partir de um adenoma complexo canino ocorrem espontaneamente excisadas de uma cadela 6 anos de idade para fins curativos com os proprietários consentir [31]) e uma linha de células derivadas de carcinoma (CMT-U27 – linha de células de carcinoma canina altamente metastático, gentilmente cedidas pelo Professor Eva Héllmen, da Suécia [32]). As duas linhas de células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO a 5%

2 incubadora (Thermo Scientific) e mantidas em RPMI 1640 com Glutamax e Hepes 25 mM (Gibco Life Technologies), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gibco Life Technologies) e 1% de penicilina estreptomicina (P /S) (Gibco Life Technologies).

actividade de sialidase ensaio

Superior níveis de sialilação são esperados em células malignas, quando comparado com contrapartes benignas. Esta é a mesma probabilidade de ser dependente da actividade de ambos os sialyltranferases e em sialidase [17]. Para avaliar o efeito de fosfato de oseltamivir sobre a actividade de sialidases, um

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ensaio utilizando um ácido siálico modificado (4-metil-umbeliferil-Nacetylneuraminic ácido-4-muñana), foi realizada utilizando CMA07 e CMT- U27 células tumorais mamários caninos. actividade de sialidase foi determinada através da obtenção da conversão metabólica do análogo de ácido siálico, 4-muñana, no composto metil-umbeliferona fluorescente (cor azul), após tratamento com diferentes doses de fosfato de oseltamivir. As células foram cultivadas em 12 mm de vidro circular até confluência e depois incubadas durante 24 h com meio contendo concentrações de fosfato de oseltamivir diferentes (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM e 305 de fosfato uM oseltamivir dissolvida em PBS), e o veículo da droga (PBS ) foi utilizado como controlo. Após 24 horas de tratamento, cada um de vidro circular 12 mm foi colocada numa lâmina e incubaram-se em uma 2¼m 4-muñana (2 ‘- (4-metil) ácido -α-DN-acetilneuramínico) (Sigma, St. Louis, EUA) solução de . As lamelas foram imediatamente observadas por microscopia de epi-fluorescência sob a luz UV (comprimento de onda de excitação a 360 nm, e comprimento de onda de emissão a 440 nm), tal como foi previamente descrito [33]. As lâminas foram analisadas e as imagens foram tiradas com um microscópio de fluorescência Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy).

análise da morfologia celular

células CMA07 e CMT-U27 foram semeadas a uma densidade de 1×10

4 culas por po em placas de 6 poços, em triplicado. Três concentrações de fosfato de oseltamivir diferentes foram estudados: 0,305 uM, 3,05 uM e 30,5 uM, e PBS foi utilizado como controlo. Análise de confluência celular e morfologia foi realizada utilizando um microscópio invertido de contraste ao longo de um período de 7 dias. As fotografias foram tiradas nos dias 0 e 7 sob ampliação 200x

A proliferação celular ensaio

células CMA07 e CMT-U27 foram cultivadas em placas de 24 poços em triplicado para cada condição:. 0.305? M, 3,05 uM, 30,5 uM e 305 uM de fosfato de oseltamivir e PBS foi utilizado como controlo. As células foram contadas todos os dias durante 7 dias na câmara de Neubauer em uma diluição de 1: 2 de células em 0,4% contagem de azul de tripano de células e foi feito utilizando o factor de conversão de volume para 1 mm3, que é 1×10

4. Este ensaio foi repetido 3 vezes e curvas de crescimento foram traçadas.

crescimento celular ensaio

O crescimento celular foi determinado em linhas celulares CMA07 e CMT-U27, utilizando um kit disponível comercialmente CellTiter 96 Aqueous One Solution reagente (Promega Corporation), e realizada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços em triplicado (Laranja Scientific), a uma densidade de 5×10

3 células por poço. Após a fixação das células, fosfato de oseltamivir foi adicionado a 0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM e 305 uM e concentrações finais de PBS foi utilizado como controlo. O metabolismo celular foi medido através da adição de reagente MTS de tetrazólio e a absorvância foi registada a 490 nm. As medições foram realizadas a 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 e 48 horas. Uma medida adicional de controlo foi realizada no ponto de tempo de 0h, num poço de cultura sem células. As experiências foram realizadas duas vezes.

ensaio TUNEL

linhas celulares

CMA07 e CMT-U27 foram cultivadas em placas de 6 poços e, em seguida, tratado com diferentes concentrações de fosfato de oseltamivir (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM e 305 uM, e PBS foi utilizado como controlo). Após 24 horas de tratamento, o meio de cultura e as células foram tripsinized recolhido e centrifugado durante 10 minutos a 2000 rpm. As células foram lavadas em PBS e fixadas em metanol frio durante 20 minutos. Após a fixação, as células foram ressuspendidos em 1 ml de PBS por procedimento Cytospin. Resumidamente, a 100 ul de suspensão de células foram centrifugadas numa centrífuga usando cytospin3 polilisina revestida slides. As lâminas foram então utilizados para

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detecção de morte celular utilizando um kit comercialmente disponível (

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kit de detecção de morte celular, fluoresceína da Roche) com base no DNA rotulagem rupturas de filamentos duplos (tecnologia TUNEL) , de acordo com as instruções do fabricante. As lâminas foram observadas sob um microscópio de fluorescência usando um comprimento de onda de 488 nm de excitação e a percentagem de células mortas foi calculada pela gravação células TUNEL positivos em relação ao número total de células utilizando o software ImageJ. Este ensaio foi realizado duas vezes.

cicatrização de feridas

O ensaio de cicatrização da ferida foi realizada utilizando um benigna (CMA07) e altamente metastático (CMT-U27) linha celular de tumor mamário canino numa microscópio de lapso de tempo. Resumidamente, as células 20×10

4 foram plaqueadas numa placa de cultura de 24 cavidades e depois de atingir uma alta confluência “ferida” artificial foi feito com uma ponta de pipeta. O meio de cultura foi substituído com as diferentes concentrações de fosfato de oseltamivir: 0,305 uM, 3,05 uM e 30,5 uM de fosfato de oseltamivir e PBS como controlo. aquisição de imagem da ferida foi feito com intervalos de 5 minutos durante 48 horas, utilizando o programa Axio Visão lançamento 4.8.2. e convertido em vídeo. O tratamento das células com fosfato de oseltamivir 305 uM não foi realizada devido à sua citotoxicidade anteriormente mostrado. Este ensaio foi realizado duas vezes.

Matrigel Invasão Ensaio

foi realizado um ensaio de invasão de Matrigel para avaliar a capacidade invasiva de células CMT-U27, um bom modelo para estudar a invasão de células [34]. As inserções de Matrigel foram re-hidratada com meio RPMI 1640 durante 1 hora a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% incubadora de CO2 (Thermo Scientific). As condições de meios foram as mesmas na parte superior e os poços de fundo (RPMI 1640 meio suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina e streptimicin).

Após inserção reidratação, 1×10

5 células foram semeadas em câmaras de Matrigel-revestidas na presença de concentrações diferentes de fosfato de oseltamivir (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM de fosfato de oseltamivir) e PBS como controlo, e mantidas em cultura durante mais 6 horas (ponto de tempo previamente optimizado para ensaios de invasão, utilizando esta linha celular ). A droga foi usada nos poços superiores. Após a incubação, o conteúdo de cada inserção foi removida e lavada duas vezes com PBS para remover as células não-invasor. células invasivas foram fixadas com metanol frio durante 20 minutos, as inserções foram transferidas para lâminas (qualidade industrial) e montados com Vectashield forma com DAPI (Vector Laboratories) de montagem. células invasoras foram registadas através da contagem do número de células presentes na inserção. Estas experiências foram realizadas 3 vezes.

Fluorescent citoquímica

As células foram cultivadas em lamelas de vidro e o meio de cultura foi suplementado com 0,305 mM, 3,05 mM e 30,5 mM fosfato de oseltamivir e PBS como controle, para 24 horas. As células foram então lavadas com PBS e fixadas com metanol frio durante 20 minutos. Após a fixação, as células foram re-hidratados com PBS e bloqueadas com BSA a 10% durante 20 minutos. Planta lectinas SNA (Biotinylated sabugueiro lectina casca, B-1305, Vector Laboratories), MAL I (Biotinylated Maackia amurensis lectina I, B-1315, Vector Laboratories) e MAL II (Biotinylated Maackia amurensis lectina II, B-1265, Vector Laboratories ) foram diluídos 1: 300 em 5% de BSA em PBS e incubadas em lâminas durante 1 hora à temperatura ambiente. As lâminas foram então lavadas três vezes com PBS e incubaram-se 1 hora com estreptavidina-FITC. Após duas lavagens com PBS, as lâminas foram incubadas durante 10 minutos com DAPI (Sigma-Aldrich) em PBS e as lâminas foram colocadas em Vectashield médio (Vector Laboratories) para análise de fluorescência de montagem. As lâminas foram analisadas e as imagens foram tiradas em um microscópio de fluorescência Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy).

análise de Western Blot

Células de CMA07 e linhas celulares CMT-U27 foram cultivadas até à confluência em 6 bem -plaquetas e diferentes concentrações de fosfato de oseltamivir foram adicionados ao meio (0,305 uM, 3,05 uM e 30,5 uM de fosfato de oseltamivir). Após 24 horas de incubação, as células foram lavadas três vezes com PBS e lisaram-se utilizando tampão de lise RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 8; NaCl 150 mM; 1% de NP-40; 0,5% desoxicolate de sódio; 0,1% de SDS ) contendo mistura de inibidores de protease completo (Roche), 1 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo), e 1 mM de Na

3VO

4 (ortovanadato de sódio). A concentração de proteína foi determinada usando o método do ácido biocinchoninic de Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce /Thermo Scientific), de acordo com as instruções do fabricante.

Os extractos de proteína total foram resolvidos em 10% SDS-PAGE, transferido para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences /GE Healthcare Life Sciences) e incubadas com diferentes biotinylatedlectins: MAL I (B-1315, Vector Laboratories), MAL II (B-1265, Vector Laboratories) e SNA (B-1305, Vector Laboratories) diluído 1 : 500 em 5% de BSA (Sigma-Aldrich) em PBS com 0,05% de Tween-20 (Sigma-Aldrich, EUA). Após lavagem com PBS 0,05% de Tween-20, as membranas foram incubadas com (kit Vectastain ABC, Vector Laboratories Padrão) de biotina-avidina-peroxidase de kit de complexo durante 1 hora à temperatura ambiente. Para o SLE (x) e análise STN, as membranas foram incubadas com anticorpos monoclonais de ratinho, KM93 (Millipore), diluiu-se 1: 500 e TKH2 (gentilmente oferecido pelo Dr. H. Clausen de Dinamarca), seguido por incubação com um anticorpo anti-ratinho conjugado com HRP anticorpo secundário durante 1 hora. As análises foram realizadas por quimiluminescência utilizando o reagente de detecção ECL blotting ocidental e filmes (ambos da GE Healthcare). Western blot para a actina diluída 1: 4000 (Santa Cruz Biotechnology) foi utilizado como controlo de carga

electroforese em gel

2D

Diferenças em proteínas individuais são difíceis de visualizar utilizando análise standard de Western Blot.. Tentando superar isso, temos realizado uma análise de géis 2D que melhor discrimina glicoformas de proteínas em extratos de proteína. As amostras de proteína a partir de CMA07 e células CMT-U27 tratado com 3,05? M de células de controlo tratados com PBS oseltamivor e foram precipitados (ProteoExtract, Calbiochem) e ressuspensas em tampão de reidratação (ureia a 7 M, 2 M tioureia, 4% (v) CHAPS /v e 0,0002 % azul de bromofenol) com 0,2% de ampholyte e quantificados (2D Quant Kit da GE Healthcare). reidratação passiva das tiras foi realizada durante a noite com 200 ug de proteínas totais, utilizando tiras de IPG de pH 3-10 NL (ReadyStrip; x3 0,5 x70 mm, Bio-Rad, Hercules) à temperatura ambiente. Focagem isoeléctrica foi realizada na célula Protean IEF (Bio-Rad) com uma tensão inicial de 250 V durante 15 minutos, e, em seguida, através da aplicação de um gradiente de voltagem até 4000V com limitação de corrente de 50 mA por tira e a temperatura fixada em 20 ° C. A primeira dimensão foi concluído em 14-20 KVH.

Após a focagem isoeléctrica proteínas foram reduzidas e alquiladas por incubação com 2% de DL-ditiotreitol (DTT), seguido por 2,5% em iodoacetamida um tampão de equilíbrio (ureia 6M, 2% de SDS, 0,002% de azul de bromofenol, 75 mM de Tris pH 8,8, 29,3% de glicerol) durante 10 min cada, sob agitação suave. As tiras foram, em seguida, embalada em uma baixa de gelificação a 1% (1% de agarose em tampão de corrida-Tris 25 mM, glicina 192 mM e 0,1% (w /v) de SDS, pH 8,3; Bio-Rad) no topo de um 10% gel de acrilamida (acrilamida /bisacrilamida 37,5: 1, 2,6% de Bio-Rad). A segunda dimensão de electroforese foi realizada num sistema de células de tetra Mini-Protean (Bio-Rad), utilizando tampão 1xTris /glicina /SDS a voltagem constante de 125 V. A análise Western blot utilizando o SNA lectina foi realizada como descrito na secção anterior.

os estudos em animais

as experiências com animais foram realizados de acordo com as directrizes europeias para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório, a Directiva 2010/63 /UE eo Regulamento Nacional publicados em 2013 (Decreto-Lei n. ° 113/2013 de 7 de Agosto). N: ratinhos nus NIH (S) II-nu /nu, foram alojados, breeded e manteve-se a Animal House IPATIMUP, num ambiente isento de organismos patogénicos, sob condições controladas de luz e humidade. Os seguintes pontos de extremidade Humane foram estabelecidos: quaisquer sinais de angústia, sofrimento ou dor, o corpo de perda de peso superior a 20-25% da massa corporal, anorexia e estado moribundo, relacionado ou não ao procedimento experimental

Experimental. grupos de ratos e tratamento da toxicodependência

fêmea NIH (S) II-nu /nu ratinhos nus, com idades entre 4-6 semanas, foram ortotopicamente inoculados com 1 x 106 células de cancro da mama canino CMT-U27 viáveis ​​na almofada de gordura mamária usando uma agulha de calibre 25. Um total de 8 ratinhos foram inoculados. Quando nódulos atingiram um volume de aproximadamente 500mm3, os ratinhos (n = 8) foram seleccionados aleatoriamente e divididos em grupo de controlo (n = 4) e o grupo de tratamento (n = 4) .Os animais receberam por via intraperitoneal (IP) quer dailly 100 ul de PBS ( grupo de controlo) ou 100 mg /kg de fosfato de oseltamivir (Tamiflu Roche) adquirido a partir da farmácia, diluiu-se em PBS (grupo de tratamento) no momento da morte. O tamanho do tumor foi medida utilizando compassos de calibre, e o volume do tumor (mm3) foi estimada pela largura x comprimento x altura. Para observar metastização, tumores primários de todos os ratinhos foram removidos cirurgicamente quando um volume significativo de ~ 1000-1500mm3 foi atingido. Os ratinhos foram anestesiados por administração IP 100 ul de uma mistura contendo 50 mg /kg de cetamina (IMALGENE 1000) e 1 mg /kg de cloridrato de medetomidina (Medetor) e o tumor foi excisado. Utilizou-se 2,5 mg /kg de atipamezol (Revertor) por ratos para antagonizar o efeito da anestesia. Os ratinhos foram tratados com uma solução oral de 10 mg /kg de cloridrato de tramadol (Tramal) cada 8h por 24-48h para prevenir a dor. Os animais foram acompanhados após a excisão cirúrgica dos tumores primários de invasão e /ou sinais de metastização.

Todos os ratos foram sacrificados de acordo com os pontos de extremidade sem crueldade, e necropsiados. Os tecidos foram fixados em formalina a 10% tamponada, processadas e embebidas em parafina. Três secções micrométricas foram cortadas e coradas com hematoxilina eosina (HE) para posterior análise histopatológica e imuno-histoquímica. avaliação histopatológica dos tumores primários e metástases respectivas, bem como a avaliação da inflamação (contando o número de infiltrado inflamatório presente em todo o xenotransplante) foi realizada de forma independente por dois patologistas.

histoquímica com lectinas e de imunohistoquímica

a expressão de estruturas sialilados em xenoenxertos de CMT-U27 de ratinhos tratados com o oseltamivir e controlos foram realizados utilizando lectinas SNA planta, MAL I e II MAL.

As lâminas foram desparafinadas e reidratadas seguido por recuperação de antigénio com ebulição 0,005% Extran durante 8 minutos. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 10% de H2O2 em solução de metanol, durante 10 minutos, e as lâminas foram bloqueadas com BSA a 10% em PBS (pH 7,4) durante 30 minutos.

Em seguida, as secções de tumor foram incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente com o SNA biotinilado, MAL I e II MAL (Vector Laboratories.), diluído a 1: 250, 1: 250 e 1: 150, respectivamente, em 5% de BSA em PBS. As lâminas foram em seguida lavadas em PBS, incubadas com o-avidina-biotina peroxidase complex (ABC) durante 30 minutos e reveladas com substrato de diaminobenzidina tetrahydroxychloride, DAB (Sigma FAST). Para imuno-histoquímica, as secções foram incubadas durante a noite à temperatura ambiente com os anticorpos primários de anticorpo monoclonal anti-Ki67 (clone MIB1, Dako), anti-caspase-3 (clone 5A1E, sinalização celular), e anti-Sle (x) (KM93, Millipore ) a 1:50, 1: 100 e 1: 200, respectivamente, em 5% de BSA em PBS. As lâminas foram em seguida lavadas em PBS, incubadas com Novolink Max sistema de polímero de detecção (1250 testículos), Novocastra, (Newcastle, UK) durante 30 minutos à temperatura ambiente e aplicando desenvolvido DAB do mesmo kit para 5 minutos

.

as lâminas foram então contrastadas com hematoxilina, desidratadas, e montado com Histomount (National Diagnostics). Os controlos negativos, sem lectinas ou anticorpos, foram incluídos. Todos os cortes corados foram examinados com microscopia de luz e revisto por três observadores (de Oliveira J .; Ribeiro, C .; e Gartner, F.).

A análise estatística

Sempre que necessário, os resultados são apresentados como média ± desvio padrão. A análise estatística foi realizada utilizando One Way ANOVA (análise de variância) de teste. Para MTS, a proliferação celular, e ensaios de crescimento celular foram usadas comparações múltiplas de Dunnett método. teste t de Student foi realizado para avaliar a cicatrização de feridas os resultados do ensaio. As comparações múltiplas pelo teste de Tukey foi utilizado para estudar ensaio de invasão de matrigel celular e comparações múltiplas de Bonferroni foi utilizado para análise TUNEL. GraphPad Prism 5.02 versão foi usado para executar essas análises estatísticas.

imagens imunohistoquímica de Ki-67 e caspase 3-expressão foram analisados ​​usando as ferramentas de análise on-line ImmunoRatio, sob a ampliação de alta potência em cada área [35] . casos de tumor foram divididos em 3 categorias de acordo com a pontuação Ki67: células menos de 10% Ki67 positivas (Baixo), de 10 a 50% de células Ki67-positivas (moderada) e as células mais de 50% Ki67-positivas (alto). Para avaliar a caspase 3 e LES

x expressão, os tumores foram agrupados de acordo com a porcentagem de células imunorreativas ao longo de toda a lesão, em 3 classes: 0% (negativo); menos do que 5% (células raras) ou 6-10% (baixa). No que diz respeito SNA e MAA expressão que, uma análise semi-quantitativa, em que as amostras foram pontuadas de acordo com a percentagem de células positivas. Os tumores foram agrupados em: menos de 25% (de baixo); 25 a 50% (moderada) e mais do que 50% (alto). Então hipóteses de associação foram testados, por meio do teste do qui-quadrado para variáveis ​​discretas. software SPSS (versão 22.0) foi usado para análise estatística.

Resultados

Influência da absorção de fosfato de oseltamivir por células CMA07 e CMT-U27 sobre a atividade sialidase endógena

in vitro

Oseltamivir tratamento com fosfato de actividade de sialidase auditivos (hidrólise de ácido neuramínico), como mostrado por uma diminuição da fluorescência metil-umbeliferona em ambas as linhas celulares (Fig 1). Além disso, um decréscimo de actividade de sialidase foi cada vez mais evidente em concentrações mais elevadas de fosfato de oseltamivir.

células CMA07 e CMT-U27 foram tratadas durante 24 horas com diferentes concentrações de fosfato de oseltamivir (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM e 305? M) ou PBS como controlo, e incubou-se com uma solução a 2 uM 4-muñana. As lamelas foram imediatamente observadas sob um microscópio epi fluorescente com luz UV. Ambas as linhas de células mostraram diminuição da actividade de sialidase, como avaliado pela metil-umbeliferona fluorescente, que resulta da conversão metabólica da 4-muñana.

Efeito do tratamento com fosfato de oseltamivir em CMA07 e células CMT-U27 morfologia, viabilidade e morte celular programada

Para avaliar o efeito de diferentes doses de fosfato de oseltamivir na morfologia celular, viabilidade e morte celular programada, o

in vitro

ensaios abaixo foram realizados.

alterações ligeiras na morfologia celular foi observada em células tratadas com CMA07 fosfato de oseltamivir. Sem grandes alterações na morfologia celular CMT-U27 foram observados (S1 Fig).

A análise estatística não mostrou diferenças significativas na taxa de crescimento de ambos CMA07 (

p

= 0,6209) e CMT-U27 (

p

= 0,9929) linhas de células, após o tratamento com o fosfato de oseltamivir (Fig 2A). Para melhor avaliar o efeito do tratamento sobre o oseltamivir CMA07 e a viabilidade das células CMT-U27, o ensaio colorimétrico MTS, que determina a actividade metabólica celular, foi realizada, durante 48 horas. A atividade metabólica do CMA07 e linhas celulares CMT-U27 foi significativamente reduzida com 305 tratamento com fosfato de oseltamivir? M (

p

= 0,005 e p 0,0001 respectivamente) usando um testículos Way ANOVA (análise de variância). Em contraste, não houve alterações significativas foram observadas com 0,305? M (p = 0,9781), 3,05 m (

p

= 0,7436) e 30,5 m (

p

= 0,9623) de tratamentos de fosfato de oseltamivir quando em comparação com células de controlo (Fig 2B). Finalmente, para avaliar o efeito de fosfato de oseltamivir em CMA07 e CMT-U27 morte celular programada, e dado que a actividade metabólica de células deficientes 305 uM de fosfato de oseltamivir tratamento, uma medida da morte celular programada foi realizada com o ensaio TUNEL. Vinte e quatro horas de tratamento de fosfato de oseltamivir, especificamente a 305 uM, aumentou significativamente CMA07 (

P

= 0,0010) e CMT-U27 (

p = 0,0002

) a fragmentação do ADN, sugerindo a promoção de celular programada morte, quando comparadas com as concentrações mais baixas de oseltamivir, ou com PBS (Figura 2C superior e painéis inferiores).

de crescimento celular avaliada com azul de tripano (a) ou com o ensaio de MTS (B) e morte celular programada (C ) foram avaliadas em células CMA07 e CMT-U27 após o tratamento com fosfato de oseltamivir (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM e 305 uM) ou PBS como controlo. (A) células foram cultivadas na presença de diferentes concentrações de fosfato de oseltamivir, e o crescimento celular foi monitorizado durante 7 dias através da contagem do número de células viáveis ​​ao dia. Não houve diferenças significativas nas taxas de crescimento de células tratadas foram verificadas quando em comparação com células não tratadas, excepto para um crescimento diminuída em células CMA após 4 dias de tratamento 305 uM de fosfato de oseltamivir. (B) As células foram cultivadas na presença de diferentes concentrações de fosfato de oseltamivir, e a actividade metabólica das células foi também monitorizada utilizando um ensaio de MTS, de um modo claro que o tempo de 48 horas. células CMA07 e CMT-U27 tratados com 305 mM de fosfato de oseltamivir mostraram uma diminuição significativa na sua actividade metabólica (***

p Art 0,001), mas nenhuma mudança foi verificada com as concentrações mais baixas. (C) CMA07 e CMT-U27 foram tratadas com diferentes concentrações de oseltamivir durante 24 h. As células tratadas com 305 uM de fosfato de oseltamivir também mostraram um aumento estatisticamente significativo na morte celular programada (*** p

0,001) após 24 horas de tratamento com fosfato de oseltamivir, mas não há alterações foram verificadas com as concentrações mais baixas (gráficos