Abstract

A ativação da via de sinalização Wnt devido à incapacidade de degradar β-catenina é encontrada em 85% dos cânceres colorretais. Cerca de metade dos cancros do cólon expressam uma proteína KRAS constitutivamente ativo. Uma fração significativa de pacientes mostram ambos anormalidades. Nós relatado anteriormente que a regulação negativa simultânea de ambos β-catenina e KRAS foi necessário para induzir a morte celular e o crescimento do tumor inibição significativa de células de cancro colorrectal. Embora atraente, uma abordagem terapêutica baseada em RNAi ainda está longe de ser empregado na prática clínica. Por isso, procurou-se recapitular nossas descobertas anteriores pela utilização de pequenas moléculas inibidoras de β-catenina e KRAS. Mostramos aqui que a β-catenina inibidores PKF115-584 e β-catenina-dependente bloco pyrvinium pamoato atividade transcricional e sinergia com o inibidor KRAS

S-trans, trans

ácido -farnesylthiosalicylic (FTS, salirasib) no cólon células cancerosas impulsionado por Wnt e KRAS sinais oncogênicos, mas não em células que carregam mutações BRAF. A utilização combinada destes compostos foi superior ao uso de qualquer droga sozinha na indução da paragem do crescimento celular, morte celular, e a survivina para baixo MYC-modulação, e inibição do crescimento independente de ancoragem. Análise da expressão de genes do cancro relevantes selecionados revelou down-regulação do CD44 como uma resposta comum aos tratamentos combinados. Estes dados fornecem uma prova de princípio para uma estratégia terapêutica em associação do cancro colorectal

Citation:. Mologni L, Brussolo S, Ceccon M, Gambacorti-Passerini C (2012) sinérgicos Efeitos da Combined Wnt /KRAS Inibição em Colorectal Células cancerosas. PLoS ONE 7 (12): e51449. doi: 10.1371 /journal.pone.0051449

editor: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 16 de Agosto de 2012; Aceito: 31 de outubro de 2012; Publicação: 05 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Mologni et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Associação italiana de Investigação do Cancro (AIRC), Fundação Cariplo, o Ministério da Saúde italiano e Lombardia Governo Regional. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os recentes avanços na nossa compreensão da biologia do tumor mostraram que, apesar da sua grande heterogeneidade, as células cancerosas permanecem muitas vezes dependente de um subconjunto limitado de defeitos genéticos para a sua sobrevivência. O sucesso de terapias específicas em CML, GIST e subgrupos de NSCLC indica claramente que mesmo doença avançada precisa a função dos seus oncogenes fundadores para crescer e sobreviver [1], [2]. Este fenómeno, referido como “vício oncogene”, oferece a base para a terapia do cancro orientada, que deve ser de preferência desprovido de efeitos secundários indesejados sobre as células normais [3].

o cancro colorrectal (CRC) é caracterizada por bem -conhecido defeitos genéticos: a grande maioria (70-95%) dos CRCs esporádicos carregam mutações que hiper-ativam a via Wnt, levando a expressão do gene anormal β-catenina-dependente [4], [5], [6], [7]. Essas alterações ocorrem no início do desenvolvimento do tumor [8] e provavelmente representam viciante lesões para o tumor. Com efeito, a sub-regulação de β-catenina induz a paragem do crescimento e diferenciação de células de CRC [9]. No entanto, β-catenina segmentação falha para matar as células [9], [10], [11]. Isto pode estar relacionado com o facto de CRCs transportar uma variedade de mutações adicionais que também parecem ser relevantes para a sobrevivência. Por exemplo, KRAS mutações ativadoras estão presentes em aproximadamente 35-50% dos cancros do cólon [4], [6], [12], [13], [14]. Se o complemento total de membros da via Ras é tomado em consideração, incluindo ARN, BRAF, NF1, RASSF1A e tirosina-quinases de receptor a montante, em seguida 60-80% dos tumores apresentaram alteração da via de [7], [15], [16 ]. dados de sequenciação do genoma revelou que aproximadamente 30-60% das amostras de CRC abrigar ambas as mutações via Wnt e Ras simultaneamente [6], [7], [16]. Recentes modelos de ratos transgênicos de CRC destacou a importância de ambos Wnt e KRAS sinalização em dois pontos tumorigénese [15], [17], [18]. Portanto, o dobro segmentação pode ser necessária a fim de conseguir efeitos terapêuticos importantes.

No nosso trabalho anterior, demonstrou-se que o silenciamento de β-catenina e KRAS combinado shRNA mediada em células de CRC levou à indução de apoptose em massa

in vitro

e supressão do crescimento do tumor

in vivo

, ao alvejar individualmente qualquer uma das duas vias mostrou efeitos modestos [19]. Aqui, nós tentar traduzir nossas descobertas em uma abordagem farmacológica. Dois compostos não relacionados com diferentes mecanismos de acção, PKF115-584 e pamoato pyrvinium, foram usadas para bloquear-β-catenina transcrição dependente. PKF115-584 é um inibidor de molécula pequena, potente e específico da β-catenina interacção /TCF4 e foi validado como um inibidor da via de sinalização Wnt em diferentes modelos de cancro [20], [21], [22], [23]. Pyrvinium é uma droga anti-helmíntico [24] que tem sido mostrado induzir degradação de β-catenina e do seu co-factor de pygopus, através da activação de caseína quinase 1α [25].

S Restaurant –

trans

,

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ácido -farnesylthiosalicylic (FTS, salirasib) tem sido descrito como um inibidor de RAS específica [26]. SFT imita o carboxi-terminal de

S

-farnesylcysteine ​​mediar o recrutamento de proteínas Ras para a membrana celular. Como consequência, FTS interrompe selectivamente a associação de RAS cronicamente ativa com a membrana, bloqueando assim a sua função [27], [28], [29].

Nós descobrimos que a combinação da β-catenina inibidores PKF115 -584 e pyrvinium pamoate com o inibidor de RAS FTS sinergicamente induz a paragem do crescimento e apoptose em células CRC abrigam tanto Wnt e activação aberrante KRAS. Estes dados representam uma prova de princípio para a inibição Wnt /RAS combinados em câncer colorretal.

Materiais e Métodos

linhas de células, anticorpos e inibidores

SW837 foram um presente tipo de Dr. Manuela Gariboldi (IFOM, Milão, Itália) que originalmente obtido-los de ATCC. IFOM Unidade de Biologia Celular confirmou a sua identidade por genotipagem de microssatélites. Todas as outras linhas de células foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection, onde eles são rotineiramente verificada utilizando ensaios genotípicos e fenotípica para confirmar a sua identidade. células LS174T e HCT-116 portadores de mutações no gene CTNNB1 que estabilizam proteínas β-catenina [30]. DLD-1, SW480, LoVo e SW837 células têm um gene truncado da APC [31], [32]. Estas seis linhas de células expressam uma proteína activada constitutivamente KRAS [33], [34], [35]. linhas de células Colo-201 HT-29 e tem KRAS tipo selvagem, mas abrigam um BRAF

V600E alelo mutante [33], [36]. anotação completa destas mutações é relatado na Tabela S1. células LS174T estavelmente transfectadas com construções shRNA doxiciclina indutível foram descritos anteriormente [19]. Todas as células foram mantidas em meio RPMI 1640 (excepto DLD-1 que foram cultivadas em DMEM e LoVo em nutriente F12 de Ham) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /mL de penicilina, 100 ug /mL de estreptomicina e 2 mmol /L L -glutamina, e incubou-se a 37 ° C com 5% de CO

2 atmosfera. células LS174T com indutível β-catenina e KRAS shRNA foram descritos anteriormente [19]. Os anticorpos seguintes foram utilizados neste estudo: anti-KRAS (Abnova, clone 4F3, diluída 1:1000), anti-pygopus (biotecnologia Santa Cruz, H-216, 1:200), anti-myc (Santa Cruz Biotecnologia, 9E10 , 1:200), anti-actina (Sigma-Aldrich, 1:2000), anti-survivina (biotecnologia Santa Cruz, D-8, 1:200), anti-β-catenina (Millipore, 2H4A7, 1:1000) . PKF115-584 foi gentilmente fornecida por Novartis, Inc. (Basileia, Suíça).

S Restaurant –

trans

,

ácido -farnesylthiosalicylic trans

(STF) foi sintetizado como descrito [26]. Pyrvinium pamoato foi adquirido a Sigma-Aldrich. Todos os inibidores foram dissolvidos em DMSO e armazenado em pequenas alíquotas a -20 ° C. Os ensaios de

de crescimento celular e morte celular

O crescimento celular e a viabilidade foi avaliada nos tempos indicados utilizando o CellTiter 96® Aqueous One Solution celular Ensaio de Proliferação de Sistema (Promega Corporation) seguindo as instruções, conforme relatado anteriormente [37]. Para avaliar a indução de apoptose, as células foram semeadas em placas de 6 poços durante a noite e, em seguida, tratados com inibidores ou veículo. Após 72 horas, as células foram separadas por tripsina, lavadas, e a apoptose foi determinada utilizando o V-FITC Apoptosis Detection Kit Anexina (Bender MedSystems), de acordo com as instruções do fabricante. Todos os gráficos e IC

50 valores foram gerados utilizando o software GraphPad.

luciferase duplo ensaio

As células em placas de 6 poços foram tratadas com inibidores ou veículo e transfectadas com 2? G de TOPflash ou plasmídeos FOPflash e 0,1 ug de phRL-CMV (codificação para

Renilla luciferase

, utilizado como um controlo interno para a eficiência de transfecção), utilizando 3 mL de FuGENE

TM 6 reagente. Após 24 horas, as células foram colhidas, lavadas e lisadas. sinais de luciferase foram detectados utilizando o Sistema de Ensaio Repórter Dual-Luciferase® (Promega). Firefly intensidade luciferase foi normalizada ao longo do sinal de luciferase Renilla

Activo KRAS suspenso ensaio

As células foram tratadas com STF ou DMSO para 15 horas e depois lisadas em magnésio Tampão de Lise (MLB:. 25 mM de Hepes, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 10 mM de MgCl

2, 1% de NP-40, 0,25% de desoxicolato de sódio, glicerol a 10%) contendo inibidores de protease (10 umol /L de benzamidina-HCl e 10 ug /mL de cada vez de aprotinina, leupeptina e pepstatina A). Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação à velocidade máxima e quantificada por ensaio de Bradford. Uma quantidade igual de proteínas totais (1 mg) foram então incubadas com 10 ug de Raf-RBD 1 pérolas de agarose (Millipore) durante 45 minutos a 4 ° C numa roda rotativa. Após 3 lavagens com MLB, as esferas foram ressuspensas em tampão de amostra de Laemmli 2X, fervida e carregados em SDS-PAGE. Ativo, puxou-down KRAS foi revelada pelo anticorpo anti-KRAS. Total de KRAS (entrada) foi avaliada a partir do ligado bruto.

análise de sinergismo

As células foram tratadas com veículo ou inibidores, simples ou combinados em diferentes concentrações e proporções diferentes. Após 3 dias, as células foram divididas 1:10 e re-semeadas na presença de inibidores. No dia 6, o crescimento de cultura de células /viabilidade foi monitorizada pelo ensaio de MTS. O crescimento relativo, em comparação com controlos tratados com veículo, foi usada para calcular a fracção afectada e o índice de combinação para cada combinação experimental, utilizando o software CalcuSyn.

Western blotting

As células foram colhidas, lavou-se com PBS gelado e ressuspensas em tampão de lise, tal como descrito [19]. Os extractos celulares totais foram carregados em SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de nitrocelulose e sondados com os anticorpos primários indicados durante a noite a 4 ° C. As proteínas foram reveladas por quimiluminescência após incubação com anticorpos secundários conjugados com HRP (GE Healthcare, diluída 1:2500).

Soft-agar ensaio colônia

Dez mil células foram incluídos em RPMI contendo a indicada compostos e 0,3% de agarose de baixo ponto de fusão tipo VII (Sigma-Aldrich) e semearam-se em cima de uma camada de suporte de 0,5% de agarose /meio RPMI em placas de 6 poços. inibidores frescos foram adicionados a cada 7 dias para a camada de agar de topo. As colónias foram contadas após 20 dias.

Quantitative real-time PCR

As células foram tratadas com veículo ou inibidores durante 24 ou 72 horas e colhidas. O ARN total foi extraído com o reagente TRIzol (Invitrogen) e retrotranscrito com hexâmeros aleatórios, utilizando um procedimento padrão. Para o conjunto de genes de matriz de 96 cavidades, para a frente e reverso mistura de iniciador (5 pmol de cada) foi descoberto no poço correspondente de cada gene alvo e as placas foram mantidas congeladas a -80 ° C até ser necessário. A mistura de reacção (2 ul de cDNA, 10 ul brilhante III ultra-rápida SYBR® verde QPCR Master Mix e 7 ul de água, por poço) foi adicionado às placas pré-fabricados e PCR quantitativa foi realizada num sistema de detecção de Stratagene MX3000P, sob as seguintes condições: 95 ° C, 3 min (1 ciclo); 95 ° C, 10 seg, 60 ° C, 20 seg (40 ciclos). A confirmação ensaio foi realizado em triplicado utilizando o protocolo de PCR em tempo real padrão recomendado pelo fabricante. O gene GAPDH arrumação foi sempre utilizado como referência interna. Primers para GAPDH foram TGCACCACCAACTGCTTAGC (avançar) e GGCATGGACTGTGGTCATGAG (reverso). Os iniciadores para todos os outros genes listados na Tabela S2.

Resultados

PKF115-584 (figura 1A) e pamoato pyrvinium (Figura 1B) ter sido demonstrado que interfere com a β-catenina -associated complexo de transcrição através de diferentes mecanismos. A fim de verificar a actividade das duas drogas em células de CRC, que caracteriza os seus efeitos na linha celular LS174T, transportando β-catenina e KRAS mutações activadoras [30], [33]. Esta linha celular foi inicialmente escolhida como um modelo porque foi previamente usada para caracterizar os efeitos de silenciamento de genes mediada por siARN [19]. Conforme relatado na figura 1D-E, ambos os fármacos inibiram o crescimento celular de um modo dependente da dose. inibição de crescimento semelhante foi obtida em células DLD-1, que expressam um alelo APC truncada (figura S1A-B). Concomitantemente, os dois compostos inibiu a transcrição a partir do β-catenina /TCF4-responsivo plasmídeo repórter TOPflash (figura 1G-H). Os sub

50 valores IC observados para a proliferação celular e curvas TOPflash estão de acordo, o que sugere que a paragem do crescimento é mediado pela inibição β-catenina. Como esperado, pyrvinium perda de expressão pygopus induzida (Figura 1K). O mesmo resultado foi obtido em células DLD-1 (figura S1E). Além disso, tem sido relatado pyrvinium para forçar β-catenina degradação [25]. Surpreendentemente, a expressão β-catenina manteve-se inalterada em células DLD-1 tratadas com pyrvinium (figura s1e), enquanto diminuiu ligeiramente em células LS174T (figura 1K). A análise de sequenciação do gene β-catenina confirmou a presença da substituição S45F em células LS174T e sequência de tipo selvagem em células DLD-1 dentro da região da fosforilação N-terminal (figura S2). Ambos os fármacos bloqueou a expressão endógena de MYC, um alvo transcricional bem conhecido β-catenina e um forte promotor do crescimento celular (Figura 1J-K e figura S1D-E). Para confirmar a inibição da via Wnt, a expressão de dois genes adicionais alvo conhecidas foi analisada por PCR em tempo real quantitativa. Ambos AXIN2 e CCND1 (codificação para ciclina D1) genes foram regulados negativamente por tratamento com PKF115-584 e pyrvinium (Figura 1 M-N).

(A-C) Estruturas químicas de PKF115-584, pyrvinium e SFT, como previamente descrito (ver ref. 20-29) (D-F) efeitos dose-resposta de PKF115-584, pyrvinium STF e sobre o crescimento de células LS174T. As células foram expostas a doses crescentes de cada inibidor durante 72 horas. ensaio MTS foi usada para avaliar o efeito dos compostos sobre a proliferação celular. IC

50 valores são mostrados para cada composto. A actividade da luciferase (L-H) a partir do plasmídeo TOPflash foi determinado após incubação durante 24 horas com ou PKF115-584 pyrvinium. Os valores são unidades relativas de luz (RLU) com células tratadas com DMSO definidos como 1,00. (I) a análise de Western blot de KRAS activo suspenso carregado-GTP (painel superior) e KRAS totais (em baixo) a partir de células LS174T tratados com STF. (J-l) a expressão de c-myc análise Western blot mostrando em células LS174T tratadas com concentrações crescentes de cada composto durante 48 horas. A partir de células tratadas com pyrvinium, pygopus e expressão β-catenina também são mostrados (K). Actina é sempre mostrado como um controle de carga. (M-N) A análise quantitativa por PCR de AXIN2 e expressão D1 CCND1 /ciclina após o tratamento com doses crescentes (0,125-1,0 ^ M) de PKF115-584 (M) e pyrvinium (N). (O) análise de transferência de Western de fosforilação de MEK em células tratadas com STF. MEK total e actina são mostradas como controlos. (P-Q) curvas dose-resposta do PKF115-584 pyrvinium e na ausência (círculos vazios) ou na presença (círculos a cheio) 100 uM de STF. Cada curva indivíduo é normalizada na amostra correspondente sem inibidor β-catenina.

As FTS inibidor de RAS (figura 1C) inibiu o crescimento celular em concentrações micromolares elevadas (figura 1F ea figura S1C), em linha com os relatórios anteriores [38], [39], [40]. FTS esgotou o (ativo) Piscina KRAS carregado-GTP, deixando montante total KRAS inalterada (Figura 1I). Esta actividade anti-KRAS traduzido para uma diminuição marcada dos níveis de proteína MYC (Figura 1D) e fosforilação de MEK (Figura 1O), mas não de expressão de Fos (dados não mostrados) em células LS174T. No entanto, o tratamento FTS levou a respostas moleculares diferentes em células DLD-1: sinal de fosfo-MEK estava inalterado e MYC foi apenas minimamente afectada, enquanto que a expressão FOS diminuiu substancialmente (figura S1F). Para avaliar se a actividade anti-proliferativa dos inibidores β-catenina pode ser potenciado pela SFT, curvas de dose-resposta foram gerados por exposição das células LS174T a doses crescentes de PKF115-584 (Figura 1P) e pamoato pyrvinium (Figura 1T) na ausência ou na presença de 100 uM de STF. Em ambos os casos, a adição de STF deslocou de forma significativa a curva. Em particular, a sensibilidade pyrvinium aumentou cerca de 10 vezes (IC

50 pyrvinium, 0,1 uM; IC

50 + pyrvinium STF, 0,01 uM). Estes resultados indicam que completamente os efeitos anti-proliferativos de dois inibidores da β-catenina e RAS inibidor STF correlacionar com a inibição específica de β-catenina e actividades KRAS, respectivamente, em células LS174T. Além disso, aumenta a citotoxicidade de STF inibidores β-catenina nestas células.

De modo a definir melhor a cooperação de β-catenina e a inibição KRAS em células de CRC, a actividade de PKF115-584 e pyrvinium, sozinho e em várias combinações com STF, foi testada pelo ensaio de MTS em um painel de linhas celulares de CRC que transportem mutações oncogénicas diferentes (tabela S1). Os resultados obtidos em concentrações fixas são mostrados na Figura 2 como gráficos de barras (PKF115-584: 125 ou 250 nm; pyrvinium: 50 nM; FTS: 100 uM). Curiosamente, enquanto que a sensibilidade a agentes individuais diferia entre as várias linhas de células, em todas as células-KRAS mutado os tratamentos combinados causou inibição do crescimento significativamente maior em comparação com os tratamentos individuais. O sinergismo foi então estudados mais extensivamente ao longo de um intervalo de concentrações de inibidores, utilizando o método descrito por Chou e Talalay, com base no princípio da lei de acção de massa [41]. Os valores do índice de combinação (IC) foram calculados a partir de dados experimentais ao longo de toda a gama de efeitos fraccionárias e estão apresentados como gráficos XY na Figura 2. Os valores específicos de IC em ED50, ED75 e ED90 são relatados na Tabela 1. Tal como previsto pelo estado de mutação oncogénica, todas as linhas de células que carregam mutações em ambas via Wnt (APC ou β-catenina) e KRAS mostrou interacções sinérgicas (CI 1), exceto em pontos extremos da fração afetadas, onde os efeitos são ou insignificante ou demasiado forte. Em contraste, as células de HT-29 (que transportam KRAS tipo selvagem e um mutado BRAF

alelo V600E) não mostrou sinergismo. Em vez disso, efeitos antagônicos (CI 1) foram anotados. No entanto, a combinação dos PKF115-584 com um inibidor de BRAF (PLX-4032) mostrou sinergismo fraco em células HT-29 em doses elevadas (Figura S3). Dados adicionais obtidos com pyrvinium /FTS em dois KRAS- e uma linhas de células com mutação BRAF são mostrados na figura S4. No geral, a análise dos valores de IC na ED50 (pyrvinium /STF) mostra correlação entre estado mutacional do KRAS /BRAF e interação sinérgica (p = 0,0021): todos os KRAS células mutantes mostrou sinergismo, embora nem de duas linhas de células mutante BRAF fez (figura S5) , embora o número limitado de linhas de células mutante BRAF testados não permite tirar conclusões definitivas. Em contraste, os efeitos não se correlacionou com p53 ou estado MSI (tabela 1). No seu conjunto, estes resultados sugerem que PKF115-584 pyrvinium e pode ser combinado com STF em células abrigando CRC anormalidades genéticas Wnt /KRAS concomitantes, para conseguir os efeitos terapêuticos melhor.

As linhas celulares indicadas foram cultivadas durante 6 dias na presença de inibidores como agentes únicos ou em combinação, ou o veículo isolado. ensaio MTS foi utilizado para avaliar os efeitos de cada tratamento sobre o crescimento de cultura de células e viabilidade. (A) PKF115-584 /STF e (B) pyrvinium combinação /STF. Para cada linha celular, o gráfico de barra (à esquerda) mostra o efeito de uma dose única (PKF115-584, 0,25 uM [LS174T e DLD-1] ou SW480 [0,125 uM e HCT-116]; pyrvinium, 50 nM; STF, 100 uM). O gráfico XY (direita) mostra índices de combinação, tal como uma função da fracção afectada (ver Materiais e Métodos). Para cada linha celular, os genes que estão mutadas, afectando Wnt e Ras vias, são indicados entre parêntesis. CTRL = controle; Pyrv = pyrvinium. Em todos os painéis, símbolos de número (#) indicam significância em relação ao inibidor de β-catenina (PKF115-584 ou pyrvinium); asteriscos (*) indica significância contra SFT; um símbolo, p 0,05; dois símbolos, p 0,01; três símbolos p 0,001.

Em seguida, caracterizada ainda mais as combinações sinérgicas usando ensaios independentes adicionais (Figura 3 e Figura S6). O crescimento celular foi monitorizado durante o curso de vários dias, depois de expor células LS174T e DLD-1 com as três drogas, sozinhos ou em combinação, mostrando que FTS potenciada PKF115-584 e pyrvinium toxicidade já após 3-4 dias (Figura 3A e figura S6A). A inibição do crescimento foi acompanhada pela indução de apoptose: o número de células apoptóticas precoces era significativamente mais elevada nas amostras de combinação em comparação com o mesmo fármaco sozinho (Figura 3B e Figura S6B). Como comparação, a apoptose em células LS174T foi avaliada em paralelo após a indução de anticorpos anti-β-catenina e anti-KRAS shRNAs, atingindo um nível comparável de apoptose precoce na amostra de duplo silenciado (figura 3B). O silenciamento de proteínas alvo é mostrado na figura S7. Em seguida, como todos os três compostos são capazes de inibir a expressão MYC em células LS174T (Figura 1J-L), determinou-se a combinação de concentrações subóptimas as drogas podem induzir um melhor bloqueio da transcrição MYC. Relatórios anteriores demonstraram que ambos KRAS e β-catenina é capaz de regular a expressão MYC em células de cancro do cólon [19], [42], [43]. De facto, os tratamentos combinados de 24 horas mostrou uma melhoria significativa na inibição da expressão MYC em relação aos tratamentos únicos (Figura 3C). Este resultado sugere que MYC é um efector comum das duas vias e a sua infra-regulação correlaciona-se com a inibição do crescimento celular e viabilidade nestas células. Em contraste, não se observou efeito das combinações sobre os níveis de MYC em células DLD-1 (figura S6c), em linha com a falta de MYC regulação negativa por estas células em STF. Além disso, a inibição combinada causou forte down-modulação da expressão survivin, enquanto que pouca ou nenhuma mudança foi obtido por tratamentos individuais (Figura 3D e figura S6D). Survivina é um alvo da transcrição de ambos os Wnt e KRAS vias [19], [44], [45] e tem um papel crucial na sobrevivência do cancro orientada por KRAS [46]. Finalmente, para estudar os efeitos a longo prazo de β-catenina e KRAS inibição combinada, o crescimento independente da ancoragem foi avaliada após uma única adição de doses sub-letais de PKF115-584 ou pyrvinium, e FTS. Tal como mostrado na Figura 3E-F e na figura S6E-F, cada combinação de inibidor de β-catenina com STF teve um profundo efeito sobre o crescimento de ágar mole de células LS174T e DLD-1.

(A) células foram tratadas com 100 uM de STF, 0,25 uM PKF115-584 ou 50 nM pyrvinium, sozinho ou em combinações, ou de veículo, durante 6 dias. viabilidade da cultura celular foi avaliada nos dias 3, 4 e 6 por MTS. O diâmetro externo relativo em comparação com células de controlo tratados com veículo foi registrado como fracção sobrevivente. (B) As células LS174T foram cultivadas durante 3 dias na presença dos compostos indicados (as mesmas concentrações como em [A]); Em paralelo, células LS174T que transportam os siRNAs indutíveis (Sint, não segmentação; siBC, anti-β-catenina; siKR, anti-KRAS) foram tratadas com doxiciclina durante o mesmo tempo. A apoptose foi determinada por anexina V propídio coloração dupla /iodeto. A percentagem de células apoptóticas precoces (anexina V-positiva /iodeto de propídio-negativa) é relatado no gráfico. (C) As células LS174T foram tratados com PKF115-584 (0,5 uM), pyrvinium (50 nM) e STF (100 uM), por si só ou em combinação, durante 24 horas e a expressão de c-myc foi avaliada por PCR em tempo real utilizando GAPDH como um gene de referência. A expressão foi normalizada em células de controlo tratados com veículo. (D) As células foram incubadas durante 72 horas com os inibidores e os lisados ​​celulares sondadas com anticorpos anti-survivina e p-actina. (E-F) Dez mil células LS174T foram cultivadas em soft-agar na presença de PKF115-584 (0,1 uM), pyrvinium (25 nM), FTS (50 uM), isoladamente ou combinados. colónias grandes foram contados 20 dias depois. O número de colónias formadas por células não tratadas de controlo é definida como 100% (E). Fotografias representativas são mostrados no painel (F). Análise estatística: veja legenda para Figura 2.

Para obter mais conhecimentos sobre as modificações de transcrição induzidos pelos tratamentos combinados, a expressão de um painel selecionado de genes relacionados à sinalização Wnt e KRAS, cólon câncer e a apoptose, foi estudada usando uma matriz de PCR quantitativa caseiro. O mapa de calor na figura 4A mostra as alterações relativas na expressão após 72 horas de tratamento com drogas únicos ou combinados, em comparação com células de controlo tratados com veículo. Como esperado, agentes únicos deixou a maioria dos genes inalterados, enquanto que as combinações induziu uma repressão geral do conjunto de genes seleccionado. Em particular, CD44, COX2, CTBP2, ciclinas D1 e D2, ITF2, p70S6K2 e RASSF7 foram fortemente regulada por ambas as combinações, em comparação com tratamentos individuais. Além disso, a combinação pyrvinium /STF causada baixo-modulação de genes adicionais, tais como a BCL2, BCL2L1 (que codifica para a proteína Bcl-X

G factor anti-apoptótico), BCL9L, KRAS, CDKN1A (p21

WAF1) e PRKCA. A fim de pegar mudanças início de transcrição que ocorrem antes de qualquer sinal de estresse celular, um pulso de 24 horas foi executado com a combinação /FTS pyrvinium. Esta combinação foi considerado preferível ao com um PKF115-584 para esta análise, como pyrvinium mostrou um grau mais elevado de diminuição da regulação de genes. Os dados são relatados na coluna mais à direita do heatmap. Apesar de algumas diferenças em relação à exposição mais longa de drogas, muitas das alterações foram conservadas, incluindo a sub-regulação de CD44, COX2, BCL2 e ciclinas D. Além disso, a sobre-regulação da proteína pro-apoptótica APAF1 foi observado. Curiosamente, p21

WAF1 foi transitoriamente up-regulada a 24 horas antes de ser regulada em 72 horas. Para confirmar ainda mais esses dados, alguns genes foram analisados ​​de forma independente por tempo real padrão de PCR em quatro linhas celulares. A Figura 4B mostra os resultados a partir de células LS174T, o que confirma a regulação do gene observada no conjunto de dados original. Os dados a partir de todas as quatro linhas de células foram ainda analisados ​​para identificar modulação da expressão do gene sinérgica, definida como 2 vezes a mudança de expressão de uma combinação em comparação com os tratamentos individuais (Figura 4C). Curiosamente, a expressão BCL2 foi sinergicamente regulada para baixo em todas as quatro linhas celulares por pyrvinium /combinação STF (preenchido caixas cinzentas). A ciclina D1 e CD44 marcados sinérgico em três de quatro linhas celulares. CD44 foi também sub-regulada em células DLD-1, mas a extensão de modulação não atingiu o limite para um efeito sinérgico (figura S8). A combinação PKF115-584 /STF provou ser menos eficaz nesta análise, com apenas CD44 mostrando sinérgico para baixo-regulação em pelo menos duas linhas de células (LS174T e SW480). Estes resultados indicam CD44 como uma resposta comum para a dupla β-catenina /KRAS alvo.

células LS174T foram tratados durante 24 ou 72 horas com inibidores e um painel de genes focados na Wnt, Ras e apoptose vias foi estudada por qPCR utilizando uma matriz de 96 poços (a) ou padrão de PCR em tempo real (B). Os gráficos em (b) mostram as alterações de expressão de dobragem em comparação com controlos tratados com veículo. (C) Síntese tabela relatando-PCR em tempo real A análise de dados a partir de todas as linhas celulares. caixas cheias indicam efeito sinérgico sobre a expressão gênica ( mudança de 2 vezes em relação a cada tratamento). PY = pyrvinium.

Tendo provado a eficácia da inibição dupla Wnt /KRAS

in vitro

, tentamos traduzir esses achados em uma nova estratégia terapêutica

in vivo

. No entanto, PKF115-584 já não é produzido pela Novartis e a sua síntese em grande escala revelou-se extremamente desafiador e demorado. Quanto pamoato pyrvinium, é relatado para ser fracamente absorvidos [47]. No entanto, a administração oral de pyrvinium foi descrito por dois grupos [48], [49]. Portanto, uma experiência-piloto foi executado para verificar se a droga poderia atingir a meta em ratinhos nus, ao olhar para a expressão pygopus em xenoenxertos LS174T após três administrações orais diárias de 10 mg /kg pyrvinium. Os resultados foram negativos (figura S9), portanto, nós não tentou mais

in vivo

análises.

Discussão

Quase todos os cânceres colorretais mostram alteração da via Wnt que controla p-catenina activação. Por conseguinte, a inibição da β-catenina pode conduzir a um progresso significativo no tratamento desta doença. No entanto, dados recentes revelaram que mais de um “driver” via oncogênico é frequentemente ativada em um único tumor [50], [51]. Portanto, múltiplos segmentação oncogene é provável que seja necessário para erradicar a doença. Em uma fração significativa de tumores colorretais, Wnt e alterações da via KRAS coexistem [6], [13], [14]. Apesar do facto de ter sido conhecido há quase 30 anos, o oncogene KRAS tem sido um objectivo elusivo até agora. Os agentes que bloqueiam KRAS modificações pós-tradução têm sido ineficazes em ensaios clínicos [52]. Estratégias para atingir efectores a jusante de KRAS [53], [54], [55] ou para estabelecer interações letais sintéticos [56], [57], [58] mostraram respostas diferentes de caso para caso, possivelmente devido à complexidade da a via KRAS. Isso também é realçada pelo resultado molecular diferente da inibição KRAS observada em duas linhas celulares de CRC em nosso estudo. Tomando uma abordagem diferente, STF interfere especificamente com KRAS de ancoragem à membrana celular, imitando a sua unidade farnesylcysteine ​​[29].

Neste trabalho, os efeitos da β-catenina combinados e inibição KRAS por moléculas pequenas foi investigada . Sinergismo era evidente em um painel de linhas celulares de CRC que transportam diferentes tipos de mutações que afectam as vias de destino, utilizando vários ensaios independentes. Combinando doses sub-óptimas de β-catenina e inibidores KRAS observou-se inibição significativa do crescimento e apoptose, que foram espelhados por uma forte infra-regulação da expressão survivin. Survivina inibe a activação de caspases efectoras e é sobre-regulada em muitos tipos de cancro. Ao bater dois caminhos que controlam a sua expressão em células de CRC, obteve-se a supressão completa da sua actividade anti-apoptótica e, portanto, a indução da apoptose.