Abstract

Nos últimos anos, muito tempo não codificante RNAs (lncRNAs) têm sido demonstrados para jogar chave papéis na tumorigênese. No entanto, as contribuições de lncRNAs ao câncer cervical (CC) permanecem largamente desconhecidos. Neste estudo, expresso diferencialmente lncRNAs e ARNm em cancro do colo do útero e tecidos peritumorais emparelhados foram detectadas por análise de transcriptoma de microarray. Encontrámos 708 conjuntos de sondas de lncRNAs aumentada e 836 conjuntos de sondas diminuiu em tecidos CC, enquanto de 1288 conjuntos de sondas de ARNm diferencial aumentada e 901 conjuntos de sondas de ARNm diminuída. Os resultados foram validados por reacção em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR). Então, encontramos uma específica diferencialmente expressos lncRNA pode ligar fisicamente para potenciador de homolog2 zeste (EZH2) usando RNA imunoprecipitação. Nós denominou como lncRNA EZH2-obrigatório em câncer cervical [lncRNA-EBIC]. Os ensaios de cicatrização de feridas e ensaios de invasão de Matrigel foram utilizados para determinar a função deste lncRNA ao silenciar-lo. Observamos que a migração e invasão das células cancerosas cervicais

in vitro

foram inibidas mediante a supressão da lncRNA-EBIC por siRNA. Descobrimos também que foi necessária a associação entre lncRNA-EBIC e EZH2 para a repressão de E-caderina, que foi um molecular chave na metástase do câncer cervical.

Conclusão

Estes resultados demonstraram que lncRNA-EBIC foi um lncRNA oncogênico, o que poderia promover a invasão de células tumorais em CC pela ligação a EZH2 e inibir a expressão de e-caderina

Citation:. Sun Nx, Ye C, Zhao Q, Zhang Q, Xu C , Wang Sb, et ai. (2014) Longos não codificante RNA-EBIC Promove Tumor invasão celular por ligação a EZH2 e reprimindo E-caderina em câncer cervical. PLoS ONE 9 (7): e100340. doi: 10.1371 /journal.pone.0100340

editor: Vinod Scaria, Instituto CSIR de Genômica e Biologia Integrativa, Índia |

Recebido: 30 Janeiro, 2014; Aceito: 26 de maio de 2014; Publicação: 09 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sun et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Nature Science Foundation da China (No. 81.272.213), https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm, e da Fundação de Ciência Natural de Xangai (13ZR1414300), http: //www. stcsm.gov.cn. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical (CC) é o segundo câncer mais comumente diagnosticado ea terceira principal causa de morte por câncer em mulheres [1]. Cerca de 49.000 novos casos de CC foram diagnosticados e 275.000 mulheres foram mortas em 2011, que a maioria ocorreu nos países em desenvolvimento [2], [3]. Além disso para a patogénese de persistentes de alto risco, o vírus do papiloma humano (HPV), as contribuições de outros factores para o desenvolvimento e progressão desta doença maligna precisa de ser elucidados.

Mais recentemente, evidências têm demonstrado que emergentes mecanismos epigenética pode ser a chave para iniciar a tumorigénese. Rompimento de controle epigenético de metilação do DNA, a regulação RNA, e modificação da histona, etc, resultando na variação hereditária de genes sem uma mudança na sua sequência de codificação, é difundida em malignidade [4], [5]. Embora pesquisas de pequenos RNAs não-codificantes têm dominado o campo da regulação RNA nos últimos anos [6], [7], uma ampla gama de funções celulares também tem sido associada a algumas classes recém-descritas de RNAs não codificantes. Uma dessas classes, longos RNAs não codificantes (lncRNAs), é transcrito de mais de 200 nucleótidos sem potencial de codificação da proteína. Numerosos estudos demonstraram que a sua desregulação tem um papel funcional em vários tipos de cancros [8]. Por exemplo, lncRNA-HEIH desempenha um papel chave na regulação do ciclo celular de células de carcinoma hepatocelular, e expressão elevada lncRNA-HEIH correlaciona-se com um risco aumentado de recorrência e reduzida taxa de sobrevivência pós-operatório geral [9]. Como lncRNAs estão emergindo como componentes críticos do transcriptoma câncer, é razoável prever que lncRNAs contribuir para o desenvolvimento e progressão do câncer cervical. No entanto, estudos sobre o papel da lncRNAs em CC são muito preliminares. Até agora apenas uma pesquisa detectados níveis aumentados de expressão lncRNA aberrante em neoplasia intraepitelial cervical espécimes (NIC), representando os tipos histopatológicos suaves, moderados e graves, respectivamente, o que sugere que lncRNAs podem desempenhar papéis importantes no desenvolvimento e progressão de lesões pré-cancerosas ou carcinomas [10]. No entanto, as contribuições fisiopatológicos globais de lncRNAs em CC permanecem largamente desconhecidos.

Um estudo recente relatou que um quinto de todos os lncRNAs humanos identificados até o momento está fisicamente associado com Polycomb complexo repressivo 2 (PRC2, composta de histona H3 lisina 27 metilase EZH2, SUZ12 e EED), sugerindo que eles podem ter um papel em geral proteínas Polycomb-grupo de recrutamento para os seus genes-alvo e que conduz a transcrição repressão [11]. EZH2 (Enhancer de Zeste Homólogo 2) é um componente crítico da PRC2, que está envolvido em vários mecanismos reguladores importantes, tais como a diferenciação de células estaminais, a proliferação celular, do ciclo celular, e oncogénese [12], [13]. Há evidências crescentes de que EZH2 é muitas vezes sobre-expresso em muitos tipos de cancros humanos e pode promover a proliferação celular, invasão e angiogénese tumoral [14] – [16]. Além disso, vários lncRNAs, tais como lncRNA-HEIH, H19 e HOTAIR, têm sido mostrados para ligar fisicamente a EZH2 e desempenham um papel importante na modulação da epigenome cancro [9], [17], [18]. Com base nestes resultados, a hipótese de que alguns lncRNAs também podem desempenhar papéis ativos nos comportamentos biológicos malignas do CC mediando e cooperando com EZH2.

Por isso, será interessante determinar as funções biológicas de lncRNAs no CC e se eles funcionam para recrutar proteínas PCG de genes alvo. Neste estudo, por meio de análise de transcriptoma microarray, encontramos uma série de lncRNAs para cima ou para baixo-regulado no CC em comparação com os tecidos peritumorais emparelhados. Nós ainda identificado um novo lncRNA que foi regulada em CC e poderia ligar fisicamente para EZH2 e participar na regulação da migração e invasão de linhagens celulares CC

declaração de Ética. Materiais e Métodos

o estudo foi aprovado pelo Comité de Especialidade de Ética da Biomedicina Investigação da segunda Universidade médica Militar. consentimento informado por escrito foi obtido de pacientes para o uso de suas amostras de tecido neste projeto de pesquisa.

As características dos pacientes e amostras de tecido

Vinte e oito pares de CC snap-congelados e tecidos peritumorais emparelhados foram obtido a partir de Xangai Changzheng Hospital com consentimento informado e aprovação pelo comitê de ética institucional. amostras de tecido clínicos foram verificados como tumor ou não-tumor por exame histopatológico e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. As características dos pacientes são detalhados na Tabela S1.

Microarray e computacional análise

Resumidamente, cinco tecidos CC e cinco tecidos peritumorais emparelhados (Tabela S1) foram usadas para sintetizar DNA complementar de cadeia dupla ( ADNc) através da reacção em cadeia da polimerase-transcrição reversa. CDNA de cadeia dupla foi hibridizada para matrizes Glue Grant transcriptoma humano (Affymetrix, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante, e Affymetrix® Expressão Console Software (versão 1.3.1) foi utilizado para a análise microarray. Os dados brutos (arquivos CEL) foram normalizados ao nível transcrição utilizando o método multi-média robusta (RMA workflow). foi calculado sumarização mediana de expressão transcrição. dados de nível Gene representada genes encontrados no Rfamdb, fRNAdb, Ensembl, Noncodedb e bancos de dados RefSeq. Usando o mesmo método, os dados de nível exão representado transcritos de comprimento completo. O modelo de variância aleatório (RVM) t-teste foi utilizado para identificar os genes expressos diferencialmente entre os grupos peritumorais e CC, sem aumentar a taxa de falsos positivos [19]. Foram selecionados genes diferencialmente expressos de acordo com RVM e taxa de descoberta de falsas (FDR) analisa, com um limiar P-valor predefinido de 0,05 [20]. agrupamento hierárquico (Cluster3.0) e análise TreeView (Universidade de Stanford, EUA) foram realizadas com base nos resultados de genes expressos diferencialmente. Os dados de microarranjos discutidos neste artigo foram submetidos a National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) e são acessíveis através do número de acesso (GEO) Série GSE55940 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/query/acc.cgi?acc=GSE55940).

a filtragem de dados e criação de uma rede de co-expressão do gene

a estrutura da consulta do Microsoft Office Access 2013 foi usado para sobrepor diferencialmente genes expressos com o gene do cancro do colo banco de dados (CCDB) pelo símbolo gene. análise de rede Co-expressão foi realizada entre os genes de sobreposição e diferenciais lncRNAs para identificar as interações gene [21]. redes de co-expressão foram construídos de acordo com a intensidade do sinal normalizado de genes expressos específicos. Em primeiro lugar, construiu-se a matriz de adjacência de rede, como descrito anteriormente [22]. Em segundo lugar, calculou-se a correlação de Pearson para cada par de genes e escolheu os pares de correlação de destaque para a construção da rede. Para fazer uma representação visual, foram selecionados apenas os genes com a interação mais forte (0,865 ou superior). Na análise de rede, um grau é o parâmetro mais importante da centralidade de um gene dentro de uma rede que determina a importância relativa. Grau central é definida como o número de ligações de um nó tenha a outra. Para explorar a diferença grau de certos genes de hub e vizinhos entre câncer e grupos peritumoral, | diffK | foi introduzido para a análise. A | diffK | é igual à diferença nos graus padronizados de genes hub em 2 grupos e sugere que o gene hub pode ter uma forte capacidade de regulação na região canceroso ou peritumoral.

cultura celular

Humano linhas celulares de cancro do colo do útero (HeLa, SiHa, CaSki) foram adquiridos do Instituto Xangai de Ciências da Vida celular Resource Center, Shanghai, China. Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio DMEM (Gibco, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina /estreptomicina (Biowest, França). tecidos cervicais normais foram obtidas de mulheres na pré-menopausa submetidas à histerectomia por causa do mioma ou adenomyoma no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia em Shanghai Changzheng Hospital. células epiteliais cervicais primários foram digeridos a partir de tecidos por DispaseII (Roche, Suíça) e solução tripsina-EDTA (Biowest, França) e foram mantidos em queratinócitos-SFM (Gibco, EUA). Todas as culturas de células foram manter a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2, incubadora humidificada.

quantitativa PCR em tempo real A análise

O ARN total foi extraído a partir de amostras de tumor congeladas e células linhas usando reagente Trizol (Invitrogen, EUA) e utilizando iniciadores aleatórios e um Kit de M-MLV de Transcriptase reversa (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante transcritas reversamente. A expressão de lncRNAs filtrados e genes de codificação associados foi medida pela sonda TaqMan quantitativa PCR em tempo real (qPCR) usando Premix Ex Taq (TakaraBio, Japão) em um sistema Applied Biosystems StepOne PCR em tempo real (Applied Biosystems, EUA) de acordo com as instruções do fabricante . H18S foi usado como um padrão interno, e cada amostra foi analisada em triplicado. expressão gênica relativa (dobre mudança) foi calculado usando a 2

– método △△ Ct. As sondas e iniciadores correspondentes neste estudo foram concebidos e sintetizados por GenePharma (Xangai, China). As sequências dos iniciadores e sondas em qPCR estão listados na Tabela S2. Os iniciadores de U6 foram concebidos e sintetizados por RiboBio (Guangzhou, China) .As sequências de primers não são fornecidos pela corporação.

RNA imunoprecipitação

citoplasmática Kit extração de proteínas e Nucleares (Beyotime, China) combinado com o kit de imunoprecipitação de proteína ARN-ligação (Millipore, EUA) foram utilizados para executar experimento PIR de acordo com as instruções do fabricante. O anticorpo usado para EZH2 PIR são D2C9 (Cell Signaling Technology, EUA). ARN precipitou-Co foram detectadas por PCR de transcrição reversa (RT-PCR), a electroforese em gel de agarose (AGE) e qPCR. Os ARNs totais de entrada de controlo (controlos) e também foram ensaiadas para demonstrar que os sinais detectados eram de ARN que se ligam especificamente a EZH2. Os iniciadores específicos para o gene utilizado na experiência PIR são apresentados na Tabela S2.

siARN transfecção

células

HeLa e SiHa foram plaqueadas numa placa de 6 poços em meio de crescimento antibiótico-livre suplementado com 10 % FBS e cultivados até 50-70% confluentes. SiRNAs foram misturados com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA) em meio de soro reduzido (Opti-MEM, Gibco, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A transfecção foi levada a cabo durante 48 h, seguido pela colheita das células tratadas para estudos posteriores. siRNAs foram concebidos e sintetizados por GenePharma (Xangai, China). As sequências de siRNA lncRNA-EBIC, EZH2 e o controlo negativo utilizado neste estudo estão listados na Tabela S2.

Cicatrização de feridas ensaio

Para realizar o ensaio de cicatrização de feridas, as células foram semeadas em 6- bem placas e transfectadas durante 48 horas, quer com lncRNA-EBIC siRNA ou siRNA controlo negativo, seguido pela criação de, uma ferida zero homogénea artificial em uma cultura confluente em monocamada de células HeLa e CaSki com uma ponta de pipeta de 200 uL. meio isento de soro foi adicionado durante mais 24 h de incubação, e as células foram fotografadas em 3 pontos de tempo diferentes (0, 12, e 36 h), utilizando um microscópio invertido. Por cento do fechamento da ferida foi calculada com imagem J 1,47 software. Cada experimento foi realizado em triplicado.

Matrigel ensaio de invasão

ensaios de invasão Matrigel foram realizadas em triplicata utilizando Transwell

® suportes permeáveis ​​(Corning, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram transfectadas quer com lncRNA-EBIC siRNA ou um controlo negativo ARNsi durante 48 h, como descrito acima, seguido por plaqueamento sobre uma membrana de Matrigel-revestido na câmara superior de um soro de 24 poços inserir (8 um de tamanho de poro) contendo livre meios de comunicação. A câmara inferior contém meios DMEM com 10% de FBS. As células foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO

2 durante 48 h após o plaqueamento, após o que a parte inferior do inserto câmara foi fixada com metanol e corada com violeta de cristal. As células que permaneceram na câmara superior foram removidas com um cotonete. O número de células que invadiram através da membrana foi determinada a partir de imagens digitais captadas em um microscópio invertido e calculado com imagem J 1,47 software.

As células foram colhidas em RIPA análise Western blot

de tampão de lise ( Beyotime, China). Quantidades iguais de proteína foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno (Millipore, EUA). As membranas foram bloqueadas em solução salina /Tween-20 tamponado com fosfato contendo 5% de leite desnatado e incubadas com um anticorpo para EZH2 (Cell Signaling Technology, EUA) ou β-actina (Santa Cruz Biotechnology). Em seguida, as membranas foram incubados com IgG marcado com HRP (KPL, EUA) e detectada utilizando uma perfeição Epson V300 Photo Scanner (Epson, Japão). A análise quantitativa foi realizada usando software de AlphaEase FC (Alpha Innotech, EUA). Os níveis de proteína foram normalizados para a p-actina.

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS versão 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) e GraphPad Prism 5.0 software. Os dados numéricos foram apresentados como médias e desvios-padrão. Diferenças entre proporções foram avaliadas pelo teste t de Student emparelhado ou não pareado. P valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

lncRNA e mRNA perfis de expressão em CC

Cinco CC e tecidos peritumorais emparelhados foram analisadas para possíveis mudanças transcriptoma em CC. usando uma matriz Affymetrix Glue Grant transcriptoma humano. agrupamento hierárquico mostrou variações sistemáticas na expressão de lncRNAs e mRNAs entre CC e tecidos peritumorais emparelhados. Em comparação com tecidos peritumorais emparelhados, 708 conjuntos de sondas de lncRNAs aumentada e 836 conjuntos de sondas diminuiu em tecidos CC (Figura 1a), enquanto que conjuntos 1288 ARNm de sonda diferencial aumentada e 901 conjuntos de sondas de ARNm diminuiu (Figura 1B).

Usando mapa de calor análise de agrupamento hierárquico, foram identificados 1544 lncRNAs (a) e 2189 mRNAs (B) que foram diferencialmente expressos em tecidos CC, mas não nos tecidos peritumorais emparelhados (c, tecido de câncer; p, tecidos peritumoral; P 0,05). Up-regulação ou a regulação negativa é representado como vermelho ou verde, respectivamente.

rede co-expressão dos genes e candidatos lncRNAs

Um teste t de RVM foi utilizado para identificar o número de diferencialmente expressos lncRNAs e mRNAs de análise de microarray de CC e tecidos peritumorais emparelhados. Para filtrar os dados, primeiro sobrepostas mRNAs expressão diferencial com o Banco de Dados Gene do cancro do colo do útero (CCDB.) Nós determinamos 12 regulada para baixo e 48 mRNAs up-regulamentados (Tabela S3), incluindo APOD, ESR1, MMP1, PCNA e EZH2, etc. análise de rede Co-expressão foi realizada entre as 60 mRNAs filtrados e 1545 lncRNAs diferencialmente expressos. A estrutura de rede do CC (Figura 2A) e amostras de tecido peritumoral (Figura 2B) foi marcadamente diferente, implyapp: addword: o que implica que os padrões de co-expressão de ARNm e lncRNAs entre CC e tecidos peritumorais emparelhados são diferentes. Estudos recentes demonstraram que as oncoproteínas E7 de HPV16 de alto risco poderia activa a expressão de EZH2 a nível transcricional que contribuiu para a proliferação e a resistência à apoptose de células CC [23]. Além disso, EZH2 estão sobre-expressos em tecidos CC e sua alta expressão correlaciona-se significativamente com a agressividade [24]. Mais recentemente, estudos têm sugerido que lncRNAs desreguladas pode ter um papel na indução geral de todo o genoma re-direccionamento de PRC2 que irá resultar na expressão aberrante de genes, em última análise, levar a cancro ou outras doenças [11], [18]. Assim, optamos EZH2, uma subunidade núcleo do PRC2, para a detecção de potenciais lncRNAs envolvidos na CC porque apresentou como um nó hub com alto grau centralidade. Onze mRNAs e nove lncRNAs (TI17313, TI13831, TI10124, TI18382, TI21327, TI18318, TI22687, TI09485 e ASK00420; (Tabela S4), que firmemente interagiu com EZH2 (interação ≥0.865) foram escolhidos a partir da sub-rede EZH2 na co-expressão rede do grupo peritumoral.

RNAs Uma exibição da rede lncRNA-mRNA para o 60 mRNAs filtrados e 1545 lncRNAs diferencialmente expressos em CC (a) e emparelhados tecidos peritumoral (B) é mostrado. Up-regulados são mostrados em vermelho, e RNAs down-regulados são apresentados em azul. nós com um anel verde representam lncRNAs. nós sem um anel verde representam mRNA. tamanho do nó representa a centralidade grau.

Validação do candidato lncRNAs em tecidos CC e linhas celulares

Para validar os dados de microarranjos, analisamos primeiro TI17313, TI13831, TI10124, TI18382, TI21327, TI18318, TI22687, TI09485, e expressão ASK00420 em 23 CC emparelhados e amostras peritumorais utilizando qRT -PCR. os resultados mostraram que a expressão destes lncRNAs foi aumentada ou diminuída em tecidos CC, em comparação com tecidos peritumorais emparelhados (Figura 3A) e foram consistentes com os resultados de microarray. lncRNA expressão foi então analisada em células de CC e, células epiteliais normais primárias cervicais, do mesmo modo. Os níveis de TI17313, TI13831, TI10124, e TI18318 foram aumentadas em 3 linhas celulares de cancro (HeLa, SiHa e CaSki) quando comparado com células normais, primárias epiteliais cervicais (Figura 3B). Expressão dos outros 5 lncRNAs estava abaixo do nível de detecção em células de cultura (dados não mostrados). Tendo em conta a expressão ea diferença de lncRNAs candidatos em tecidos e células, foram selecionados TI17313, TI13831, TI10124 e TI18318 para um estudo mais aprofundado.

Nove lncRNAs candidatos foram validadas em 23 CC emparelhados e amostras de tecido peritumoral utilizando qRT -PCR (A). Os níveis de expressão de TI17313, TI13831, TI10124, e em linhas celulares TI18318 CC relativamente aos níveis em células normais, primárias epiteliais cervicais (B) são mostrados. * P 0,05, ** P . 0,01

lncRNA-TI17313 foi associada com EZH2

Para investigar se existe uma interacção física entre os quatro lncRNAs candidatos e EZH2, RIP foi realizada utilizando um anticorpo EZH2 e extractos nucleares de células HeLa e SiHa. Observou-se que apenas TI17313 significativamente enriquecida com o anticorpo EZH2 em comparação com IgG (anticorpo de controlo) (Figura 4A, 4B), e não havia nenhum enriquecimento ofβ-actina e TI13831 (ARN de controlo) (Figura 4C). Além disso, para determinar a localização intracelular do TI17313, nós separados citoplasmática e nuclear RNA de células HeLa por citoplasmática Nuclear RNA Purification Kit (Norgen Biotek, Canadá) de forma eficaz. Em seguida, RT-PCR e idade, mostrou que a transcrição de TI17313 foi localizado principalmente no núcleo das células CC (Figura S1). Estes dados sugerem uma associação entre TI17313 e EZH2; por conseguinte, que denominado como TI17313 lncRNA EZH2 de ligação no cancro do colo do útero (lncRNA-EBIC).

(A, B) RIP experimentos foram realizados em células SiHa e HeLa, utilizando o anticorpo EZH2 (Ab) para imunoprecipitar e específica primers para detectar TI17313, TI13831, TI10124 e TI18318 respectivamente, e enriquecimentos relativos são mostrados. * P 0,05. (C) RIP experimentos foram realizados utilizando o anticorpo EZH2 (Ab) para imunoprecipitar um primer para detectar β-actina e TI13831.

lncRNA-EBIC silenciamentos prejudicada migração celular CC e invasão in vitro

para avaliar os efeitos da lncRNA-EBIC sobre o comportamento celular, linhas celulares CC foram tratados com siRNA para silenciar a sinalização lncRNA-EBIC. níveis lncRNA-EBIC foram significativamente diminuída em células HeLa e SiHa tratadas com ARNsi (Figura 5A). Celular de contagem Kit-8 e ensaios de fluxo de anexina V-FITC citometria análise foram realizadas, e a proliferação celular e a apoptose não estavam obviamente afectados por sub-regulação de lncRNA-EBIC (dados não mostrados). Um ensaio de migração cicatrização de feridas determinou que siRNA mediada lncRNA-EBIC silenciamentos prejudicada migração celular CC

in vitro

(Figura 5B). Um ensaio de invasão Matrigel apresentaram diminuição invasão através de matrigel em células silenciadas lncRNA-EBIC, em comparação com o controle (Figura 5C). Estes dados sugerem que lncRNA-EBIC regula positivamente a migração e a invasão de células CC.

Níveis

lncRNA-EBIC foram significativamente diminuída em células HeLa e SiHa tratados com lncRNA-EBIC siRNA (A). A cicatrização de feridas (B) e ensaios de invasão de Matrigel (C) indicou que a motilidade e invasão de células HeLa e SiHa foram prejudicadas por tratamento com lncRNA-EBIC siARN em comparação com o controlo simulado e negativo. perfis celulares são representativos de 3 expericias independentes. As análises estatísticas são mostrados como painéis da direita, respectivamente. * P . 0,05

lncRNA-EBIC associado com EZH2 reprimiu a expressão de E-caderina

Rompimento de adesão célula-célula e para baixo-regulado E-caderina são os estágios iniciais de invasão tumoral. Evidências crescentes demonstrou que a expressão de E-caderina é reprimido em cancro e expressão reduzida tem sido associada a metástases. Além disso, estudos têm demonstrado que EZH2 poderia mediar silenciamento transcricional de E-caderina por trimethylation de H3 lisina 27 [18], [25]. Assim, nós especulamos que a associação entre lncRNA-EBIC e EZH2 pode, posteriormente, resultar em uma diminuição da expressão de E-caderina para promover a invasão de células CC. Para testá-lo, nós investigamos as mudanças de E-caderina mRNA e os níveis de expressão de proteína em lncRNA-EBIC siRNA transfectadas células HeLa e SiHa. Nós descobrimos que o tratamento lncRNA-EBIC siARN pode aumentar os níveis de expressão de E-caderina em ARNm e proteínas, deixando EZH2 expressão inalterada (Figura 6A, 6B). Em seguida, EZH2 siRNA combinado com lncRNA-EBIC ou NC siRNA foi usado para transfectar células CC, respectivamente, e nós ainda observado que os níveis de expressão da caderina-E foram também aumentadas em ambos os grupos (Figura 6c). A eficácia de EZH2 siRNA é apresentado na Figura S2. Estes dados implícito que lncRNA-EBIC poderia inibir a E-caderina pela associação com EZH2 e lncRNA-EBIC pode atuar como um facilitador no recrutamento de EZH2 para a região do promotor da E-caderina. lncRNA-EBIC EZH2 e podem ser dois componentes interdependentes do processo H3K27me3.

Enquanto isso, a análise de Western blot de EZH2 e E-caderina foram realizados em células tratadas com siRNA CC (A, B, painel da direita). Análise de E-caderina mRNA e proteína níveis foram realizados em células CC tratados com EZH2 siRNA + lncRNA-EBIC siRNA ou EZH2 siRNA + controle negativo. * P . 0,05

Discussão

estudos transcriptoma

Genome-largos mostrou que quase 10 a 20 vezes mais sequência genômica é transcrito para lncRNA do que RNA codificador de proteínas. Encontrar novas moléculas e mecanismos poderiam lançar luz sobre a complexidade dos diversos processos biológicos, incluindo o desenvolvimento celular e doenças humanas [26], [27].

O aumento das evidências nos últimos anos mostraram que a expressão aberrante lncRNA está emergindo como um componente principal do transcriptoma do cancro. No entanto, a contribuição fisiopatológico global de lncRNAs para o início e progressão de CC ainda é em grande parte desconhecido. Recentemente, uma erupção de estudos revela que lncRNAs são importantes cis /trans-reguladores da atividade do gene, o que significa que a maioria dos lncRNAs pode envolver na regulação da expressão gênica [28]. Assim, a co-expressão de rede entre lncRNAs e ARNm é uma abordagem importante para estudar as possíveis funções de lncRNAs. Para explorar o papel da lncRNAs no cancro do colo do útero, foi utilizado pela primeira vez um microarray transcriptoma para avaliar perfis de expressão lncRNA e de mRNA em CC e emparelhado tecidos peritumoral. Microarray combinada com análise de co-expressão do gene revelado um conjunto de lncRNAs e mRNAs expressos diferencialmente.

EZH2, um componente de núcleo de PCR2, é uma enzima fundamental na modificação da histona que desempenha um papel chave na catálise H3K27me3, resultando em silenciamento transcricional de genes alvo [29]. Por exemplo, estudos têm sugerido que a EZH2 pode inibir a expressão de E-caderina através de metilação deste, aumentando assim a capacidade de invasão e metástase de câncer [4], [14]. No entanto, relativamente pouco se sabe sobre como EZH2 é recrutado para alvejar genes [30]. Recentemente, alguns estudos têm indicado que lncRNAs têm a capacidade de recrutar PRC2 para direcionar loci em mamíferos através de EZH2. Por exemplo, HOTAIR pode induzir PRC2 para localizar com os promotores afins, levando ao silenciamento epigenético de genes supressores de metástase em câncer de mama [18]. Para outro exemplo, lncRNA H19 poderia inibir a expressão de E-caderina por repressão da transcrição do promotor através do enriquecimento de EZH2 [17].

No que diz respeito ao CC, alguns estudos anteriores mostraram também que a expressão ao longo de EZH2 é associado com agressividade e progressão maligna de CC [23], [24]. Como nosso microarray mostrou, o nível de expressão foi EZH2 regulados positivamente em tecidos de tumor e apresentado como um nó de cubo com elevado grau central. Assim, optamos EZH2 para a detecção de potenciais lncRNAs envolvidos no CC. De acordo com a análise de co-expressão do gene, determinamos lncRNAs 9 candidatos que firmemente interagiram com EZH2.

Nestes lncRNAs candidatos, descobrimos que os níveis de expressão lncRNA-TI17313 foram significativamente aumentados em tecidos CC e linhas celulares. TI17313 é um 1201bp em RNA não-codificante comprimento transcrito de um pseudogene processado localizado no cromossomo 16q e RP11-144N1.1 codificado (versão Ensembl ENSG00000262904). Como com a maioria dos lncRNAs, TI17313 também mostra menor conservação entre as espécies. A sua sequência única conserva entre os primatas (https://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Location/Compara_Alignments?align = 654 db = Vega g = OTTHUMG00000177355 R = 16% 3A74701404-74702604 T = OTTHUMT00000436401). Além disso, investigou-se a função e mecanismos deste candidato lncRNA. RIP mostrou uma interação física de lncRNA-TI17313 com EZH2; portanto, chamado lncRNA-TI17313 como lncRNA-EBIC. Subsequentemente, os ensaios de perda de fuction mostraram que a diminuição da expressão de lncRNA-EBIC inibiu a migração de células CC e invasão in vitro. Estes estudos sugerem que lncRNA-EBIC pode agir como um oncogene, através cooperando com EZH2. Enquanto isso, a associação de lncRNA-EBIC com EZH2 também forneceu uma dica para o mecanismo de regulação complicada de EZH2.

migração e invasão do tumor são os principais catalisadores de morbidade e mortalidade em pacientes com câncer. E-caderina é um gene supressor de tumor, que desempenha um papel fundamental na progressão maligna de tumores epiteliais e inibe a transição epitelial mesenquimal [31]. CC apresenta frequentemente com a diminuição da expressão de E-caderina e está associada com as oncoproteinas E6 e E7 de HPV [32]. A sobre-expressão de EZH2 tem sido relatado para diminuir o nível de expressão do gene da E-caderina através de H3K27me3 no promotor da E-caderina [4], [14]. Em nosso estudo, descobrimos que a regulação negativa da lncRNA-EBIC poderia aumentar os níveis de E-caderina de expressão. Enquanto isso, diminuindo nível de expressão EZH2 mas deixando lncRNA-EBIC inalterada também pode promover a expressão da caderina-E.

Porque há nenhuma informação explícita sobre o início da transcrição sites /terminais e sequência de comprimento completo de lncRNA-EBIC, nós não estão disponíveis para executar o ganho-de-função de lncRNA-EBIC e estudar o mecanismo potencial em mais detalhe. No entanto, a associação de lncRNA-EBIC com EZH2 sugerido um papel de lncRNA-EBIC no controle da expressão do gene epigenético. Mais importante, nesta pesquisa, que primeiro revelou os lncRNAs differencially expressas em CC. Entre estes candidatos lncRNAs, foi demonstrado que uma sobre-regulada lncRNA em tecidos e células CC foi associada com EZH2, denominado lncRNA-EBIC. lncRNA-EBIC poderia promover células CC invasão pela associação com EZH2 e, posteriormente, reprimindo a expressão da caderina-E, sugerindo que lncRNA-EBIC pode atuar como um facilitador no recrutamento de EZH2 para alvejar genes. Assim, nossos resultados sugerem um papel importante para mecanismos epigenéticos na patogênese da CC cervical. Uma melhor compreensão do papel da lncRNAs na modulação da atividade epigenética irá fornecer mais alvos para a terapia anti-cancerígeno e, portanto, é promissora para o tratamento individualizado de pacientes com câncer cervical.

Informações de Apoio

Figura S1.

Para determinar a localização intracelular de lncRNA-EBIC Citoplasmáticos