Abstract

TH-302 é um pró-fármaco activado por hipoxia conhecida por ativar seletivamente nas condições de hipóxia comumente encontrado em tumores sólidos. Ele está actualmente a ser avaliado em ensaios clínicos, incluindo dois ensaios em Pancreatic Ductal adenocarcinomas (PDAC). O presente estudo foi realizado para avaliar biomarcadores de imagem para a previsão e monitoramento da resposta de TH-302 eficácia em modelos de xenotransplante de PDAC. Dinâmica com contraste (DCE) e difusão ponderada (DW) de ressonância magnética (MRI) foram usadas para monitorar os efeitos agudos sobre a vasculatura do tumor e celularidade, respectivamente. Três PDAC xenoenxertos humanos com respostas diferenciais conhecidas para TH-302 foram fotografadas antes, e, decorridas 24 horas e 48 horas após uma única dose de TH-302 ou veículo para determinar se as mudanças de imagem presaged alterações nos volumes dos tumores. DW-MRI foi realizada em cinco valores de b para gerar coeficiente de difusão aparente de água (ADC) mapas. Para DCE-MRI, um reagente de contraste clinicamente disponível padrão, o Gd-DTPA, foi usada para determinar o fluxo sanguíneo para a região do tumor de interesse. TH-302 induziu uma diminuição dramática na constante de transferência DCE (K

trans) dentro de 48 horas após o tratamento nos tumores sensíveis, Hs766T e Mia PaCa-2, ao passo que TH-302 não teve qualquer efeito sobre o comportamento de perfusão de SU resistente .86.86 tumores. celularidade do tumor, calculado a partir do ADC, foi aumentada significativamente 24 e 48 horas após o tratamento em Hs766T, mas não foi observada nos grupos Mia PaCa-2 e SU.86.86. Notavelmente, a inibição do crescimento de Hs766T foi observada imediatamente (3 dias) após o início do tratamento, mas não foi observada em MiaPaCa-2 tumores até 8 dias após o início do tratamento. Com base nestes resultados pré-clínicos, medidas DCE-MRI de vascular dinâmica de perfusão e medidas ADC de densidade celular são sugeridos como potenciais TH-302 biomarcadores de resposta em ensaios clínicos

Citation:. Zhang X, Wojtkowiak JW, Martinez GV, Cornnell HH, Hart CP, Baker AF, et al. (2016) RM Biomarkers para monitorar a resposta antecipada à hipóxia-Activated Pr�f�maco TH-302 em Pancreatic Cancer xenoenxertos. PLoS ONE 11 (5): e0155289. doi: 10.1371 /journal.pone.0155289

Edição: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, BRASIL

Recebido: 11 de junho de 2014; Aceito: 27 de abril de 2016; Publicado em: 26 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel, e seus arquivos de suporte de informação estão disponíveis através Figshare (https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.3179140)

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por: US Institutos nacionais de Saúde: R01CA125627, R01CA077575 e U54CA143970; www.nih.gov; o financiamento acima foi utilizado no desenho do estudo, recolha e análise de dados; Moffitt Cancer Center de Pequenos Animais imagem Laboratory, um CCSG financiado instalação do núcleo, CCSG Grant número: P30-CA76292; www.moffitt.org; o financiamento acima foi usado para uma parte da imagem de pequenos animais. Pharmaceuticals limiar forneceu apoio sob a forma de um salário para CPH autor, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses.: Charles P. Hart é empregado por e acionista da Pharmaceuticals Threshold. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

A taxa de sobrevivência de cinco anos para pancreático adenocarcinoma (PDAC) é inferior a 6% e a maioria dos sobreviventes são aqueles pacientes com uma opção cirúrgica. [1-5] Assim, a maioria dos cancros pancreáticos são tratados sistemicamente com quimioterapia, geralmente gemcitabina (GEM), em combinação com outros agentes. Notavelmente, terapias e produtos biológicos, tais como cetuximab, trastuzamab ou bevacizumab específicas dirigidas mostraram pouco efeito contra PDAC. Um regime de combinação de 5-fluorouracil, leucovorina, irinotecano e oxaliplatin (folfirinox) aumentou a sobrevida global (SG) mediana de 11,1 meses, em comparação com 6,8 meses para sozinho GEM [6] Recentemente, nab-paclitaxel (ABI-007;. Nanopartícula-albumina paclitaxel; Abraxane) mostrou benefício significativo de sobrevivência em combinação com GEM, e está sendo considerado para o status da linha de frente [7, 8] Mesmo assim, a resposta continua a ser apenas passageiro e, por isso, são necessárias abordagens terapêuticas alternativas.. Um caminho promissor é alvo fenótipo do câncer, tais como hipóxia, que é frequentemente observada em cancros pancreáticos [9] Esta foi investigado na Fase I /II (NCT01833546; NCT02047500). Ensaios de TH-302 em combinação com o GEM, que são um ensaio de Fase III (NCT01746979) do gibão TH-302 + GEM completa e está em andamento. Além disso, um estudo de Fase I /julgamento escalonamento de dose II de TH-302 + GEM + Abraxane combinação tripleto foi recentemente inaugurado (NCT02047500).

hipóxia do tumor, caracterizada por concentrações de oxigénio reduzidos, é um fator significativo condução fisiologia tumor e resistência ao tratamento do cancro. [10] a principal diferença a partir de tecido normal é a matriz estruturada vasculatura irregular encontradas em tumores sólidos. A microvasculatura é caracterizado por grandes aberturas no endotélio e na ausência da camada de músculo liso, o que leva a aumento da permeabilidade e retenção (EPR) de macromoléculas. Esses fatores resultam em uma fonte desequilibrada de oxigênio e nutrientes. Isto agrava a germinação e crescimento ineficiente de novos vasos, o que leva a uma oxigenação de tumor reduzida. [11, 12] Embora vários tipos de cancro são conhecidos por serem hipóxica, os cancros pancreáticos são conhecidos por serem profundamente assim [13] e hipóxia intratumoral está relacionada com um mau resultado. [14-16] Isto pode ser devido ao aumento dos níveis do factor de sobrevivência, HIF-1α [15-18], ou selecção de defeitos na maquinaria apoptótica. [17] por outro lado, o efeito de hipóxia pode não ser exclusivamente mediada pelas células cancerosas, mas também podem envolver o estroma. cancro do pâncreas é caracterizada por fibroblastos excessivos desmoplásicos (células estreladas), cuja migração, colagénio do tipo I de expressão, e a produção do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) são todos induzida por hipoxia. [18] Fundamentalmente, hipoxia resulta de um desequilíbrio entre o fornecimento de oxigénio e exigem. regiões de tumor hipóxicas são geralmente resistentes à quimioterapia citotóxica. Em parte, isso é devido aos efeitos diretos de hipóxia em upregulating percursos de sobrevivência celular, mas também pode ser devido a déficits de perfusão regionais, que resultam em ambos hipóxia e entrega da droga sub-terapêutica. [14-16, 19, 20] Para além disso, as células tumorais hipóxicas tendem a ser quiescente, o que também conduz a resistência a terapias que estão orientadas para a divisão celular. [21] Devido à relação entre a hipóxia e fraca resposta, uma solução de hipoxia cancro -relacionados está introduzindo pró-fármacos activados por hipoxia (HAPs), que são selectivamente activados sob extrema hipoxia e entregam doses elevadas de quimioterapia nas regiões hipóxicas do tumor com o mínimo de danos no tecido saudável.

a preponderância de hipoxia em PDAC torna um alvo atraente para HAPs [22], que foram desenvolvidos como uma família de compostos ao longo das últimas duas décadas. [23] HAPs são convertidos para uma forma activa em condições de oxigénio reduzido, visto que são concebidos para ser submetido a um -e

– ou 2-e

– bio-reduções que são reversíveis na presença de oxigênio. Estes podem ser não-especificamente catalisada por uma variedade de oxoreductases, tais como a redutase de NADPH citocromo P450, POR, ou óxido nítrico sintase indutível, iNOS. [24] A classe mais comum de HAPs baseia-se em 2-nitroimidazoles, exemplificado por TH 302. TH-302 é um HAP de segunda geração que está actualmente a ser testado em 12 diferentes estudos clínicos da Fase I-Fase III. TH-302 lançamentos bromo-isofosforamida de mostarda (Br-IPM) sob condições de hipóxia, induzindo alquilação DNA e cross-linking. Br-IPM também pode difundir para regiões vizinhas oxigenados para impedir a progressão do tumor através de “Efeito Espectador”. Tanto in vitro e in vivo demonstraram que a TH-302 é selectivamente activado em regiões hipóxicas de tumores e também está presente no tecido circundante, mas menos nos tecidos saudáveis ​​[25]. Estudos pré-clínicos sugerem que a TH-302 tem efeito anti-câncer significativa quando combinada com terapias anti-angiogénicos. [26]

regiões

hipóxicos são frequentemente caracterizadas por navios altamente desorganizados, dilatadas e tortuosas. [27] Este padrão caótico pode resultar de desequilíbrios de mediadores angiogénicos tais como factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e angiopoietinas. vasos tumorais altamente permeável pode afectar citocinas e factores angiogénicos, que pode dinamicamente alterar a estrutura das paredes microvasos. [28] As evidências acumuladas já demonstrado que a permeabilidade vascular é provavelmente elevada em regiões hipóxicas. [27] Assim, de prova e concordância empírica entre a permeabilidade dos vasos e hipóxia é estabelecida. DCE-MRI utiliza modelagem cinética dos reagentes de contraste injectados para caracterizar perfusão. [29] Pode-se obter informações sobre o fluxo, o volume, e o mais importante a permeabilidade dos vasos. Assim, é adequado para assumir que o DCE-MRI pode ser um substituto útil biomarcador de hipóxia. [30]

DIFUSÃO (DW-MRI) detecta alterações relativamente pequenas na estrutura de tecido a nível celular baseada na a aplicação de gradientes sensíveis de movimento que pode rastrear o movimento de prótons de água. Muitos estudos pré-clínicos têm demonstrado que a DW-MRI tem um tremendo potencial para monitorar alterações precoces na celularidade tumor que podem estar relacionados com a resposta ao tratamento. [31] Combinação de DCE e DW-MRI pode fornecer informações mais precisas para o diagnóstico precoce e detecção de resposta terapêutica precoce . [32] Além disso, estes dois métodos de imagem são facilmente implantado em protocolos clínicos diários. Como tal, é muito provável que os resultados deste estudo podem ser facilmente convertidos para ensaios clínicos adicionais.

Estudos anteriores demonstraram tumores de xenoenxerto derivados de células de câncer pancreático humano SU.86.86 são altamente vascularizado e bem- perfundidos em comparação com os tumores derivados da linha de células Hs766T. [33] Assim, regiões de hipoxia em tumores observados Hs766T são maiores do que os observados em SU.86.86, enquanto que os tumores derivados de Mia linha celular PaCa-2 são hipóxico para um nível médio. Como hipoxia é considerado ser um factor limitante para TH-302 actividade, tem sido experimentalmente demonstrado que os tumores Hs766T-derivados são altamente sensíveis a TH-302 e que os tumores derivados de SU.86.86 são altamente resistentes, com Mia PaCa-2 exibem . sensibilidade intermediária [34] o presente estudo comparou a eficácia da TH-302 nestes modelos de xenotransplante de cancro do pâncreas com medições de perfusão do tumor e celularidade usando dois métodos de imagem:. DW-MRI e DCE-MRI

Materiais e Métodos

cultura celular

células Su.86.86, Hs766T e Mia-PaCa2 foram adquiridas de ATCC (Manassas, VA). Todas as linhas de células foram ressuscitados de baixa passagem com todas as experiências realizadas com células de número de passagem inferior a 15. Su.86.86 células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Life Technologies) suplementado com 10% de FBS (Hyclone Laboratories). linhas celulares Hs766T e Mia-PaCa2 foram cultivadas em DMEM /F12 (Life Technologies) suplementado com 10% FBS e solução de penicilina /estreptomicina 1% (Sigma, St. Louis, MO). Todas as linhas de células foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2.

xenoenxertos

Todos os procedimentos estavam em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso of Laboratory Animal Resources (1996 ), Conselho Nacional de Pesquisa e aprovado pelo Institutional animal Care e do Comitê Use, University of South Florida sob o protocolo aprovado R4033. ratinhos imunocomprometidos foram alojados em uma instalação limpa com condições especiais que incluem HEPA filtrada sistemas de gaiolas ventiladas, roupas de cama autoclavado, habitação autoclavado, água esterilizada, irradiado comida e procedimentos especiais mudando gaiola. Os ratos foram tratados sob condições assépticas, incluindo o uso de luvas, batas e revestimentos de sapato. Os ratinhos foram sacrificados por inalação de CO

2 a partir de um tanque pressurizado numa câmara de ratinho.

ratinhos SCID fêmea de 5-6 semanas de idade foram inoculados com SU.86.86, Hs766T células ou Mia-PaCa2 (5×10

6) por via subcutânea na pata traseira esquerda. Os tumores foram deixados crescer para uma média de três semanas a um tamanho médio de cerca de 150 mm

3, tal como estimado utilizando calibradores electrónicos e os volumes tumorais calculados como π /6 [(eixo curto em mm)

2 x ( eixo longo em mm)]. Os ratinhos foram, em seguida, ao acaso e colocados em grupos e tratados com soro fisiológico (controlo) ou TH-302 (50 mg /kg) por via intraperitoneal. Os ratinhos foram fotografadas tal como descrito na secção de métodos de imagiologia de ressonância magnética. Um total de 34 ratos foram submetidos a estudos de imagem de RM. O grupo consistiu de 5 SU.86.86 TH-302 tratadas e 5 animais de controlo; Mia-PaCa2 consistiu de 6 animais tratados e 5 de controlo-302 TH; Hs766T consistiu de 7 TH-302 e tratados 6 animais de controlo. Sem perda de peso dos animais significativa foi observada durante este estudo. Os animais foram sacrificados quando os tumores atingiram 2.000 milímetros

3.

Imagem

Ambos DCE-MRI e DW-MRI foram realizadas 24 horas antes da (302 TH-ou veículo) de tratamento, DW-MRI foi agendada 24 horas e 48 horas após o tratamento. A fim de assegurar um tempo adequado para lavagem de agente de contraste e recuperação fisiológica, DCE-MRI foi realizada apenas 48 horas após o tratamento. Todas as experiências de MRI foram realizadas com um scanner de IRM Varian T 7 equipado com uma amplitude máxima de gradiente de 400 mT /m. Todos os animais foram anestesiados com isoflurano inalado (1,5% em O2) a 2,0 LPM e canulados na veia da cauda. Um balão de pressão, transdutor gravado no peito do animal foi utilizado para monitorar continuamente a sua taxa de respiração. As temperaturas corporais foram monitorizados continuamente usando um termômetro Fluoróptica rectal (® SAII

, SA Instruments, Stony Brook, Nova Iorque). Um aquecedor externo foi utilizado para manter a temperatura corporal a 37,0 ± 0,2 ° C e a frequência respiratória foi monitorizado a uma gama de 60-90 respirações pré minutos durante o decurso das experiências de imagiologia. O animal foi suavemente fixada num suporte de plástico e carregada para um 35-mm de ID de pequenos animais imagiologia Litz bobina (Doty Scientific, Columbia, SC, EUA). sessão de ressonância magnética tanto para digitalização DCE- e DW-MRI foi aproximados 1,5 horas; 0,5 horas para DW-MRI única seção.

protocolo DCE-MRI inclui t

2-ponderados imagens para visualização anatômica do tumor, mapas paramétricos de T endógena

1 tempo de relaxamento e uma série de T imagens

1-weighted que traçam a mudança dinâmica de agente de contraste incluindo FIA e lave-in e Check-out dentro de local do tumor. imagens T

2 ponderadas foram adquiridas usando uma sequência de impulsos spin echo rápido (FSE) com um fator de eco de 4, dando uma TE efetiva de 72 ms. método de recuperação de saturação para T

1 mapeamento com cinco tempo de recuperação diferentes valores (TR) foi adquirida antes da injecção do agente de contraste (TR = 5000, 2000, 800, 300, 150 ms, TE = 7.2 ms, FOV = 35 x 70 mm, matriz = 128 x 256, resolução espacial = 273 x 273 mm). Nove cortes coronais de 1 mm de espessura foram orientados sobre o tumor e artéria para garantir uma função de entrada arterial válido (AIF). O animal foi bem preso com fita adesiva para evitar artefatos de movimento. Antes, durante e após a administração de bolus de uma dose única de CA (0,15 mmol /kg de Gd-DTPA), uma série dinâmica de spin echo imagens t

1-ponderados (TR = 150 ms, TE = 7,2 ms) foram adquiridos para 35 minutos. dados DCE-MRI foi processado usando um modelo cinético geral, como descrito por Tofts et al. Uma descrição completa destes métodos tem sido descrito anteriormente. [29, 35]

DW-MRI foi realizada para medir os valores de ADC quantitativos com a mesma geometria como DCE-MRI. parâmetros de sequência incluem cinco b-valores: 12, 50, 500, 800, 1500 s /mm

2 com TR = 1500 ms e TE = 35; Seis média foram usadas para reduzir os artefatos de movimento. mapas ADC foram geradas por um programa Matlab caseiro que se encaixa-b valores com a equação Stejskal-Tanner, S = S

0 * EXP (-b * ADC), onde S

0 representa a amplitude do sinal, sem ponderação difusão e S é a amplitude do sinal com a ponderação de difusão.

as regiões de interesse (ROI) foram determinadas por T

2W imagens com exatamente mesma geometria de DCE- e DW-MRI aquisição. Estas ROIs foram sobrepostos dados DCE- e DW-MRI para minimizar a variação do fator antrópico. histogramas de distribuição foram obtidos para cada ROIs tumorais de DCE- ou DW-MRI. Os dados são apresentados como a média e o erro padrão. testes t de Student, ANOVA foram usados ​​quando apropriado. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

A imuno-histoquímica

Após a conclusão de protocolos de imagem de ressonância magnética e terapêuticos, cloridrato pimonidazole. (60 mg /kg; Hypoxyprobe Inc.) foram injectados I.P. uma hora antes da remoção do tumor, posteriormente fixadas em 10% de formalina, embebidos em parafina, e adicionalmente processados ​​para imuno-histoquímica. secções de tumor foram manchadas com um anticorpo primário de coelho contra gamma-H2AX (Novus Biologicals, Littleton, CO) e o anticorpo secundário anti-coelho Ventana OmniMap (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). de tecido positivo Pimonidazole foi detectada utilizando anti-soros de coelho contra cloridrato pimonidazole (2627; Hypoxyprobe Inc.). O sistema de detecção utilizado foi o Ventana ChromoMap Kit. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina eosina e digitalizados utilizando o Aperio ScanScope XT.

Resultados

Os parâmetros cinéticos de DCE-MRI para quantificar a perfusão do tumor foram estimados em uma base de pixel-wise pela aplicação do modelo Tofts como descrito em [ ,,,0],35]. Representativos K

mapas trans para cada tipo de tumor são mostrados na figura 1. ROIs tumorais (regiões de interesse) foram identificados com T imagens

2-ponderados em todas as fatias, e usado para delinear pixels para as análises de histograma. Como mostrado pelos histogramas, o K

trans gerados a partir Hs766T representativa e Mia-PaCa-2 tumores diminuíram drasticamente 48 h após o tratamento TH-302, em comparação com os valores pré-tratamento. Não houve mudanças significativas observadas por tumores SU.86.86 no mesmo ponto do tempo (FIG 1). Embora um indivíduo no grupo SU.86.86 apresentaram uma redução significativa após o tratamento TH-302 (48 h), as alterações médias entre os grupos de comparação não foram estatisticamente significativas. Tempo pratos de K

trans valores médios normalizados são mostrados na Figura 2 (a). Os valores médios de normalizada K

trans diminuiu de 69,2% para ratinhos tratados-TH-302, em tumores Hs766T, diminuiu para 46,1% Mia PaCa-2 tumores e aumentou 4,9% em SU.86.86 tumores. Ambas as mudanças para Hs766T e Mia PaCa-2 grupos de tratamento foram estatisticamente significativas (

P Art 0,01) quando comparado com o seu próprio grupo de controle. Em contraste, o aumento de valor médio para o grupo SU.86.86 não foi estatisticamente significativo (

P

= 0,15). Essas mudanças na perfusão vascular correlacionadas com cada resposta terapêutica linhas de células de TH-302 [36].

Como demonstrado no histograma, K

trans gerada a partir Hs766T e Mia-PaCa-2 tumores foram drasticamente diminuída 48 horas após o tratamento TH-302, em comparação com os valores pré-tratamento. Não houve mudanças significativas observadas para um rato SU.86.86 no mesmo ponto do tempo.

A) Tempo-cursos de K

valores trans médios normalizados. Os valores médios de normalizada K

trans diminuiu 69% para TH-302 em ratinhos tratados tumores Hs766T, diminuiu de 46% para Mia PaCa-2 tumores e aumentou 5% em SU.86.86 tumores. B) As alterações nos valores de ADC tumor médios normalizados ao longo do tempo. Um aumento substancial no ADCs médios relativos foi observada para o grupo tratado TH-302 na pós-24 e de 48 horas (29%, aumentando para 24 h, P 0,01; 17% aumentando para 48 h, P 0,01). MIA PaCa-2 não é diferente estatisticamente significativa entre os grupos realizados (8% aumentando para 24 h,

P

0,05; 4%, aumentando para 48 h, P 0,05). Para SU.86.86, nenhuma alteração significativa foi detectada por DW-MRI tanto para grupo de controlo e TH-302 (3% decrescente, durante 24 h, P 0,05; 0,5% de aumento, durante 48 h, P 0,05). A normalização foi calculado pela média da diferença de tratamento pré- e pós em Th302 grupo em relação a média da diferença de tratamento pré- e pós no grupo de controlo. As barras de erro representam o desvio padrão.

DW-MRI foi usado para quantificar a celularidade, e também foi usado para detectar a resposta de todos os três xenoenxertos tumorais para TH-302. Seis médias de DW-aquisições foram utilizados neste estudo para reduzir o potencial para o artefacto de movimento. mapas ADC de animais representativos em diferentes pontos de tempo de pós-tratamento pré- e são mostrados na FIG 3. Tal como acontece com os dados do DCE, imagens T2 foram utilizadas para delinear ROI do tumor, e os pixels circunscritas, em seguida, utilizado para gerar histogramas. As alterações nos valores médios normalizados ADC do tumor ao longo do tempo são apresentados na Figura 2 (b). Um aumento substancial na ADCs médios relativos foi observado para os TH-302 tumores Hs766T tratados às 24 h e 48 h pós-terapia (aumento de 29% por 24h, p 0,01; aumento de 17% para 48h, p 0,01). Para SU.86.86, não houve mudanças significativas foram detectadas por DW-MRI para ambos os grupos de controle TH-302 e (3% de redução por 24h, p 0,05; aumento de 0,5% por 48h, p 0,05). Apesar de parecer que houve um aumento no ADC de MiaPaCa-2 às 24 h comparado com o subgrupo de veículo (8%, P 0,05), estas alterações não foram estatisticamente significativamente diferentes dos controlos de veículo

Um dramaticamente. aumento ADCs observados em Hs766T, mas não nos outros dois tipos de tumor.

mudanças estatisticamente significativas na K

trans foram observadas em Hs766T e Mia Paca-22 tumores tratados com TH-302 para 48 h pós-tratamento, tal como determinado por DCE-MRI. K

trans permaneceu inalterada em SU.86.86 tumores (figura 1). O efector activa de TH-302 é um agente de ligação cruzada de ADN anteriormente demonstrado que o aumento nuclear γ-H2AX, um biomarcador chave para vias de resposta a danos no ADN, in vivo após tão pouco quanto 6 horas de terapia 302 TH-posto em modelos tumorais pancreáticas [ ,,,0],37], o que implica primeiras alterações na permeabilidade vascular observados neste estudo pode ser uma consequência de TH-302 citotoxicidade. Para desenhar uma relação entre alterações da permeabilidade e atividade TH-302, seções transversais de tumores de todos os três grupos de tumor foram avaliadas por imunohistoquímica para a expressão H2AX γ (Fig 4A). -H2AX Γ nuclear foi aumentada em TH-302 tratadas Hs766T e Mia PaCa-2 tumores quando comparados com o controlo de solução salina. Não se observou qualquer alteração detectável na coloração γ-H2AX entre Su.86.86-tratados e os tumores tratados com solução salina. O principal determinante da ativação e eficácia TH-302 é hipoxia tumor. detecção imunohistoquímica da Pimonidazole, um marcador de hipóxia físico, mostrou maior coloração em TH-302 Hs776t sensível e Mia PaCa-2 tumores em comparação com TH-302 tumores SU.86.86 resistentes (Fig 4B) que suportam padrões de expressão γ-H2AX seguinte TH-302 tratamento. Estes dados suportam alterações precoces na Hs766T e Mia PaCa-2 perfusão do tumor em 48 horas poderia ser devido aos efeitos citotóxicos de TH-302.

(A) coloração histológica da γ-H2AX, um marcador de DNA mecanismos de resposta danos, em tumores PDAC pré e pós-48hr TH-302 de tratamento (50 mg /kg). Expressão de -H2AX γ foi aumentada em TH-302 tratados Hs766T e Mia PaCa-2 tumores quando comparados com controlo de solução salina. Não se observou qualquer alteração detectável na coloração γ-H2AX entre Su.86.86 tratada e tumores salinos. (B) coloração Pimonidazole como biomarcador de hipoxia tumoral física. Pimonidazole Cloridrato foi injetado 2 horas antes da remoção do tumor. A extensão da hipóxia foi maior em tumores Hs766T e menos em SU.86.86 com Mia PaCa-2 tumores moderadamente hipóxico. Estas imagens são imagens representativas de cada tipo de tumor. Barras de escala = 200? M.

Discussão

A eficácia da TH-302 é influenciada por vários fatores, como a desobstrução de vaso e do nível de hipóxia em uma determinada região. [38] Ter a capacidade de medir as mudanças nestes parâmetros ao longo do tempo em resposta a activado TH-302, é crítica. Tais alterações podem ser usadas para avaliar a resposta terapêutica. métodos invasivos não formação de imagens actual ou são limitados à utilização in vitro, enquanto biomarcadores imagem pode dar medições quantitativas de progressão tumoral ou regressão, sem alterar significativamente o microambiente. As duas modalidades de ressonância magnética utilizadas neste estudo, o DCE-MRI e DW-MRI, pode satisfazer tanto separadamente estes requisitos, com base em mapas paramétricos observáveis, que fornecem informações sobre a vasculatura e celularidade, respectivamente. Além disso, a maioria dos tumores são conhecidos por ser heterogénea, e especialmente no cancro pancreático. Por conseguinte, é de grande interesse que informação espacial pode ser quantitativamente avaliado numa base de pixel-a-pixel. [39] hipoxia tumor é o indicador mais forte de resposta do tumor a HAPs e pode ser medido em pacientes utilizando imagiologia de PET de 18F-rotulados 2 traçadores -nitroimidazole (F-miso, FAZA, HX4). No entanto, a imagem latente hipóxia PET ainda é experimental. Em contrapartida, as medidas de RM de incompatibilidade de perfusão-difusão pode ser quantitativamente relacionada à hipóxia. [24]

Este estudo foi focado em identificar e comparar biomarcadores de imagem de RM para a detecção de resposta precoce à TH-302 terapia sensíveis e resistentes PDAC modelos de tumor. Trabalhos anteriores de nosso grupo mostraram que MiaPaCa-2 tumores respondeu a TH-302 com uma leve, mas significativa, diminuição da K

trans, sem efeito na ADC [30]. Esses resultados foram confirmados aqui. Os resultados do DCE-MRI mostrou uma diminuição clara do K

trans em ambos os PaCa-2 modelos Hs766T e Mia, que são significativamente mais hipóxico, em comparação com SU.86.86 tumores, que não responderam à TH-302 com uma mudança na volume ou uma mudança na K

trans. Consistente com o trabalho anterior, Hs766T foi confirmada por imuno-histoquímica pimonidazole (Fig 4) ter a maior fracção hipóxica entre esses três modelos; Mia PaCa-2 era intermediariamente hipóxica e SU.86.86 tem hipoxia mínima em comparação com os outros dois. [40] Assim, a redução da permeabilidade pode ser a consequência de activação TH-302 sob as condições de baixa de oxigénio, resultando em inibição da sinalização de VEGF. Isto é o oposto como visto em tecidos tumorais não hipóxicas. O grau de alterações de permeabilidade pode ser directamente relacionada com o grau da região de hipoxia. Este resultado corrobora os resultados anteriores que indicam que TH-302 é mais eficaz em tumores hipóxicos [36]

Os dois métodos de imagem MR utilizados neste estudo são fundamentalmente diferentes:. Parâmetros cinéticos avaliados do DCE-MRI avaliar as mudanças vasculatura, enquanto valores de ADC montados por DW-MRI refletem mudanças de densidade celular. O DCE-MRI reflete a permeabilidade (ou fluxo) alterações que podem resultar de efeitos citotóxicos sobre as células tumorais hipóxicas e produção VEGF reduzido pela ativação de TH-302, enquanto DW-MRI é uma medida indireta das consequências celulares que presumivelmente ocorrer após a mudança vasculatura. [30] o interessante, observou-se que a mudança ADC foi significativo apenas nos tumores mais sensíveis Hs766T, mas não nos outros dois modelos. A ausência de mudança de ADC em SU.86.86 é consistente com a falta de efeito de TH-302 no crescimento do tumor, e a relativa falta de hipoxia neste modelo. Curiosamente, Mia PaCa-2 também não mostraram uma resposta de difusão para TH-302, apesar do facto de que o crescimento tumoral foi inibido. Isto foi consistente com observações anteriores que utilizam esta linha tumoral. [30] Em particular, o efeito da terapia de TH-302 no crescimento do tumor MiaPaCa-2 não foi aparente até 8 dias de tratamento, ao passo que o efeito sobre Hs766T foi imediata. Assim, a alteração no ADC pode ser capaz de prenunciam alterações de volume do tumor que ocorrem um ou dois dias mais tarde, mas não altera 6 dias mais tarde.

A selecção de uma função de entrada arterial (FIA) afecta directamente os parâmetros cinéticos gerado pelo modelo Tofts. Fatores para a estimativa FIA pode induzir a erros, incluindo os efeitos de volume parcial, de baixa resolução temporal e espacial, baixo contraste-ruído (CNR) e em muitos casos DCE-MRI, uma má escolha de artérias principais no campo de visão e movimento artefatos. Neste estudo, a medição directa do sangue arterial foi um desafio, dado o movimento respiratório durante a aquisição MR. Embora artefactos de movimento e de baixa SNR pode ser reduzido por aplicação de uma função spline-ajuste temporal e um núcleo gaussiano espacial para alisar os dados de análises de pixel de sábio, a selecção de FIA ​​ROI desempenha um grande papel para os resultados finais, como discutido em [ ,,,0],35]. Este tem sido o problema mais comum que afeta a reprodutibilidade de DCE-MRI, assim, grande bar de erro foi observado nos resultados DCE-MRI. Apesar destas limitações, DCE-MRI foi capaz de discernir diferenças no TH-302 resposta, entre os três tipos de tumor, de uma forma que é consistente com os achados histológicos.

Tumor vasculatura está sempre mudando, em parte em resposta à alta concentrações de VEGF de tumores que causam aberrante neo-vascularização [41] e do stress em fase sólida, resultando em compressão da vasculatura frágil [42], sendo que ambos contribuem para a redução do fluxo sanguíneo. Neste estudo, nós medimos alterações precoces na perfusão do tumor após o tratamento TH-302. Para eliminar a possibilidade de alterações na perfusão do tumor seguinte TH-302 são um resultado da natureza dinâmica normal da vasculatura do tumor, secções transversais de tumores foram coradas histologicamente para -H2AX γ nuclear, uma proteína envolvida em vias de resposta ao ADN Danos [43], uma medida de TH-302 citotoxicidade. Como esperado, TH-302 tumores sensíveis, Hs766T e Mia PaCa-2, apresentado com maior -H2AX γ nuclear em comparação com tumores de controlo. Nenhuma mudança significativa na perfusão do tumor ou γ -H2AX nuclear foi observada em tumores SU.86.86, TH-302 resistentes. Estas mudanças de suporte de dados na perfusão do tumor conforme medido pelo DCE-MRI pode ser utilizado como um biomarcador de resposta precoce por tratamento TH-302.

Em conclusão, os nossos estudos sugerem que as alterações na perfusão do tumor medidos por DCE-MRI pode ter potencial como um biomarcador precoce de TH-302 farmacodinâmica e que DW MRI é um potencial biomarcador para uma eventual resposta do volume tumoral.