Abstract

caquexia O cancro é uma síndrome paraneoplásica que provoca profunda perda de peso e atrofia da massa muscular e é estimada em a causa de até 30% das mortes por cancro. Embora a causa exata é desconhecida, pacientes com caquexia de câncer têm aumento do catabolismo protéico muscular. Em muscular saudável, lesão ativa as células-tronco musculares esqueléticas, chamados de células satélites, para diferenciar e promover a regeneração. Aqui, nós fornecemos evidências de que este mecanismo é inibida em caquexia associada ao câncer devido à expressão persistente de CCAAT /Enhancer Binding Protein beta (C /EBP) em mioblastos de músculo. C /EBP p é um factor de transcrição que BZIP é expresso em células satélites do músculo e é normalmente regulada negativamente na diferenciação. No entanto, em mioblastos expostas a um meio caquéticos, expressão de C /EBP p permanece elevada, apesar de activação para diferenciar, resultando na inibição da expressão de miogenina e miogénese.

In vivo

, caquexia do cancro resulta em aumento do número de células Pax7 + que também expressam C /EBP e a inibição dos mecanismos de reparação normais. Perda de expressão C /EBP em mioblastos primários resgata a diferenciação em condições caquéticos sem restaurar o tamanho miotubos, indicando que C /EBP é um inibidor importante da myogenesis em caquexia associada ao câncer

Citation:. Marchildon F, Lamarche E, lala- Tabbert N, St-Louis C, Wiper-Bergeron N (2015) Expressão de CCAAT /Enhancer Binding Protein Beta em células satélites musculares Inibe miogênese em Câncer a caquexia. PLoS ONE 10 (12): e0145583. doi: 10.1371 /journal.pone.0145583

editor: Atsushi Asakura, da Universidade de Minnesota Medical School, United States |

Recebido: 14 de setembro de 2015; Aceito: 04 de dezembro de 2015; Publicação: 28 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Marchildon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações para NWB dos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde (https://www.cihr-irsc.gc.ca) eo Cancer Research Society (https://www.crs-src.ca/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam não há interesses concorrentes

Introdução

a caquexia faz com que a perda de peso profunda e atrofia da massa muscular, e ocorre concomitantemente com várias doenças, incluindo sépsis, a SIDA, a toxicodependência, e câncer [1, 2]. Embora muitas vezes associada com a anorexia, a perda de peso e catabolismo da proteína muscular observada em pacientes caquéticos, não pode ser revertida pela suplementação nutricional e, portanto, não pode ser atribuída à fraca ingestão nutricional sozinho [3]. Até 80% dos pacientes com câncer terão caquexia em estágios avançados da sua doença [4-6], e isso se correlaciona com fragilidade, aumento da morbidade e resultados pobres. Além disso, aproximadamente 30% das mortes por cancro são atribuídos a caquexia em vez de carga de tumor, fazendo caquexia do cancro uma importante causa de mortalidade na América do Norte [1]. Como tal, a criação de tratamento e estratégias de prevenção é de extrema importância como a caquexia é inversamente correlacionada com o sucesso dos tratamentos anti-câncer e à sobrevida do paciente [3, 7-9]. A causa de caquexia do cancro é visto como resultado de uma combinação de digestivo (disfagia e disgeusia), humoral (inflamação sistémica), endócrino e os factores derivados do tumor [10-13]. Ambos os doentes com cancro e caquexia modelos animais de caquexia citocina pró-inflamatória tem elevado (por exemplo, TNFa, IL-1, IL-6) expressão na corrente sanguínea, o que sugere que estes factores desempenham um papel no desenvolvimento de caquexia [14-18].

Num indivíduo saudável, homeostase da massa muscular é conseguida equilibrando o catabolismo da proteína muscular com a síntese de proteínas. atrofia do músculo esquelético, como pode ser visto na caquexia do cancro, é mediada, pelo menos em parte, pela regulação positiva de ATP-dependente ubiquitina ligases E3 (MuRF, MAFbx /atrogina-1), que estimulam a degradação de proteínas estruturais musculares pelo proteassoma 26S e inibem directamente a maquinaria translacional [19, 20]. citocinas pró-caquéticos estimular a expressão destas ligases e, assim, promover o volume de negócios aumentou de proteína muscular [18, 21-23].

células satélite são a principal fonte de capacidade de regeneração de músculos esqueléticos e são encontrados entre o sarcolema e a membrana basal das fibras musculares diferenciadas [24]. Estas células podem ser activadas para ambos proliferarem e se diferenciarem em resposta a estímulos externos, o mais importante lesão muscular e exercício [25]. células satélites são definidos pela sua expressão de CD34

+ e Pax7, entre outros [26, 27]. Como as células satélites diferenciar, eles perdem progressivamente expressão de Pax7 e expressar de forma coordenada a bHLH miogênica fatores MyoD, miogenina e MRF-4, que são responsáveis ​​pela indução de genes específicos de miócitos [28]. Em condições que provocam perda muscular, há uma redução de expressão de MyoD tal que, além de hipercatabolismo, diminuiu a regeneração tem sido implicado na patogénese da caquexia, que liga a inibição da expressão de MyoD e reduzida capacidade de diferenciação para o desenvolvimento da caquexia

In vivo

[29-31].

CCAAT /enhancer Binding Protein beta (C /EBP p) é um factor de transcrição bZIP envolvido em muitos processos de regulação e diferenciação tanto como um activador e de um repressor. Por exemplo, é necessária para a regeneração do fígado, actua como um factor de compromisso potente para a diferenciação de adipócitos, e regula a resposta de fase aguda do sistema imune [32-36]. Além disso, temos mostrado que C /EBP é também um importante regulador do destino de células-tronco mesenquimais em modelos de cultura de tecidos, onde ele atua como um ativador da adipogênese e um repressor da osteoblastogênese [37-39]. Em muscular saudável, expressão C /EBP é restrito a Pax7 células

+ satélite e sua expressão diminui após a ativação [40-42]. Ectópica expressão /EBP C inibe myogenesis através da inibição da expressão da proteína MyoD, levando a uma redução da miogenina e expressão MyHC e diminuição da atividade fusog�ico [41].

In vivo

, sepsia, cancro e pode glucocorticóides regulam positivamente a expressão de C /EBP p em muscular, bem como de desencadear a caquexia [43, 44]. Com efeito, a caquexia pode estimular a expressão de C /EBP p em fibras musculares que conduzam à expressão de atrogina-1 e atrofia das fibras [45]. Enxerto do tumor Carcinoma Pulmonar de Lewis (LLC) para C /EBP p animais nulos impediu a estimulação de atrogina-1 em fibras musculares e atrofia muscular [45], sugerindo que a perda de C /EBP p pode inibir a atrofia muscular em caquexia do cancro. No entanto, o nullizygous animais C /EBP é imunocomprometido, e, assim, é pouco provável que tenha as respostas normais ao enxerto tumoral, incluindo a produção de citocina necessária para o desenvolvimento da caquexia [46, 47], sugerindo que os modelos condicionais proporcionaria uma maior profundidade de compreensão. Além disso, o modelo nullizygous não pode distinguir o papel de C /EBP p em fibra muscular contra os efeitos potenciais na população de células satélite regeneração de condução.

Várias linhas de evidência indicam que a inibição da regeneração do músculo esquelético, quer através da perda de precursores miogénicos, a inibição da MyoD ou através da activação do receptor de activina de tipo 2, participa no desenvolvimento de caquexia do cancro [31, 48-50]. Aqui, nós mostramos, utilizando modelos de caquexia associada ao câncer, que a estimulação de expressão C /EBP em células satélites e mioblastos pelo ambiente caquéticos impede a resposta regenerativa miogênica.

Resultados

O meio condicionado de humano cancros induz a expressão C /EBP p em mioblastos

Dado que a C /EBP p é um regulador importante do sistema imunitário e é a jusante de várias vias de sinalização de citocinas, previmos que meio condicionado a partir de cancros humanos estimularia expressão C /EBP em mioblastos. mioblastos C2C12 foram cultivadas com meio condicionado (CM) a partir de várias linhas de células de cancro humano por 2 dias e expressão de C /EBP p foi avaliada por Western blotting. A incubação de células C2C12 com CM de todos os tumores testados estimularam expressão de C /EBP p em graus variáveis, com o PC-3, e MCF7 A549 linhas que produzem o aumento mais robusto na expressão (Fig 1A). Por contraste, a linha celular de cancro do ovário SKOV3 e a linha de cancro do cólon humano HCT-116 estimuladas expressão de C /EBP p o menos. A incubação com PC-3 CM também estimulou

Cebpb

expressão de mRNA em quase 2 vezes (Fig 1B). Interessantemente, as células PC-3 expressam o TNFa, IL-1β e ARNm PIF, e expressão de C /EBP foi mostrado para ser regulada positivamente por IL-6, uma citocina cuja expressão é regulada positivamente pela IL-1 e TNFa de sinalização [15, 51 -53]. Com efeito, enquanto que as células PC-3 expressam

IL1B

, o transcrito não foi detectável em células SKOV3, sugerindo um mecanismo para explicar a estimulação diferencial de expressão C /EBP p em mioblastos por estas duas linhas celulares de cancro (Fig 1C).

(a) mioblastos C2C12 foram incubadas com meio condicionado de cancros humanos indicados ou meio não condicionado (UM) misturado 1: 1 com meio fresco de mioblastos durante 48 horas. expressão de C /EBP p foi avaliada por Western blot. β-actina é um controlo de carga. (B)

Cebpb

expressão de ARNm em mioblastos tratados com PC-3 médio ou meio não condicionado durante 48 horas. * P 0,05, n = 5. (C)

expressão IL1B

em SKOV3 e PC-3 células cancerosas. * P 0,05, n = 5.

Tumor meio condicionado inibe myogenesis

Para investigar o papel do C /EBP em células-tronco musculares durante a caquexia associada ao câncer, foi utilizado um tecido validado modelo de cultura [53] em que subconfluentes mioblastos C2C12 foram incubadas com meio condicionado (CM) a partir do cancro da próstata humano PC-3 e DU145, ou com meio não condicionado (UM) durante 2 dias antes da indução de diferenciação (Figura 2A). Consistente com relatórios anteriores, a incubação com CM de ambos os cancros revogada miogénese, como evidenciado por uma redução no número e tamanho dos miotubos cadeia pesada de miosina (MyHC) positivos (Fig 2B) [53]. O índice de fusão (# núcleos em MyHC + células /# miócitos) foi reduzido a 60% por meio de PC-3 e ~ 30% por meio de DU145, em comparação com os controles (Fig 2C), o índice de diferenciação (#nuclei em MyHC + células /Total núcleos) foi reduzida em aproximadamente 40% nas células pré-tratadas com meio de PC-3, e ~ 30% para os doentes tratados com meio DU145, em comparação com os controlos (Figura 2C), o que sugere que tanto o número e a maturidade dos miotubos foi afectada por uma breve exposição a meio condicionado de tumor. Em mioblastos em proliferação, a exposição ao CM a partir de ambos os tumores estimulados expressão de C /EBP p depois de dois dias, sem afectar a expressão Pax7 (Figura 2D). A expressão de MyoD foi reduzida nas células tratadas com DU145 CM, embora não em células tratadas com PC-3 meio (Fig 2D). Depois de diferenciação (dia 7), pré-tratamento com o PC-3 de meio condicionado inibida miogenina e expressão MyHC, consistentes com diferenciação prejudicada, sem impactar expressão MyoD (Figura 2E). Além disso, a expressão de mRNA de

Myod1

,

Myog

e neonatais

Myh

isoformas (

Myh1

,

Myh2

,

Myh8

e

Myh13

) foram inibidas por exposição a PC-3 em relação ao meio de células expostas a meio não condicionado (figura 2F). médio DU145 reduzidas de forma similar

Myog Comprar e neonatal

Myh

expressão isoforma, sem impactar

Myod1

expressão.

(A) Representação esquemática do processo de tratamento para a modelo de cultura de tecidos de caquexia. O meio condicionado a partir de células PC-3 foi misturado 1: 1 com meio fresco, e adicionou-se proliferando sobre mioblastos C2C12 durante 48 horas, após o que foram induzidas para diferenciar as células em DMEM fresco contendo 2% de soro de cavalo durante 5 dias. (B) coloração imunocitoquímica para a expressão da cadeia pesada de miosina em C2C12 culturas tratadas com meio condicionado de PC-3 ou cancros da próstata DU145 ou meio não condicionado (UM) Como em (a). manchas DAPI núcleos azul. (C) C2C12 culturas foram induzidas para se diferenciarem como em (A) e o índice de fusão (# mionúcleos /miotubos) e índice de diferenciação (# mionúcleos /# núcleos totais) foi calculada e representada em relação à UM. Os valores reais são mostrados nas barras. * P 0,05, n = 7. (D) Análise de transferência de Western de C /EBP, Pax7, e expressão MyoD na proliferação de células C2C12 no dia 2 após a incubação com o meio condicionado. A actina é um controlo de carga. (E) a análise Western blot de expressão do marcador miogênica em células C2C12 diferenciadas no dia 7. actina é um controle de carga. (F) Análise de qRT-PCR de

Myod1

,

Myog

e miosina neonatal cadeia pesada (

Myh1

,

Myh2

,

Myh8

,

Myh13

) expressão, mostrado em relação às células tratadas com meio não condicionado (UM) no dia 7. * p 0,05, n = 4.

a inibição da miogénese pela meio condicionado pelo tumor varia com capacidade para induzir C /EBP p em C2C12 e mioblastos primários

Desde meio condicionado seria de esperar que contêm uma mistura de factores de crescimento e citocinas que podem influenciar a entrada em miogénese, repetiu-se a cultura em modelo de caquexia utilizando meio condicionado a partir de células SKOV3 que estimula apenas fracamente expressão C /EBP. Embora o pré-tratamento com o meio de SKOV3 permitido para a diferenciação robusta, pré-tratamento com meio de PC-3 inibiu a formação de miotubos, diminuindo o índice de diferenciação em cerca de 50% e o índice de fusão de ~ 40% (Figura 3A e 3B). Além disso, de acordo com as diferenças de indução C /EBP p por células SKOV3 e PC-3 CM, miogenina expressão e expressão MyHC foi diminuída em células expostas a PC-3 como meio de comparação com os controlos SKOV3 (Fig 3C).

(a) coloração imunocitoquímica de expressão da cadeia pesada de miosina em mioblastos C2C12 de pré-tratadas com meio condicionado de células SKOV3 ou células PC-3 misturados 1: 1 com meio fresco, durante 48 horas, e induzidas para se diferenciarem por mais 5 dias. manchas DAPI núcleos azul. (B) C2C12 culturas foram induzidas para se diferenciarem como em (A) e os índices de diferenciação e de fusão foram calculados como em relação às células tratadas com SKOV3. Os valores reais são mostrados nas barras respectivas. * P 0,05, n = 5. (C) C /EBP p, e a expressão da proteína do marcador miogénica em mioblastos C2C12 tratadas como em (A). A ciclofilina B (CYPB) é apresentado como um controlo de carga. (D) de coloração imunocitoquímica da miosina de cadeia pesada de expressão (MYH) em mioblastos primários pré-tratadas com meio condicionado de células SKOV3 ou células misturadas 1 PC-3: 1 com meio fresco, durante 48 horas, e induzidas a diferenciar para um período adicional de 48 horas em DMEM contendo 10% de soro de cavalo. manchas DAPI núcleos azul. (E) culturas de mioblastos primários foram induzidas para se diferenciarem como em (D) e os índices de diferenciação e de fusão foram calculados como em relação às células tratadas com SKOV3. Os valores reais são mostrados nas barras respectivas. ** P 0,01, n = 4. (F) Percentagem de Pax7 + células em relação ao total restante núcleos em células C2C12 cultivadas em meio condicionado e diferenciadas, tal como em (D), tal como determinado por imunocitoquímica. * P 0,05, n = 4. (L) C /EBP p, e a expressão da proteína do marcador miogénica em mioblastos primários tratados como em (D). Ciclofilina B (CYPB) é mostrado como um controlo de carga.

De acordo com o modelo C2C12, pré-tratamento de mioblastos primários com meio condicionado a partir do chumbo tumor PC-3 para a formação de menores e miotubos menores após 2 dias em meio de diferenciação, em comparação com as células tratadas com meio condicionado de tumor SKOV3 (Fig 3D). O índice de diferenciação foi diminuída ~ 30% com PC-3 pré-tratamento, quando comparado com células tratadas com SKOV3, enquanto o índice de fusão foi diminuída ~ 50% em mioblastos tratados com PC-3 (Figura 3E). Além disso, o número de células restantes Pax7 + nas culturas após a diferenciação, tal como determinado usando imunocitoquímica, foi significativamente aumentado em culturas pré-tratadas com meio de PC-3 em aproximadamente 25% em comparação com os controlos (Fig SKOV3 3F). Como previsto, os níveis de C /EBP foram aumentados em células PC-3 tratadas, em comparação com controlos, e a expressão de miogenina e miosina de cadeia pesada foram diminuídos. Curiosamente, em contraste com as nossas observações no modelo de C2C12, mioblastos primários tratados com PC-3 CM também demonstraram uma diminuição na expressão da proteína MyoD, um resultado consistente com as nossas observações anteriores neste sistema (Figura 3G) [41, 42].

C /EBP é aumentada em mioblastos primários isolados de ratos caquéticos

Para determinar se o ambiente cancerosas poderia estimular a expressão C /EBP em mioblastos

in vivo

, nós isolado muscular células satélites de saudável e caquéticos LLC animais tumor-rolamento e os diferenciava

ex vivo

(Fig 4A). Considerando SCs purificados a partir de músculos saudáveis ​​diferenciadas de forma eficiente, mioblastos isolados de animais com caquexia produzida menos e menores miotubos (figura 4B). O índice de diferenciação foi reduzida em 38% em culturas de animais caquéticos, e o índice de fusão foi reduzida 46% em comparação com controlos saudáveis ​​(Figura 4C). Como estas células foram expandidas em meio normal durante 5 dias antes da indução de diferenciação, níveis de C /EBP foram apenas moderadamente aumentado depois da diferenciação, o que resulta na expressão do MyoD normalizada (Figura 4D) e uma pequena diminuição na expressão de miogenina. mioblastos primárias retiradas do camundongos caquéticos também demonstrou uma diminuição na expressão MyHC quando comparado com controlos placebo, de acordo com o defeito diferenciação observada (Fig 4D). Assim, semelhante aos nossos experimentos CM, as células satélites provenientes LLC animais enxertados com tumores têm expressão aumentada C /EBP e um defeito na diferenciação que persiste

ex vivo

.

(A) 5×10

5 Carcinoma do pulmão de Lewis (LLC) células ou PBS (Sham) foi injectado no flanco de ratinhos C57BL /6 e deixou-se enxertar durante 3 semanas para induzir caquexia. (B) A imunocitoquímica para a expressão da cadeia pesada de miosina em mioblastos primários isolados a partir de ratos injectados com sham e LLC-injectados e diferenciadas durante 2 dias. (C) Diferenciação (DI) e fusão (FI) Índices de culturas isoladas e diferenciada como em (B). * P 0,05, n = 5 (D) análise de Western de C /EBP e expressão miogénica marcador em células isoladas a partir de ratinhos saudáveis ​​ou com caquexia como em (A) e depois da expansão da cultura durante 5 dias, diferenciadas durante 2 dias. Ciclofilina B (CYPB) é um controle de carga.

caquexia Cancer inibe a regeneração do músculo in vivo

Para avaliar músculo esquelético capacidade regenerativa em animais caquéticos, que feriu o músculo TA à esquerda com cardiotoxina (CTX) uma vez caquexia foi estabelecido e avaliado o reparo uma semana mais tarde (Fig 5A). Sete dias após a lesão, o músculo TA de animais saudáveis ​​reparado de forma eficiente com numerosas fibras musculares com núcleos centralmente localizados visíveis, enquanto que o TA feridas de animais caquéticos teve extensa fibrose e infiltração de células inflamatórias com pouca evidência de regeneração (Fig 5B). Com efeito, enquanto reparação fibra restaurada área de secção transversal para níveis não lesadas em ratos de controlo saudáveis, em ratinhos caquéticos, regenerando a área da fibra muscular em corte transversal foi ainda mais reduzida em 28% após a lesão, medindo apenas 59% do músculo não-caquéticos CTX-feridos (Figura 5C). Consistente com estas observações, o peso TA de animais saudáveis ​​feridos no momento da necropsia havia retornado ao dos controles, enquanto o peso do TA feridas em animais caquéticos foi de apenas 73% do controle caquéticos ileso (Fig 5D).

(a) representação esquemática do modelo de lesão. A caquexia foi induzida por células cancerosas enxertando LLC subcutaneamente e permitindo-lhes crescer durante 3 semanas. Uma vez caquexia foi estabelecido, os animais foram feridos pela injeção cardiotoxina (CTX) no músculo TA. lesão simulada foi realizada com PBS. Lesão foi deixada a reparar, durante uma semana antes da análise. (B) H E-AT coradas secções transversais de sham e ratos injectados com LLC como em (B) 7 dias após a lesão CTX. O TA contralateral foi injectado apenas com PBS. Barra de escala = 20 um. (C) XSA médio de fibra de PBS e sham CTX-feridos e ratinhos LLC como em (B). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, n = 4. (D) de massa TA em PBS e sham CTX-feridos e ratinhos LLC como em (B). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, n = 5. (E) Percentagem de células Pax7 + (em relação ao total de DAPI + núcleos) em PBS e CTX-feridos TA de sham e LLC animais. ** P 0,01, *** p 0,001, n = 5. (M) Percentagem de células /EBP p + /Pax7 + C (em relação aos animais sham não lesionados) em PBS e CTX-feridos TA de sham e LLC animais. * P 0,05, *** p 0,001, n = 3.

A seguir, marcou o número de células Pax7 + em secções transversais TA (Fig 5E). Enquanto cerca de 1,6% do núcleo corado positivamente para Pax7 nos músculos TA não lesionados de animais sham, esse número chegou a 3,5% em animais LLC de rolamento não lesionados. Seguindo CTX lesão, Pax7 + células aumentou em ambos os sham e LLC animais, com um aumento de 2 vezes para animais de controlo simulado, em comparação com a perna do lado e um aumento de 4,5 vezes em relação a perna do lado em animais portadores de tumor para quase 20% de núcleos. Além disso, enquanto a lesão não afectou a percentagem de Pax7 + /C /EBP p + células satélites em animais saudáveis, na coorte portador de tumor, a percentagem de células positivas duplas foi aumentado em ambos os músculos não lesionado e lesionado (Figura 5F), consistente com

ex vivo

análise das células satélites (Fig 4D). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a caquexia do cancro aumenta o tamanho Pax7 + compartimento e estas células têm um aumento da expressão de C /EBP p mas reduzidas capacidades regenerativas.

Perda de expressão C /EBP p protege mioblastos em cultura de caquexia

para confirmar um papel para C /EBP no desenvolvimento da caquexia associada ao câncer, nós isolado

Cebpb

fl /fl

Pax7

+ /+ (WT) e

Cebpb

fl /fl

Pax7

creer /+ (CKO) células satélites e pré-tratados-los com CM do tumor PC-3 ou o tumor SKOV3 ( controlo) antes da indução de diferenciação em condições baixas de soro. Após 2 dias em meio de diferenciação, as culturas foram imunocoradas para MyHC expressão (Fig 6A). Embora o pré-tratamento com o PC-3 CM inibiu a diferenciação de mioblastos em WT, a perda de expressão de C /EBP p diferenciação resgatado sob essas condições (Figura 6A e 6B), sugerindo que a perda de expressão de C /EBP p protege mioblastos do meio caquético. Apesar de restauração do índice de diferenciação em culturas CKO, perda de expressão C /EBP não restaurou miotubos tamanho (índice de fusão), que foi reduzido a seguir à incubação com o meio de PC-3 (Fig 6C). Embora o tratamento de células WT com PC 3-médio aumentou a percentagem de células Pax7 + nas culturas, consistente com uma redução no índice de diferenciação, as culturas com falta C /EBP tinham significativamente menos células de reserva após a diferenciação em condições tanto de controlo e caquexia (Figura 6D ). Embora nenhuma diferença na expressão do marcador miogénica foram observadas quando se comparam WT e células CKO no meio de controlo SKOV3, análise de Western revelou que MyoD e miogenina expressão foram reduzidos células inWT seguinte de pré-tratamento com o PC-3 meio (Fig 6E). No entanto, em células CKO, MyoD expressão foi aumentada a seguir à incubação com meio de PC-3, em comparação com WT e expressão miogenina foi restaurado para níveis de controlo (Figura 6E). Assim, a perda de C /EBP p em células satélites do músculo pode resgatar miogénese na presença de meio condicionado, sem restaurar tamanho de miotubos

.

(A) A imunofluorescência indirecta de cadeia pesada de miosina (MyHC) expressão em mioblastos primários isolados a partir de

Cebpb

fl /fl

Pax7

+ /+ (WT) e

Cebpb

fl /fl

Pax7

cREER /+ (CKO) ratinhos e cultivadas com SKOV3 ou PC-3 de meios condicionados, durante 2 dias, e induzidas para se diferenciarem por um período adicional de 2 dias. (B) índice de diferenciação (# mionúcleos /# núcleos) de mioblastos primários culturas em (A). * P 0,05, *** p 0,001, n = 6. (C) índice de fusão (# mionúcleos /miotubos) para células diferenciadas como em (A). * P 0,05, ** p 0,01, n = 6. (D) Percentagem de células Pax7 + em relação ao total de núcleos em culturas a partir de (a) após a diferenciação, designado como células de reserva. * P 0,05, ** p 0,01, n = 6. (E) análise de transferência de Western de C /EBP e expressão miogénica marcador em mioblastos primários tratados como em (A). Ciclofilina B (CYPB) é um controle de carga.

Discussão

C /EBP é um fator de transcrição implicado em numerosos processos biológicos, incluindo a diferenciação celular, regulação do ciclo celular, a função do sistema imunológico e a sobrevivência celular [33, 54-59]. Como tal, C expressão /EBP é influenciado por muitos caminhos diferentes, incluindo a sinalização de citocinas, fatores de crescimento, o proteassoma e Camp sinalização [42, 60, 61]. Aqui, demonstramos que a expressão de C /EBP p podem ser estimuladas por exposição a meio condicionado de cancros humanos, com diferentes eficiência. Embora este meio condicionado contém mediadores de citoquinas provavelmente, os factores são em meios condicionados de condução expressão de C /EBP p permanecem desconhecidos e podem ser diferentes para cada cancro. No entanto, a estimulação da expressão de C /EBP p em mioblastos correlacionada com a inibição de miogénese que poderia ser invertida com perda de C /EBP p.

Pré-tratamento de proliferação de mioblastos com meio condicionado foi suficiente para inibir a miogenese, mesmo embora a diferenciação foi realizado em meio livre de sinais pró-caquéticos. Estas experiências separadas, assim, os efeitos anti-miogénicos de meio condicionado a partir dos efeitos de atrofia miotubos que também podem ocorrer. Curiosamente, o defeito miogênica foi recapitulou em mioblastos primários isolados de ratos caquéticos, mesmo após a expansão em meio de crescimento contendo soro de ratinho ou meio condicionado. É concebível que a exposição a um meio caquéticos impulsiona modificação epigenética persistente de loci envolvidos na miogénese que prejudicam expressão apropriada de proteínas necessárias para a diferenciação. A exposição ao TNFa, uma citoquina frequentemente associado com a caquexia, tem sido demonstrado induzir a metilação de ilhas de CpG dentro do locus MyoD, e a histona transferases metilarginina PRMT5 e WDR77 /MEP50 pode induzir a repressão da transcrição de genes alvo C /EBP p induzindo a dimetilação simétrico de histonas H4 arginina 3 [62, 63]. Dado que mioblastos primários faltam C /EBP expressão pode diferenciar normalmente após a exposição ao meio de indução de caquexia, C /EBP seria mais provavelmente necessário para a padronização destas modificações epigenéticas propostas. Enquanto a diferenciação após o tratamento com o meio de PC-3 condicionado é restaurado com a perda de C /EBP, o tamanho miotubos, medida como o índice de fusão, não foi resgatado. Estes resultados sugerem que o pré-tratamento com um meio de caquéticos antes da diferenciação reduz a capacidade das células fusogénica após a diferenciação, até mesmo em meio normal. Como tal, além de conduzir directamente a atrofia das fibras maduras e reduzindo a sua diferenciação, caquexia também pode prejudicar a fusão de células diferenciadas com sucesso. Enquanto a ressecção do tumor pode curar caquexia, não se sabe se as respostas regenerativas recuperar totalmente ou se um defeito persistir uma vez que o ambiente caquéticos resolve, e deve ser mais explorado.

O defeito diferenciação após o tratamento com meio de PC-3 pode ser atribuída a uma falha para induzir miogenina totalmente, que pode ser revertida por perda de C /EBP p. Em mioblastos primários, a expressão da proteína MyoD também foi reduzida pela exposição ao meio caquéticos, mas não foi observada em células C2C12. De facto, a expressão C /EBP é inferior em C2C12 quando comparado com mioblastos primários, e, portanto, diferenças nos níveis de C /EBP p a seguir à exposição ao meio condicionado pode por si só explicar a sensibilidade diferencial de expressão MyoD nos dois sistemas [41]. C /EBP p pode inibir a capacidade de MyoD de transactivar o promotor de miogenina e a expressão de miogenina foi consistentemente regulados negativamente em todos os modelos testados, sugerindo que a interferência com a função MyoD como um mecanismo possível para a perda da expressão de miogenina em mioblastos pré-tratadas com meio condicionado [ ,,,0],41].

expressão da proteína MyoD é regulada negativamente pela C /EBP, sem alterações concomitantes para

Myod1

níveis de mRNA [41]. Além disso, a proteína MyoD não podia ser resgatado com a inibição do proteassoma [42]. Curiosamente, a perda de expressão de C /EBP não aumenta a expressão de MyoD sob condições de controlo (SKOV3) quando comparado com as células WT embora Nestas experiências, a eficiência de diferenciação das culturas é de aproximadamente 80%, tornando-o mais difícil de ver aumentos na expressão do marcador miogénica . No entanto, na ausência de C /EBP p após tratamento com meio de PC-3, que se observa um aumento na expressão de MyoD sobre o observado em culturas de wt, o que sugere que a perda do mecanismo inibitório C /EBP p está em jogo neste sistema.

Embora a perda de expressão C /EBP pode melhorar a diferenciação após condicionado meios de pré-tratamento, não fica claro se a inibição da myogenesis em caquexia associada ao câncer contribui para a patogênese da síndrome. Desde caquexia também induz lesão muscular [50], a estimulação da resposta regenerativa seria previsto para ser protetor, e na verdade, muitos relatos demonstraram que a regeneração reforço melhora a atrofia muscular observada na caquexia [49, 50, 64]. Infelizmente, os nossos resultados mostram que esta resposta é inibida pela expressão de C /EBP, potencialmente exacerbar a perda de massa muscular. No entanto, os mecanismos para estimular myogenesis que melhorar a histologia muscular e vida útil em modelos animais sugerem que a promoção da regeneração é uma avenida terapêutica importante para o tratamento da caquexia.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

mioblastos C2C12 e o carcinoma pulmonar de Lewis (ATCC) foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco). células de adenocarcinoma da próstata DU145 (ATCC) PC-3 e foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% e 2 mM de L-glutamina (Sigma). SKOV3 Adenocarcinoma do ovário e do carcinoma colo-rectal HCT116 foram cultivadas em meio de McCoy, MCF7 glândula mamária adenocarcinoma foram cultivadas em DMEM e carcinoma de epitélio pulmonar A549 foram cultivadas em meio F-12K, todos suplementado com 10% de soro fetal de bovino.

esqueletal musculares células mioblastos primários foram isolados como descrito [65]. Menores músculos dos membros posteriores de fêmeas C57BL /6 murganhos foram dissecados e digerido com colagenase e dispase (Roche) a 37 ° C durante 1-2 horas até que os músculos foram dissociadas.