Abstract

VTI1A-TCF7L2

foi relatado como um gene de fusão recorrentes no cancro colorectal (CRC), encontrado para ser expressa em três dos 97 cânceres primários e uma linha celular, NCI-H508, onde se junta a uma deleção genómica os dois genes [1]. Para investigar mais esta fusão, analisamos e sequenciação de DNA RNA de dados de alto rendimento de sete linhas celulares de CRC, e identificou o gene

RP11-57H14.3

(ENSG00000225292) como parceiro de fusão da novela para

TCF7L2

. A fusão foi descoberto a partir de ambos os dados de genoma e transcriptoma na linha celular HCT116. Por triplicado nested RT-PCR, foi testada tanto a transcrição e a fusão romance

VTI1A-TCF7L2

para a expressão de uma série de tecidos de CRC 106, 21 linhas celulares de CRC, 14 de mucosa de cólon normal, e 20 a partir de tecidos normais variado sítios anatômicos. Ao todo, 42% e 45% das amostras de CRC expresso

VTI1A-TCF7L2

e

TCF7L2-RP11-57H14.3

transcrições de fusão, respectivamente. Os transcritos de fusão foram ambos visto em 29% das amostras de mucosa de cólon normais, e em 25% e 75% dos tecidos normais testados a partir de outros órgãos, revelando que o

TCF7L2

transcrições de fusão são não específico para cancro nem para o cólon e do recto. Sete variantes de processamento diferentes foram detectados para o

VTI1A-TCF7L2

fusão, dos quais três são novos. Quatro variantes de processamento diferentes foram detectados para o

TCF7L2-RP11-57H14.3

fusão. Em conclusão, nós identificamos novas variantes de

VTI1A-TCF7L2

transcrições de fusão, incluindo um gene parceira de fusão novela,

RP11-57H14. Sims 3, e demonstraram níveis detectáveis ​​em uma grande fração do CRC amostras, bem como na mucosa de cólon normal e outros tipos de tecidos. Sugerimos que as transcrições de fusão observados em uma alta freqüência de amostras são quimeras de transcrição induzida que são expressos em níveis baixos na maioria das amostras. As transcrições de fusão semelhantes induzidas por rearranjos genômicos observados em linhas celulares de cancro individuais podem ainda têm potencial oncogênico, como sugerido no estudo original por Bass et al

Citation:. Nome T, Hoff AM, Bakken AC, Rognum TO, Nesbakken a, Skotheim RI (2014) High Frequency da fusão Transcrições Envolvendo

TCF7L2

no câncer colorretal: Novel Fusão sócio e variantes de processamento. PLoS ONE 9 (3): e91264. doi: 10.1371 /journal.pone.0091264

editor: Nathan A. Ellis, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 16 Outubro, 2013; Aceito: 10 de fevereiro de 2014; Publicação: 07 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Nome et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi financiado por doações do Cancer Society norueguês (TN e AMH foram financiados como PHD-alunos da concessão PR-2007-0166 para RIS), NorStore (para armazenamento de ficheiros informáticos; projeto NS9013K), e em parte suportado pelo Conselho de Pesquisa da Noruega por meio de seus Centros de Excelência regime de financiamento, número do projeto 179571. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o segundo mais comum e mortal doença do cancro em todo o mundo [2], e há uma alta demanda de bons biomarcadores para tanto a detecção precoce e para estratificar pacientes de acordo com o prognóstico e previu respostas ao tratamento. No entanto, CRC é uma doença heterogênea, e alguns biomarcadores ainda não chegou ao uso clínico de rotina.

genes de fusão representam uma classe de genes de câncer com potencial biomarcador promissor, e quando causada por rearranjos cromossômicos, como translocações, deleções ou duplicações, eles são comumente altamente câncer específico. Até agora, alguns genes de fusão altamente recorrentes foram identificados no CRC. Exemplos de outros tipos de câncer inclui o conhecido

BCR-ABL1

fusão (cromossomo Philadelphia), presente em 95% das leucemias mielóide crónica [3], e

TMPRSS2-ERG

que está presente em cerca de 50% dos cancros da próstata [4]. Em alguns casos, o gene de fusão pode ser um alvo terapêutico, demonstrada por ligação de imatinib e bloqueando o domínio cinase da proteína de fusão BCR-ABL1.

O gene primeira fusão relatado para ser recorrente em CRC, sequências de fusão de

VTI1A

e

TCF7L2

, foi relatado em 2011 [1].

VTI1A-TCF7L2

transcrições de fusão foram detectados em três de 97 (3%) CRCs, bem como a linha de células de cancro do cólon NCI-H508. Em NCI-H508, a fusão é causada por uma deleção ~540 kb entre os genes de

VTI1A

e

TCF7L2

.

TCF7L2

codifica o fator de transcrição TCF4, que dimeriza com β-catenina. β-catenina está envolvido na regulação da via de sinalização Wnt-, que é comumente alterada na maioria, se não todos, os CRCs [5]. Esgotamento da

VTI1A-TCF7L2

transcrição de fusão resultou em perda significativa de crescimento independente de ancoragem na linha de células de fusão positiva CRC NCI-H508 [1].

mutações freqüentes em um intervalo polyadenine dentro do

gene TCF7L2

foram anteriormente relatados para CRC, especialmente em tumores instáveis ​​microssatélites [6]. tumores estáveis ​​microssatélites têm, no entanto, também foi recentemente mostrado para abrigar mutações frequentes no

TCF7L2

gene, indicando uma possível função importante na CRC biologia [7].

Neste estudo, objetivamos a investigar a presença e variantes do

VTI1A Restaurant –

TCF7L2

fusões no CRC. Analisamos dados de todo o genoma e transcriptoma de sequenciação profunda da CRC para fusões relacionadas envolvendo um dos parceiros de fusão e de novos pontos de interrupção de fusão. A recorrência do

VTI1A-TCF7L2

fusão, e uma nova transcrição fusão entre

TCF7L2

eo novo gene parceiro

RP11-57H14.3,

foi analisada em uma série dos CRCs e amostras normais.

Materiais e Métodos

Matéria

Um total de 106 amostras de tecido CRC e 14 amostras normais emparelhados de duas séries paciente independente, série 1 e série 2, foram rastreadas para a presença dos transcritos de fusão. Todos os CRCs são de pacientes tratados cirurgicamente em hospitais na região de Oslo, Noruega. As duas séries paciente incluído tanto estável microssatélites (n = 85) e instável (n = 20) CRCs (uma amostra não marcados), tal como avaliado por estudos anteriores [8] – [10]. A série foi enriquecido para estágios clínicos II e III CRC (52 estágio II, 53 estágio III, e um estágio IV). O estadiamento foi de acordo com a Comissão Americana Joint Câncer /União de Controle do Câncer Internacional (AJCC /UICC). As 14 amostras normais emparelhados de Série 1 foram coletadas de visualmente livre de doença áreas da mucosa do cólon. Os biobancos pesquisa foram registrados de acordo com a legislação nacional, eo estudo foi aprovado pelo Comité Regional para a Medicina de Ética em Pesquisa (números de 2781 e 236-2005-16141).

Um total de 21 linhas de células colorretal foram incluídos [11]. As linhas celulares HCT116, HCT15, LoVo, NCI-H508, RKO, SW48, SW620 e foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). As linhas celulares Co115, Colo320, EB, FRI, HT29, IS1, IS2, IS3, LS1034, LS174T, SW480, TC7, TC71 e V9P foram gentilmente cedidas pelo Dr. Richard Hamelin, Inserm, França. Identidades das linhas celulares foram verificados através do Kit AmpFLSTR Identifiler Amplificação por PCR (Applied Biosystems por Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA).

Além disso, nós analisamos vinte tecidos normais a partir de sites diversos do corpo para o

TCF7L2

envolvendo transcrições de fusão (adiposo, bexiga, cérebro, colo do útero, cólon, esôfago, coração, rim, fígado, pulmão, ovário, placenta, próstata, músculo esquelético, baço, estômago, testículos, timo, tireóide e traqueia ; FirstChoice normal Tecido humano de ARN total, cada um pool de RNA a partir de pelo menos três indivíduos, com excepção de uma amostra individual a partir do estômago;. Ambion, Applied Biosystems por Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA)

Identificação de Fusions de Whole-transcriptoma e genoma inteiro Sequencing dados

-end dados emparelhados RNA-sequenciamento de sete linhas celulares de cancro colorrectal (HCT15, HCT116, HT29, LS1034, RKO, SW48, e SW480) e a partir de 16 tecidos normais de origens diversas foram incluídos no estudo. Todos estes foram sequenciados utilizando o Illumina GAIIx (linhas celulares) ou HiSeq 2000 (tecidos normais, ambos os sequenciadores de Illumina Inc., San Diego, CA, EUA). Os dados do cancro do cólon RNA-Seq incluídos 220 milhões sequência de 76 pb lê (adesão estudo europeu Nucleotide Arquivo ID ERP002049) [12] e as amostras normais incluída entre 73 e 80 milhões de 50 sequência bp leituras por amostra (ArrayExpress ID de adesão [E-MTAB -513] e estudo europeu Nucleotide Archive [EMBL: ERP000546]). Além disso, obtivemos-end emparelhado sequências de todo o genoma das linhas celulares HCT15, HCT116, HT29 e SW480 para um rendimento médio de cerca de 30 × [12] (Os dados podem ser disponibilizados mediante solicitação para pesquisadores).

Uma lista de transcrições de fusão potenciais foi produzido por desarmar versão 0.6.0 [13] sobre as sete linhas celulares sequenciaram-RNA mencionadas anteriormente, além da linha de células CRC NCI-H508 (análise id 0c7a79cc-bbaf-4c6d-93e1-866f5f5f3d0d ) baixado do Cancer Genomics Hub (organizado pela Universidade da Califórnia em Santa Cruz, CA, EUA), dados fornecidos pela linha celular de cancro da Encyclopedia [14] e 16 tecidos do v2 Mapa corpo Illumina Humano. Para as linhas de células com sequência emparelhado todo o genoma (HCT116, HCT15, HT29 e SW480), os transcritos de ARN de fusão e pontos de interrupção de DNA foram identificados por nfuse versão 0.2.0 [15]. A nomeação de fusão necessários três abrangendo pares de leitura e dois divisão lê a partir dos dados de RNA-seq.

Detecção de fusão Transcrições por transcriptase reversa-PCR

Para o

VTI1A-TCF7L2

de fusão, os mesmos iniciadores de RT-PCR e iniciadores internos foram utilizados como na publicação original [1]. Para a fusão do

TCF7L2-RP11-57H14.3

, primers e iniciadores internos foram concebidos para a sequência de ponto de interrupção transcrição de fusão, conforme identificado por desarmar, utilizando o software web Primer3 [16]. As sequências dos iniciadores óptimos (Tabela S1) foram ainda encomendado a partir BioNordika Norway AS (Oslo, Noruega) e sintetizado por Eurogentec (Liège, Bélgica). Foi realizada sensível nested RT-PCR com 20 + 30 ciclos para ambos os ensaios utilizando 50 ng de ADNc de cada amostra como entrada para o primeiro ciclo de PCR. Os produtos da PCR foram primeiro diluídos para uma concentração final de 1/200 na PCR aninhada. O seguinte protocolo de ciclismo foi usado para todas as reacções de PCR: 15 minutos de activação da polimerase de ADN HotStarTaq a 95 ° C, um ciclo de três passos de desnaturação durante 30 segundos a 95 ° C, emparelhamento do iniciador por segundo uma hora e 15 a fusão de iniciadores óptima temperaturas (Tabela S1), e extensão durante um minuto a 72 ° C. Após o último ciclo, uma etapa de extens final foi realizada a 72 ° C durante 6 minutos. Os produtos nested-PCR foram separados por electroforese a 200 V durante 30 minutos sobre um gel de 2% de agarose e visualizado usando brometo de etídio e luz ultravioleta. corridas em triplicado de RT-PCR foram efectuadas para ambos os ensaios, usando os parâmetros idênticos, para todas as amostras. Nenhum modelo controles negativos foram incluídos a partir de cada uma síntese de cDNA, reações primeira rodada de PCR e nested-PCR.

Sanger Sequencing of Fusion Transcrição Breakpoints

As amostras que foram positivas para a segunda repetição RT-PCR ensaios, e mostrou uma banda de um único nucleótido no gel de agarose, foram sequenciados directamente a partir de ambos os lados utilizando tanto para a frente e reverso iniciadores encaixados. Antes da sequenciação, os produtos de PCR aninhados foram purificados utilizando Illustra Exostar 1-etapa de limpeza (GE Healthcare, Little Chalfront, Reino Unido). As reacções de sequenciação de ciclo foram realizadas utilizando o kit Big Dye Terminator ciclo v.3.1 sequenciamento (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), seguindo recomendação do fornecedor. Além disso, os produtos de sequenciação foram limpos e purificado utilizando BigDye Xterminator (Applied Biosystems), antes de serem analisadas por electroforese capilar utilizando o ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). As sequências foram analisados ​​utilizando o software v.5.3.1 análise de sequenciação.

Avaliação da Genomic Breakpoint Identificado

TCF7L2-RP11-57H14.3

por PCR

A genômica breakpoint identificados a partir de dados de toda a sequenciação do genoma, que liga

TCF7L2

para

RP11-57H14.3

na linha de células do cancro do cólon HCT116, foi validado utilizando PCR.

Primers para genómico por PCR (Tabela S1) foram concebidos para a sequência genómica ponto de interrupção, tal como identificada por nfuse, utilizando a mesma abordagem tal como acima descrito para os ensaios de RT-PCR. Vinte e uma linhas de células de CRC HCT116, incluindo, foram testados para o ponto de interrupção genómico identificado utilizando 100 ng de ADN como entrada para cada reacção. O seguinte protocolo de ciclismo foi utilizado para a PCR genómico: 15 minutos de activação da polimerase de ADN HotStarTaq a 95 ° C, um ciclo de três etapas (repetido 35 vezes) de desnaturação durante 30 segundos a 95 ° C, hibridação do iniciador durante um minuto e 15 segundos a 60 ° C e extensão durante um minuto a 72 ° C. Após o último ciclo, uma etapa de extens final foi realizada a 72 ° C durante 6 minutos. Os produtos de PCR foram separados por electroforese a 200 V durante 30 minutos num gel de agarose a 2% e visualizados utilizando brometo de etídio e luz ultravioleta.

Resultados

RP11-57H14.3

é um romance fusão Parceiro no

TCF7L2

de fusão contendo transcrições

RNA-end emparelhado

para procurar o

VTI1A-TCF7L2

parceiros de fusão e de fusão romance, analisamos -sequencing dados de oito linhas celulares de cancro do cólon e dezesseis amostras de tecido normal de locais anatômicos diversos. Ao aplicar a desarmar software, foram identificados entre 16 e 1050 transcrições de fusão potenciais por amostra. A partir de dados de sequenciamento de genomas inteiros de linhas celulares de cancro do cólon quatro, o software nfuse identificadas entre 70 e 126 potenciais pontos de interrupção genômicos. De todas as fusões identificados, apenas NCI-H508 abrigava o

VTI1A-TCF7L2

transcrição de fusão, com um único ponto de interrupção abrangendo desde exão dois em

VTI1A

ao exão seis em

TCF7L2

, como já relatado para esta linha celular por Bass et al. [1]. No entanto, identificamos um ponto de interrupção genômica (chr10:114,850,371-114,640,318 (GRCh37)) na linha celular HCT116 CRC que se estendeu desde a região intrônica de

TCF7L2

para montante de

RP11-57H14.3

(ENSG00000225292) com uma fusão ARN correspondente (Tabela 1).

RP11-57H14.3

está localizado na região intergénica entre

VTI1A

e

TCF7L2

aproximadamente 44 kb a montante do

TCF7L2

. Os pontos de interrupção genómicas preditas se correlacionam com o aumento da cobertura genómico na região entre elas, sugerindo uma duplicação genómico causando a fusão (Figura 1). Tanto a genômica breakpoint e fusão transcrito entre

TCF7L2

e

RP11-57H14.3

foram verificadas por PCR e RT-PCR. O ponto de interrupção genómico identificado foi verificada na linha de células HCT116, mas não foi detectado em qualquer dos outros 20 linhas celulares testadas, reduzindo assim a probabilidade de que o ponto de interrupção genómico reflecte um ADN comum polimorfismo do número de cópias.

Três ARN quimérico sequence-lê mediu o ponto de interrupção transcrição de fusão, passando de exão 4 de

TCF7L2

(ENST00000369395) ao exão 3 de

RP11-57H14.3

(ENST00000428766), no cromossomo 10. as cores escuras indicam exons que não fazem parte da transcrição de fusão. níveis de cobertura de ADN-seq RNA-seq expressão e são baseados em dados de sequenciamento da linha celular HCT116. Os dois loci de genes estão marcados em caixas azuis e vermelhas. A sequência genómica ponto de interrupção como identificado por nfuse na linha celular HCT116 do CRC é dada; abrangendo desde a região intrônica de

TCF7L2

para montante de

RP11-57H14.3

. As coordenadas do ponto de interrupção (chr10:114,850,371-114,640,318 (GRCh37)) são marcados no eixo posição cromossomo. A localização do ponto de interrupção correlaciona-se bem com o aumento da cobertura genômica visto a partir dos dados de sequenciamento de genomas.

alta prevalência de

TCF7L2

-involving Fusão Transcrições, ambos envolvendo

VTI1A Comprar e

RP11-57H14.3

Genes

Usando os mesmos iniciadores, como descrito por Bass et al. [1] (Figura 2), detectamos

VTI1A-TCF7L2

transcrições de fusão com diferentes combinações exão-exão em 45 de 106 amostras de CRC (42%) (Tabela 2). transcrições de fusão foram também detectados a partir de 4 de 14 amostras de mucosa de cólon normais. Das 14 amostras de tumores do normal emparelhado, oito pares foram positivos exclusivamente no tumor, três pares foram positivos em ambos tumor e normal, e um par positivo exclusivamente em indivíduos normais (Tabela 3). Prevalência de transcrições de fusão foi similar em tumores estáveis ​​e instáveis ​​microssatélites. Dez de 21 linhas de células, incluindo NCI-H508, abrigado transcrições de fusão de diferentes tamanhos. Finalmente, cinco amostras de tecido normal de diferentes sítios anatômicos do corpo expressa as transcrições de fusão (Tabela S2). Porque os resultados de RT-PCR revelou resultados inconsistentes (Figura S1 e S2 Figura), realizamos todos RT-PCR em triplicado, com parâmetros idênticos, para investigar a recorrência de transcrições de fusão (Tabela S3). transcrições de fusão só foram detectados de forma consistente em todas as três corridas em quatro amostras; três amostras de tumor e da linha celular NCI-H508 (3,1% de todas as amostras e linhas celulares de CRC). Esta frequência é similar à frequência originalmente identificado de

VTI1A-TCF7L2

transcrições (3%) por Bass et al. [1].

Todos os três genes estão localizados dentro de 720

VTI1A,

ENST00000428766 em

RP11-57H14.3 Comprar e ENST00000369395 em

TCF7L2

. Além disso, os ensaios de PCR aninhados utilizados para a detecção de ambos os transcritos de fusão são mostrados. As setas vermelhas e pretas representam os primeiros e segundo turnos primers utilizados, respectivamente.

detectadas TCF7L2-RP11-57H14.3

transcrições de fusão com diferentes combinações exão-exão em 48 de 106 amostras de CRC (45%; tabela 2). Das 14 amostras de tumores do normal emparelhado, cinco pares foram positivos exclusivamente no tumor, e quatro pares foram positivas em ambos os tumores e normais (Tabela 3). 19 de 21 linhas celulares, abrigado transcrições de fusão de diferentes tamanhos. Além disso, 15 dos 20 amostras de tecidos normais foram positivos para transcrições de fusão (Tabela S2). Tal como acontece com o

VTI1A-TCF7L2

fusão, realizamos todos RT-PCR em triplicado para investigar a recorrência de transcrições de fusão (Tabela S3). No total, foram 20 amostras que repetidamente testaram positivo para transcrições de fusão; seis amostras de tumor, cinco amostras de tecidos normais e nove linhas celulares (incluindo a linha celular HCT116). Curiosamente, a linha celular NCI-H508 foi negativo para

TCF7L2-RP11-57H14.3

transcrições de fusão em todos os três repetições.

Nós não encontraram correlação entre CRCs positivos para

TCF7L2

contendo transcrições de fusão envolvendo

VTI1A

e

RP11-57H14.3

(p = 0,33, teste exato de Fisher). Além disso, as frequências de transcrições de fusão não foram significativamente diferentes entre microssatélite instável

vs. Tumores

estáveis, nem entre os estágios clínicos (dados não mostrados).

Todos os nested-PCR replica para ambos os ensaios contidos negativos nenhum controle modelo. Estas reacções de controlo negativo nunca produziu detectáveis ​​produtos de PCR (Figura S1 e S2).

quiméricos Sequências geralmente cobertos intactas exônico Splice Sites dos genes parceiros

A partir de uma das RT-PCR é executado, todas as amostras que foram positivas para as fusões e tinham um único produto PCR foram selecionados para Sanger-sequenciação dos quiméricos RNA-sequências para identificar os pontos de interrupção exatas. Para

VTI1A-TCF7L2

(n = 25), obteve-se as sequências de todos os 25 dessas transcrições isolado fusão produtos de RT-PCR, onde 24 dos 25 tiveram sequências de ligação sequências a montante dos exons 1, 2, 3, 5 ou 7 de

VTI1A

às sequências a jusante dos exons 4 ou 6 do

TCF7L2

, com a preservação das mesmas fronteiras exão-exão como nas estruturas de genes já anotados (ENST00000393077 em

VTI1A Comprar e ENST00000369395 em

TCF7L2

). Um produto sequenciado não continha fronteiras exão-exão claras, mas conectou os dois transcritos no meio do exão 7 em

VTI1A Comprar e 6 em

TCF7L2

. No total, sete pontos de interrupção de fusão diferentes foram identificados (Tabela S3), incluindo o ponto de interrupção original entre o exão 2 de

VTI1A Comprar e exão 6 de

TCF7L2

em NCI-H508 (Figura 3) [1] . Este ponto de interrupção exata não foi encontrado em nenhuma das outras amostras, mas a maioria das transcrições de fusão intactas consistiu na mesma parte do

TCF7L2

(n = 17), com alguns tendo exão 4 de

TCF7L2

unidas ao exão 6 (n = 7). O

VTI1A

contribuição a montante variou mais, tendo cinco diferentes combinações de ligação a jusante

TCF7L2

partes.

seqüenciamento Sanger confirmou a transcrição original fusão descoberto em NCI-H508, mostrando a sequência breakpoint abrangendo junções exão-exão entre exon 2 em

VTI1A Comprar e exão 6 em

TCF7L2

. Bass et ai. também descobriu outros três transcrições de fusão por nested-PCR. No entanto, como anotação transcrição não foi suficientemente descrita, não somos capazes de dizer se estas fusões são idênticas a algumas das transcrições que identificamos.

Para

TCF7L2-RP11-57H14.3

(n = 27), obteve-se as sequências de todos os 27 isolados de fusão de transcrição produtos de RT-PCR, onde 26 dos 27 tiveram sequências de ligação sequências de exão 4 de

TCF7L2

a sequências de exons 1, 2 , ou 3 de

RP11-57H14.3

, também com a preservação dos mesmos limites exão-exão como nas estruturas dos genes já anotado (numeração exão é o mesmo que acima para

TCF7L2 e

de acordo com ENST00000428766 para

RP11-57H14.3

). Um caso curioso da sequência quimérica, identificado na linha de células CRC FRI, era uma transcrição de fusão ao longo de três genes em uma ordem genômica não-canônico, juntando-se

TCF7L2

exão 4 com

VTI1A

exons 5 , 6, e 7, e que se estende ainda mais para

RP11-57H14.3

os exões 1, 2 e 3. além disso, neste caso, os mesmos limites único exão-exão foram usadas como nas estruturas dos genes já descritos anotados acima. No total, foram identificados quatro transcrições de fusão diferentes envolvendo

TCF7L2-RP11-57H14.3,

todas ocorrendo em várias amostras de cada um.

Discussão

Nós temos no presente relatório identificaram o gene

RP11-57H14. Sims 3 como um parceiro de fusão da novela para

TCF7L2

no CRC. Por sensível nested RT-PCR, que revelaram que ambos os

VTI1A-TCF7L2

transcrições de fusão previamente relatados, bem como a aqui identificado

TCF7L2-RP11-57H14.3

, são altamente freqüente entre os CRCs , embora expresso a níveis muito baixos. Nós também detectada expressão dos transcritos de fusão em mucosa de cólon normal, bem como em tecidos normais de outros locais anatómicos. Triplicado nested-PCR para investigar a presença de

TCF7L2

transcrições de fusão envolvendo mostrou resultados variáveis, com algumas amostras inicialmente testar positivo para uma transcrição de fusão, mas negativa ao executar uma corrida consecutiva, ou

vice-versa

. No entanto, seqüenciamento Sanger resultou na confirmação do exão limpo ao exão junções de ponto de interrupção, reduzindo a probabilidade de que os artefatos de PCR, como a comutação modelo de polimerase [17], como causa para a inconsistência. Os controlos negativos foram realizados igualmente em todas as etapas de RT-PCR, incluindo a síntese de cDNA, primeiro ciclo de PCR-nested-PCR e. Nenhum dos controlos negativos resultaram em produtos detectáveis, apoiando que a elevada frequência de transcrições de fusão observado não é um resultado da contaminação por PCR (Figura S1 e S2 Figura). Embora as transcrições de fusão foram encontrados em alta freqüência dentro dos materiais biobanco testados, a identificação de

TCF7L2

molecular contendo fusões a partir de dados de sequenciação de todo o transcriptoma foi só sucesso das duas linhas celulares combinando com pontos de interrupção genômicos. Estas duas linhas de células que assim têm consistentemente forte expressão das transcrições de fusão, como eles produziram resultados de RT-PCR consistentes e claros em todas as repetições. Com base nestes resultados, sugerimos que as transcrições de fusão produzido entre

TCF7L2

e ou

VTI1A

ou

RP11-57H14.3

são expressos em níveis baixos em amostras de tumor, e algumas amostras de indivíduos normais. A presença de transcrições de fusão expressas em níveis baixos são consistentes com três transcrições de fusão que recentemente identificados na CRC, onde

AKAP13-PDE8A, COMMD10-AP3S1,

e

CTB-35F21.1-PSD2

foram identificados em 17-58% de 106 tecidos de cancro primário [12].

Todos os três genes parceiros estão localizados no braço longo do cromossoma 10, dentro de 721 kpb, e são lidos a partir da mesma cadeia na fim

VTI1A, RP11-57H14.3, TCF7L2

(Figura 2). Isto sugere ARN polimerase read-through como um mecanismo potencial para gerar o

VTI1A-TCF7L2

transcritos na ausência de um ponto de interrupção genómico correspondente. Vários relatórios demonstraram que os genes em estreita proximidade no genoma humano são expressos como genes conjugados, também chamados quimeras em tandem, transcrições que são combinados de, pelo menos, parte de um exão a partir de dois ou mais genes distintos que se encontram no mesmo cromossoma [18] – [20]. Tem sido sugerido que a expressão de genes conjugados aumentar a complexidade do genoma humano, traduzindo em proteínas distintas, ou que estes transcritos desempenhar um papel na regulação dos níveis de transcritos canónicas. Um mecanismo sugerido para a sua geração é que a maquinaria de transcrição evita o sinal de terminação do gene a montante e continua a transcrição do gene a jusante antes de terminar no sinal de terminação a jusante [19], [21]. A maioria dos genes ligados são acredita-se ser expressa em níveis baixos, uma vez que são muitas vezes suportada por apenas uma única etiqueta expressas sequência ou sequência de ARNm em bases de dados de genoma, o que está de acordo com as nossas observações de fracamente expresso

TCF7L2

molecular contendo transcrições de fusão em CRC.

a geração de

VTI1A-TCF7L2

transcritos pode muito bem ser explicada como um produto de polimerase read-through, mas isto não pode ser o mecanismo de operação para o

TCF7L2-RP11-57H14.3

transcrições de fusão. Neste caso, os exons de

TCF7L2

e

RP11-57H14.3 Quais são emendados em uma ordem genômica não-canônico usando consenso emenda-sites. Este mecanismo de transcrição foi previamente descrita por Nigro et ai. como exão lutando; um processo em que os exões estão unidos com exactidão em locais de splicing de consenso, mas por uma ordem diferente do que se encontra presente no transcrito primário [22]. Eles descobriram este fenômeno quando se investiga um gene supressor de tumor candidato (

DCC

), e identificou-se que as transcrições resultantes mexidos são expressos e encontrou em níveis relativamente baixos, tanto em células normais e neoplásicas. Recentemente, com base na sequenciação de ARN profunda, foram identificados transcritos tais mexidos de centenas de genes [23]. Este grupo também sugeriu que uma fracção substancial dos transcritos de ARN são mexidos circulares, que explicam a junção de exões numa ordem linear não-canónica. Eles também descobriram que muitas das isoformas circulares estavam presentes em níveis comparáveis ​​com os seus homólogos lineares canônicos.

No total, estes níveis adicionais de complexidade da transcrição e genômica está em linha com o recente relatório do projeto ENCODE, relatando substancial redução dos comprimentos de regiões intergênicas, e cada vez mais sobreposição de genes que anteriormente se presumia ser distintos loci genéticos, por completo levando a uma redefinição do conceito de um gene [24].

a identificação de pontos de interrupção genômicas em linhas de células individuais para

TCF7L2

fusões ambos envolvendo

VTI1A

e

RP11-57H14.3

, é intrigante. Os pontos de interrupção genômicas identificadas coincidem bem com as transcrições de fusão frequentemente observadas descobertos em outras amostras que não têm esses rearranjos genômicos. Para as linhas de células com pontos de interrupção genómicos identificados, as transcrições de fusão foram detectados em níveis fortes em todos RT-PCR replica, o que sugere que estas células expressam os transcritos de fusão em níveis mais elevados. Além disso, a linha de células com

VTI1A-TCF7L2

fusão genômica (NCI-H508) foi negativo para o

TCF7L2-RP11-57H14.3

transcrições de fusão em todas as repetições, apoiando a ~540 kb deleção genómica da região intergénica entre

VTI1A

e

TCF7L2

originalmente identificado por Bass et al.

a presença de transcrições de fusão em ambas as células normais e amostras de CRC, juntamente com identificação de pontos de interrupção genômicas de linhas celulares de cancro individuais, juntando-se os mesmos dois genes no nível do genoma, estão em linha com o relatório da fusão transcrito

JAZF1-JJAZ1

identificados em ambas as células estromais endometriais normais e tumores estromais endometriais [25].

JAZF1-JJAZ1

é detectável no nível de transcrição em células normais do estroma mas rearranjos genômicos endometrial são encontrados apenas nas células neoplásicas. Li et al. a hipótese de que o trans-splicing gerar estas transcrições de fusão, bem como outras transcrições de fusão, podem ocorrer regularmente em células e tecidos normais. Além disso, eles sugerem que pode haver uma ligação entre o trans-splicing gerar estas transcrições de fusão e a geração dos rearranjos genómicos [26]. Os rearranjos genómicos ou outros mecanismos podem levar a sobre-expressão destes transcritos de fusão, que pode ter potencial oncogénico.

A importância do gene da

TCF7L2

em desenvolvimento CRC é favorecida pela sua função.

TCF7L2

codifica o factor de transcrição TCF4, que é um factor de transcrição chave a jusante na via de /β-catenina de sinalização de WNT, alterada na maioria dos CRCs [5]. O relatório original de

VTI1A-TCF7L2, achou que a depleção do transcrito de fusão resultaram em perda significativa de crescimento independente de ancoragem na linha celular positiva fusão CRC NCI-H508 [1]. mutações freqüentes em um trato polyadenine dentro do

gene TCF7L2

foram relatados anteriormente para CRC, especialmente em tumores instáveis ​​microssatélites [6]. Além disso, os tumores estáveis ​​microssatélites foram recentemente mostrado para abrigar mutações frequentes em

TCF7L2

[7]. A observação de que

TCF7L2

transcrições de fusão envolvendo são detectáveis ​​em uma grande fração tão grande de amostras de CRC, mas também mucosa do cólon e outros tipos de tecidos normais normal, revela que o

TCF7L2

transcrições de fusão não são nem específico ao câncer, nem para o cólon e reto. Por isso, eles não têm o potencial como biomarcadores de detecção de câncer, como previsto inicialmente.