Abstract

hipoxia tumor com expressão desregulada do fator de hipóxia induzir (HIF) e sua conseqüência biológica leva a mau prognóstico dos pacientes diagnosticados com tumores sólidos, resultando em maior mortalidade, sugerindo que a compreensão da relação molecular de hipóxia com outras características celulares da agressividade do tumor seria inestimável para o desenvolvimento de terapia-alvo mais recente para tumores sólidos. Emergindo evidência também sugere que a hipoxia e HIF vias de sinalização contribui para a aquisição de funções epiteliais-se mesenquimais transição (EMT), manutenção de células estaminais do cancro (CSC), e também mantém o ciclo vicioso de inflamação, os quais contribuem para a radiação A terapia e a resistência à quimioterapia. No entanto, os mecanismos de execução pelo hipóxia /HIF dirigem estes eventos não são totalmente compreendidos. Aqui, demonstramos que a hipóxia leva ao aumento da expressão do VEGF, IL-6, e genes marcadores CSC, como Nanog, Oct4 e EZH2, e também aumentou a expressão de miR-21, um miARN oncogénica, no cancro da próstata (CaP) células (PC-3 e LNCaP). O tratamento de células APC com CDF, um novo análogo sintético derivado de curcumina mostrou anteriormente actividade anti-tumoral

In vivo

, inibiu as produções de VEGF e de IL-6, e regulados negativamente a expressão de Nanog, Oct4 , EZH2 ARNm, assim como o miR-21 sob condições hipóxicas. Além disso, o tratamento de células CDF CaP levaram a uma diminuição da migração de células sob condições hipóxicas. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o efeito anti-tumoral de CDF é em parte mediada através da desregulação de vias de tumor hipóxicas, e, assim, CDF pode tornar-se útil para a terapia do cancro

citação:. Bao B, Ahmad A, Kong D, Ali S, Azmi AS, Li Y, et al. (2012) de hipóxia induzida Agressividade de células cancerosas da próstata está relacionada com a expressão desregulada de VEGF, IL-6 e miRNAs Isso são atenuados pela CDF. PLoS ONE 7 (8): e43726. doi: 10.1371 /journal.pone.0043726

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de junho de 2012; Aceite: 23 de julho de 2012; Publicação: 27 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Bao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores obrigado Puschelberg e Guido Fundações para a sua contribuição financeira generosa. Conceder o apoio do Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde concede 5R01CA131151, 5R01CA132794 e 1R01CA154321 (ESF) e do Departamento de Defesa Exploração-Hipótese de Desenvolvimento Award PC101482 (BB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro da próstata (PCA) é o câncer mais comumente diagnosticado em homens e é a segunda principal causa de morte por câncer nos EUA [1]. A maioria dos pacientes CaP são tratáveis, mas os pacientes geralmente morrem devido à resistência aos medicamentos e doença metastática. Assim, existe uma grande necessidade para o desenvolvimento de novas estratégias de que a resistência aos medicamentos e doença metastática podem ser controlados com novos agentes que possam melhorar o resultado do tratamento. A hipoxia é um dos fenómenos biológicos fundamentais que são intrinsecamente associadas com o desenvolvimento e a agressividade de uma variedade de tumores sólidos, incluindo CaP. factores hypoxia-inducible (HIF) funcionam como um factor de mestre de transcrição, que regula os genes que respondem a hipoxia e foram reconhecidos para desempenhar papéis críticos na invasão tumoral, resistência quimio-radiação, e o aumento da proliferação celular, sobrevivência, angiogénese e metástase [2]; [3]. Portanto, hipoxia tumor com expressão desregulamentado de HIF e sua conseqüência biológica leva a mau prognóstico dos pacientes diagnosticados com tumores sólidos, resultando em maior mortalidade, sugerindo que a compreensão da relação molecular de hipóxia com outras características celulares da agressividade do tumor seria inestimável para o desenvolvimento terapia alvo mais recente para tumores sólidos.

tem sido bem reconhecido que as células estaminais do cancro (CSCs) e epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) células fenotípicas estão associadas à resistência à terapêutica e contribui para o crescimento do tumor agressivo, invasão e metástases, e acredita-se ser a causa de reincidência do tumor [4]. Emergindo evidências sugerem que a hipoxia e via de HIF melhorar os fenótipos e funções de CSCs e EMT [5] – [9], que contribui para a agressividade do tumor, o que pode também ser devido a uma desregulação de microRNAs (miRNAs). Os miARNs são conhecidos por desempenhar papéis críticos numa grande variedade de processos biológicos, incluindo a diferenciação celular, proliferação, morte celular, no metabolismo e na homeostase de energia [10]; [11]. evidências acumuladas sugerem que miARN pode ter um papel importante no desenvolvimento e progressão de tumores. A expressão alterada de pequenos RNAs tem sido associado com prognóstico clínico do tumor, resistência à terapia quimio-radiação, e a recorrência de tumores [12] – [14]. Um grande número de miARNs têm sido relatados para ser sensível à hipoxia e via de HIF numa vasta gama de células e tecidos, incluindo células cancerosas [15] – [18]. Tem sido relatado que as causas de hipoxia diminuição da expressão de miR-101, um potencial anti-oncogénica miARN, e aumento da expressão de miR-21 e miR-210, miARNs oncogénicas em vários cancros, incluindo o CaP [13]; [19]. Assim, a desregulação mediada por hipoxia da miARNs podem desempenhar papéis importantes na agressividade do tumor mediado pela regulação das vias de sinalização celular, incluindo via de HIF. Portanto, visando esses miRNAs mediada por hipoxia utilizando novos agentes pode fornecer estratégia terapêutica inovadora para a prevenção e /ou tratamento de CaP.

Aqui, nós examinamos os efeitos da hipóxia sobre a migração celular, invasão, angiogênese e a expressão do VEGF, IL-6, os genes CSC, e miR-21 e miR-210 em células CaP sob condição hipóxica. Nós também investigou o papel de miR-21 na regulação da expressão de VEGF, IL-6, genes marcadores CSC, e sua associação com a formação de prostaspheres em células CaP em condições de hipóxia. Além disso, foram examinados os efeitos de um novo análogo sintético derivado de curcumina (CDF) que mostrou actividade anti-tumor com uma maior biodisponibilidade do tecido sistémica e alvo, sobre a sobrevivência de células, migração, invasão, angiogénese, formação de prostaspheres, e a expressão de HIF-1α, VEGF, IL-6, genes marcadores, e CSC miARNs em células CaP sob condições hipóxicas. Descobrimos que a hipoxia levou ao aumento da expressão do VEGF, IL-6, e genes marcadores, tais como CSC Nanog, Oct4 e EZH2, e também aumentou a expressão de miR-21 em células humanas de CaP. O tratamento de células com CDF inibiu as produções de VEGF e de IL-6, e regulados negativamente a expressão de Nanog, Oct4 e EZH2 ARNm, assim como o miR-21 nestas células sob condições hipóxicas. CDF também diminuiu a migração de células de células CaP sob condição hipóxica. A partir destes resultados, podemos concluir que o efeito anti-tumoral de CDF é em parte mediada através da desregulamentação das vias de sinalização de hipoxia tumor.

Materiais e Métodos

cultura de células, medicamentos e reagentes

próstata linhas celulares de cancro humano PC-3 e LNCaP foram mantidas sob condições de cultura padrão (21% de O

2 e 5% de CO

2, 37 ° C). Hipóxico (1% O

2) e 5% de CO

2 condições foram gerados através do controlo dos caudais de entrada de azoto e dióxido de carbono, respectivamente, na incubadora de cultura. Todas as linhas celulares foram mantidas em 10% de meio de FBS-RPMI-1640 sob condições de cultura de células padrão. CDF foi sintetizado como descrito nas nossas publicações anteriores [20]; [21].

celular Ensaio de sobrevivência

De forma a investigar o efeito de CDF sobre a sobrevivência celular nas células CaP humanos sob condição hipóxica, ensaio de MTT foi realizado usando CaP humana (PC-3 e LNCaP) células. 3000 células foram semeadas em cada poço das placas de 96 poços e incubou-se a condições de cultura padrão (21% de O

2 e 5% de CO

2) durante a noite. As células foram então tratadas com diferentes concentrações de CDF (0,5 uM) e incubou-se durante 8 h sob condições hipóxicas seguido por 16 h sob condições normóxicas cada dia. Após 3 dias de tratamento, as células foram colhidas para o ensaio de MTT padrão, como descrito nas nossas publicações anteriores [22]; [23]. Cada experiência foi realizada em quatro repetições e repetido duas vezes de forma independente.

Ensaio clonogénico

ensaio clonogénico foi realizado para examinar o efeito de CDF no crescimento celular de células CaP sob condições hipóxicas, como descrito anteriormente [ ,,,0],22]. Resumidamente, 5 x 10

4 células foram plaqueadas numa placa de seis poços e após 3 dias de exposição a 0,5 uM de CDF (8 h de condição hipóxica e 16 h de condições normóxicas cada dia), as células foram tripsinizadas, e 1.000 células viáveis ​​individuais foram plaqueados em placas de Petri de 100 mm. As células foram então incubadas durante 10 a 12 dias a 37 ° C em 5% de CO

2/5% de ó

2/90% N

2 incubadora. As colónias foram coradas com violeta de cristal a 2%, lava-se com água, e contadas. Cada experimento foi conduzido em três repetições e repetido duas vezes de forma independente.

Invasion Ensaio

O

in vitro

ensaio de invasão de células ACP foi conduzido sob condições de hipóxia usando Costar Transwell 24 Bem-placas com membrana de policarbonato (Corning Incorporated, Corning, NY), como descrito anteriormente [23]. Resumidamente, 4 × 10

4 de células cancerosas (PC-3 e LNCaP) expostas a 3 dias de incubação sob normóxica ou condição hipóxica foram semeadas em cada poço das placas Transwell pré-revestidas de Matrigel. Os poços de fundo do sistema foram cheios com meio completo. Após 20 h de incubação, quer na ausência ou na presença de CDF (0,5 uM), as células cancerosas invadiram foram coradas com 4 ug /ml de calceina-AM (Invitrogen) em solução de PBS a 37 ° C durante 1 h, seguindo o fabricante de manual. As fotografias foram tiradas com um microscópio fluorescente. Cada experimento foi conduzido em três repetições e repetido duas vezes de forma independente.

Wound ensaio de cura Cura Ensaio

A fim de examinar o efeito do CDF sobre a migração celular de células CaP sob condição hipóxica, realizamos ferida , tal como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, quando as células PC-3 tornaram-se 90-95% confluentes, a ferida foi gerado por arranhando a superfície das placas com uma ponta de pipeta. As células foram em seguida incubadas na ausência e na presença de CDF (0,5? M) e foram cultivadas sob condições hipóxicas durante 4 h, seguido de 16 h de condições de normóxia e depois fotografadas com um microscópio Nikon Eclipse TS100, como descrito anteriormente [23] . Cada experimento foi conduzido em três repetições e repetido duas vezes de forma independente.

tubo de formação Ensaio

A fim de examinar o efeito do CDF sobre a angiogênese

in vitro

em células endoteliais vasculares sob condição hipóxica, realizamos ensaio de formao de tubo, como descrito anteriormente [25]; [26]. Resumidamente, 3 × 10

4 coelho células endoteliais vasculares foram semeadas em cada poço da placa de 96 poços de Matrigel-pré-revestido em 100 uL de meio com FBS-DMEM a 10%, e exposto a condições de normóxia ou hipóxia durante 4 h de incubação a 37 ° C, seguido de 16 h de condições de normóxia. A fotografia foi tirada em 4 h e 20 h, respectivamente. Cada experiência foi repetida duas vezes de forma independente.

A expressão de VEGF e de IL-6

ELISA foi realizado para examinar o efeito de CDF no a expressão induzida por hipoxia de VEGF e IL-6 em células APC. O meio de cultura a partir de células de CaP sob condições de hipóxia ou de normóxia durante 16 h foram colhidas para a medição do VEGF e IL-6 pelo uso de kits de ELISA (R D Systems), seguindo o manual do fabricante. Cada experimento foi conduzido em três repetições e repetido duas vezes de forma independente.

Formação Sphere Ensaio

O ensaio de formação de esfera foi realizado para examinar o efeito da CDF sobre a capacidade de auto-renovação CSC de células CaP sob condições hipóxicas, como descrito anteriormente [23]. Resumidamente, suspensões de células únicas de células de CaP foram plaqueadas em poços de ultra baixa aderentes de uma placa de 6 poços (Corning, Lowell, MA) a 1000 células /poço em meio de formação de esfera (01:01 meio DMEM /F12 suplementado com B-27 e N-2 (Invitrogen), e exposto a condição hipóxica em dias alternados. Depois de 7 dias, as esferas denominado como “prostaspheres” foram recolhidos por centrifugação (300 x g durante 5 min), e contadas. a percentagem de esfera geradora células foi calculado dividindo-se o número de prostaspheres ao número de células semeadas com o diâmetro maior que 50 μmeters. Cada experiência foi realizada em três repetições e repetido duas vezes de forma independente.

a imunocoloração Ensaio e Microscopia confocal

suspensões de células únicas de células de CaP foram plaqueadas em ultra-poços de baixo aderentes da placa de 6 poços (Corning, Lowell, MA) a 10000 células /poço em meio de esfera-formação, e incubadas durante 24 h seguida por cultura sob condições hipóxicas todos outro dia, tal como descrito acima. Depois de 7 dias de tratamento com droga, 3 poços das prostaspheres em cada grupo de tratamento foram reunidas e recolhidas por centrifugação (300 x g durante 5 min), lavadas com 1 x PBS, e fixado com 3,7% parformaldehyde durante 10 min à temperatura ambiente. Monoclonal de CD44 e anticorpos EpCAM (Cell Signaling) foram usadas para a imunocoloração de ensaio, seguindo o protocolo do fabricante, como previamente descrito [24]; [27]. Os prostaspheres CD44 ou EpCAM rotulados foram fotografados sob uma Nikon ESLIPSE E800 com ampliação de 100x. A microscopia confocal (Leica TCS SP5) foi realizado nas instalações MIRL Core, Escola de Medicina da Universidade de Wayne State. Cada experiência foi repetida duas vezes de forma independente.

transientes e Transfecção estável de células APC com o ADNc e miARNs

As transfecções de ADNc e miARNs foram realizadas usando o reagente de transfecção ExGen 500 (Fermentas, Alemanha) e DharmaFECT Transfection Reagent (Dharmacon), respectivamente, nos manuais seguintes dos fabricantes, como descrito anteriormente [24]. A transfecção estável de ADNc foram realizadas sob a selecção de meio contendo G418 (Sigma) e verificado por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente [25]. Cada experimento foi repetido duas vezes de forma independente.

Extração de proteínas e Western Blot Analysis

análise de Western blot foi realizada para medir os níveis relativos de proteína HIF-1α em células CaP em condições de hipóxia. Os lisados ​​de células totais das células expostas a 16 horas de condição hipóxica foram obtidos por lise das células em tampão de lise contendo proteína mM de Tris-HCl a 50, NaCl 150 mM, NP-40 a 1%, 0,1% de SDS, 0,5% de desoxicolato de sódio, 2 fluoreto de sódio mM, Na 2 mM de

3VO4

2, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, e 1 × protease cocktail inibidor (Roche Diagnostics, Alemanha), e transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [24], e a intensidade do sinal foi medido utilizando o sistema de detecção quimioluminescente (Pierce Rockford, IL). Cada experiência foi repetida duas vezes de forma independente.

em tempo real (RT) de Transcriptase Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) para medir a expressão de ARNm e miARNs

Para determinar a expressão de mRNA, dois microgramas foram usadas de ARN total extraído de cada amostra para a reacção de RT em 20 uL de volume de reacção usando um sistema de transcrição inversa (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Kit de Ensaio de SYBR Green (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) foi utilizado para a reacção de PCR em tempo real, utilizando AB StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems), seguindo o protocolo do fabricante. As sequências de iniciadores de PCR foram descritos anteriormente [23]. Os dados foram analisados ​​usando C

método T e foram normalizadas pela expressão de GAPDH em cada amostra. Para determinar a expressão de miARN nas células, o kit TaqMan MicroRNA Ensaio (Applied Biosystems) foi utilizado seguindo o protocolo do fabricante. O ARN total foi extraído a partir das células e 5 ng de RNA foi transcrito de forma inversa tal como descrito anteriormente [28]. Os iniciadores foram obtidos a partir de miARN Systems AB. As reacções de PCR em tempo real foram, em seguida, levada a cabo num volume total de mistura reaccional de 10 ul, como descrito anteriormente [24], usando StepOnePlus Tempo real PCR System (AB Systems). Os dados foram analisados ​​usando C

método T e foram normalizadas pela expressão RNU48 em cada amostra. Cada experimento foi conduzido em três repetições e repetido duas vezes independentemente

luciferase Reporter Gene Assay

A fim de examinar o efeito do CDF ou deficiência miR-21 na actividade de ligação de miR-21 para 3 ‘. -UTR em células CaP sob condição hipóxica, realizamos ensaio de gene repórter de luciferase de miR-21 mediada por células PC-3 utilizando o vector de miR-21-mediada de gene repórter de luciferase (Signosis, Sunnyvale, CA), em que o miR-21 obrigatório ao seu local de ligação de ADN no vector de gene da luciferase suprime a actividade de luciferase. Resumidamente, 10

4 células PC-3 foram semeadas em cada poço das placas de 96 poços, e incubadas durante a noite a condição de cultura padrão. As células foram então transfectadas com o vector de gene repórter de luciferase de miR-21-suprimidos (Signosis, Sunnyvale, CA) usando ExGen 500 Transfection Reagent (Fermentas, Alemanha) ou co-transfectadas com o vector de luciferase e anti-miR-21 usando DharmaFECT reagente de transfecção (Dharmacon) seguindo o protocolo do fabricante, como acima descrito. Depois de transfecção durante a noite, os transfectantes foram tratados com CDF por mais 20 h sob condições de cultura padrão, e expostas a 4 h de condição hipóxica. Finalmente, os transfectantes foram colhidas para ensaio da actividade da luciferase utilizando Luciferase Assay System (Promega), seguindo o manual do fabricante. Cada experimento foi repetido duas vezes de forma independente.

Métodos Estatísticos

As comparações dos resultados do tratamento foram testados para a diferença significativa pelo

t

pareado. A significância estatística foi assumida em um

valor P

inferior a 0,05.

Resultados

Efeito da CDF na célula de sobrevivência e clonogenicidade de células CaP Sob hipóxica Condição

Os dados do ensaio de MTT indicam que CDF sobrevivência significativamente inibida celular de células LNCaP de PC-3 e sob condições de hipoxia em uma maneira dependente da dose (Figura 1A). tratamento CDF também diminuiu clonogenicidade de células LNCaP PC-3 e sob condições hipóxicas (Figura 1B). Estes achados sugerem que CDF pode inibir a sobrevivência das células e crescimento de células clonogénicas CaP sob condições hipóxicas.

A painéis A, B, e C representam os dados de sobrevivência celular, clonogenicidade, e análise de Western blot, respectivamente. As barras nas figuras indicam desvio padrão de n = 4.

Efeito da CDF em Proteína HIF-1α e as produções de VEGF e IL-6 em células CaP Sob hipóxica Condição

Como se mostra na Figura 1C, o tratamento CDF diminuiu o nível relativo de HIF-1α em células LNCaP de PC-3 e sob condição hipóxica. As células foram incubadas sob condições de hipóxico levou a um aumento da produção de VEGF, em comparação com as células incubadas sob condições de normóxia (Figura 2). CDF tratamento diminuiu notavelmente a produção de VEGF induzida por hipoxia em células PCA (Figura 2). HIF-1α sobre-expressando células PC-3 revelaram um aumento da produção de VEGF sob condições de hipoxia, em comparação com as suas células paternas PC-3. tratamento CDF também inibiu a produção de VEGF induzida por hipoxia em HIF-1α sobre-expressando células PC-3. Estes resultados sugerem que as células cultivadas sob condições hipóxicas leva ao aumento da produção de IL-6, em comparação com as células incubadas sob condições de normóxia (Figura 2). CDF tratamento diminuiu notavelmente a produção de IL-6 em células de CaP induzida por hipoxia (Figura 2). CDF também diminuiu a produção de IL-6 induzida por hipoxia HIF-1α em que sobre-expressam PC-3 de células (Figura 2).

Os meios condicionados foram recolhidos a partir de células cultivadas em condições de normóxia e de hipóxia como descrito sob os métodos seção. As medições de VEGF e IL-6 foram realizados por ELISA. As barras nas figuras indicam desvio padrão de n = 3.

Efeito da CDF em Angiogenesis

in vitro

em Vascular células endoteliais sob hipóxica Condição

Nossos resultados indicam que as condições hipóxicas aumentou a capacidade de formação de tubos de células endoteliais vasculares em 4 h e 20 h de incubação, respectivamente, em comparação com condições normóxicas. CDF tratamento inibiu a formação do tubo induzida por hipoxia em células endoteliais vasculares (Figura 3A). Para esclarecer se moléculas de CDF-mediadas ou si CDF contribui para a inibição da formação do tubo, que recolhido não CDF-tratados (controlo) e CDF-tratada media Condições de células cancerosas e realizado o ensaio de formação de tubo sob condições normóxicas. Verificou-se que as células endoteliais vasculares incubadas com meio de controlo tinham aumentado condição formação do tubo em 4 h e 20 h, em comparação com as células incubadas com meio condição pré-tratados CDF. A adição de CDF para a condição meios de controlo inibiu significativamente a formação do tubo, em comparação com as células incubadas em meios de controlo e meios de condição condição CDF-pré-tratada (Figura 3B). Estes dados sugerem que se CDF contribui para a inibição da formação do tubo

A painéis A . B, C D, e E representam os dados de angiogénese

In vitro

, a migração de células, e invasão. Tal como descrito na secção de Métodos, angiogénese

in vitro

foi avaliada pelo ensaio de formação de tubo; migração celular foi avaliada por ensaio de cicatrização de feridas; invasão foi avaliada por ensaio de invasão de câmara.

Efeito da CDF sobre a migração celular e invasão

in vitro

em células CaP Sob hipóxica Condição

PC- hipóxia-expostos 3 células tinha aumentado a capacidade de cicatrização de feridas, em comparação com as células cultivadas sob normoxia (Figura 3C). tratamento CDF inibiu a ferida capacidade das células CaP sob condição hipóxica (Figura 3C e D) de cura. Tal como mostrado na Figura 3D, a sobre-expressão de HIF-1α aumentou a ferida capacidade de células PC-3 expostas a 16 horas de cura a condição hipóxica. CDF tratamento inibiu a capacidade de cicatrização de feridas em ambas as células PC-3-HIF-1a que sobre-expressam sob condições hipóxicas (Figura 3D). Estes resultados forneceram dados convincentes indicando que CDF pode inibir a migração celular induzida por hipoxia de células APC, mesmo em células PCA-HIF-1a sobre-expressão. O

in vitro

ensaio de invasão mostra que ambos os PC-3 e LNCaP células expostas à condição hipóxica tinha maior capacidade de invasão, em comparação com as células expostas à condição normóxica (Figura 3E). tratamento CDF inibiu a capacidade de invasão induzido por hipoxia de células APC.

Efeito da CDF em Gene Expression of CSC marcadores e miRNA expressão em células CaP Sob hipóxica Condição

Os dados em tempo real ensaio de RT-PCR indicam que a hipoxia induzida os níveis relativos de Nanog, Oct4 e EZH2 ARNm, bem como o miR-21 e miR-210 em células PC-3 e LNCaP Considerando CDF diminuiu os níveis de Nanog, Oct4 e EZH2 ARNm, bem como miR-21 e miR-210 em células CaP sob condições hipóxicas (Figura 4).

em tempo real de RT-PCR foi realizada, conforme descrito na secção Métodos. As barras nas figuras indicam desvio padrão de n = 3.

Efeito da CDF ou Anti-miR-21 na CSC capacidade de auto-renovação e superfície celular marcadores CD44 e EpCAM em células CaP humana sob hipóxica condição

os dados do ensaio de formação de esfera indicam que o anti-miR-21 diminuiu a formação de prostaspheres de células PC-3 (Figura 5A). Estes dados sugerem que o miR-21 pode desempenhar um papel importante na regulação da capacidade de auto-renovação das células CaP CSC-like. tratamento CDF também decesased a formação de células de prostaspheres CaP sob condições hipóxicas (Figura 5A). Além disso, foi realizada microscopia de imagem confocal para avaliar a expressão de CD44 e de EpCAM nas células formadoras de esfera de células PC-3. Os resultados mostram que o anti-miR-21 diminuiu a expressão de CD44 e de EpCAM em células formadoras de esfera sob condição hipóxica, consistentes com o tratamento CDF (Figura 5B) PC-3. Estes dados sugerem que CDF diminuiu a formação de prostaspheres e a expressão de CD44 e de EpCAM em parte mediada por direccionamento a expressão de miR-21.

Os painéis A e B representam os dados de formação de prostaspheres, os expressão de CD44 e de EpCAM, e a produção de VEGF e de IL-6 na CSC-como células formadoras de esfera de células APC, respectivamente. O ensaio de formação de esfera foi realizado para examinar a capacidade de auto-renovação de células CCC de CaP, como descrito na secção de Métodos. A microscopia confocal foi realizada para medir a expressão de marcadores de superfície CD44 CSC e EpCAM nas células formadoras de esfera a partir de células derivadas de CaP, como descrito na secção de Métodos. As barras nas figuras indicam desvio padrão de n = 3.

Efeito da CDF ou Anti-miR-21 em VEGF e IL-6 Produção nas células Sphere formadoras de PC-3 células sob hipóxico condição

Foi examinado o efeito de CDF no VEGF e IL-6 em produções as células formadoras de esfera de células PC-3 sob condição hipóxica por ensaio de ELISA. Descobrimos que o PC-3 de células formadoras de esfera produzida uma quantidade maior de VEGF sob condições de hipoxia, em comparação com as suas células paternas PC-3 (3.172 pg /ml /10

4 PC-3 de células formadoras de esfera contra 3192 pg /mL /10

6 células PC-3; a Figura 2 e 5C), sugerindo que o PC-3 de células formadoras de esfera possam promover a angiogénese por cima-regulação da expressão de produção de VEGF. Nós também descobrimos que o tratamento CDF diminuição da produção de VEGF induzida por hipoxia em PC-3 de células formadoras de esfera, consistente com os resultados do PC-3 de células formadoras de esfera com inibição condicional de miR-21. Além disso, verificou-se que semelhante a produção de VEGF, as células formadoras de esfera produzida uma quantidade consideravelmente maior de IL-6, em comparação com as suas células paternas (129,3 pg /ml /10

4 PC-3 esfera de formação induzida por hipoxia células vs 457,6 pg /ml /10

6 células PC-3; figura 2 e 5C). CDF tratamento ou deficiência condicional de miR-21 pelo seu inibidor /siARN diminuiu a produção de hipoxia induzida por IL-6 pelas células formadoras de esfera (Figura 5C). Nós também examinou se o tratamento CDF ou deficiência miR-21 poderia regular a expressão gênica de HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, marcadores EpCAM, e EMT em PC-3 células formadoras de esfera sob condição hipóxica. Descobrimos que a supressão condicional de miR-21 resultou num decréscimo significativo nos níveis de ARNm relativos de HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, marcadores de EpCAM, e mesenquimais do fenótipo EMT tais como ZEB1, vimentina, e Twist, e aumentaram os níveis de ARNm relativos de epitelial marcador de e-caderina em PC-3 de células formadoras de esfera sob condições hipóxicas (dados não mostrados). Da mesma forma, o CDF diminuiu os níveis de ARNm de HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, e marcadores de EpCAM, mesenquimais ZEB1, ZEB2, vimentina, e torção em PC-3 de células formadoras de esfera sob condição hipóxica. No entanto, CDF também diminuiu a expressão do gene da E-caderina em células formadoras de esfera de PC-3 em condições de hipóxia (dados não mostrados).

Efeito do CDF sobre a expressão de miARN no PC-3-esfera formando células sob hipóxica condição

Foi examinado o efeito da CDF em Let-7, miR-21, miR-101 e miR-210 em PC-3 células formadoras de esfera sob condição hipóxica. Os resultados mostraram que CDF aumentou os níveis relativos de miARN de deixar-7c, d, e miR-101 e diminuiu o nível relativo de miR-210 PC-3 em células formadoras de esfera sob condições hipóxicas (Figura 6A). Estes dados sugerem que a CDF pode desregular a expressão de miARN associada a hipoxia em células CSC-como de células APC.

Os painéis A e B representam os dados de miARNs nas células formadoras de CSC-esfera como derivados de células humanas APC e das actividades de luciferase em células APC, respectivamente. A transfecção de miR-21 mediada por vector de luciferase gene repórter e anti-miR-21 foram realizados em células PC-3, como descrito em detalhe na secção Métodos. A actividade de luciferase foi medida utilizando o kit de ensaio de luciferase Promega sistema, seguindo o manual do fabricante. As barras nas figuras indicam desvio padrão de n = 3.

Efeito da CDF Tratamentos ou miR-21 Deficiência em miR-21 actividade de ligação a 3′-UTR em células CaP Sob hipóxica Estado como avaliado por ensaio de luciferase

Foi examinado o efeito do tratamento com CDF ou deficiência de miR-21 na actividade de ligação de miR-21 a 3′-UTR em células CaP sob condição hipóxica utilizando um ensaio de gene repórter de luciferase de miR-21-mediada. Como mostrado na Figura 6B, nós descobrimos que a hipoxia diminuiu a actividade da luciferase nas células PC-3 transfectadas com o vector de luciferase miR-21-mediada, em comparação com as mesmas células sob condições normóxicas, sugerindo que a hipóxia aumentou a actividade de ligação de miR-21, levando à diminuição da actividade da luciferase. Anti-miR-21 aumentaram a actividade da luciferase em PC-3 de células sob condições hipóxicas, em comparação com as mesmas células sem tratamento, sugerindo que o anti-miR-21 diminuiu a ADN miR-21 de ligação, levando a um aumento na actividade da luciferase em células sob condição hipóxica PC-3. Da mesma forma, o tratamento CDF mostraram um aumento da actividade de luciferase em células PC-3 em condições de hipóxico em uma maneira dependente da dose, sugerindo que CDF pode inibir a ligação do miR-21 de ADN em células PC-3.

Discussão

Uma série de estudos epidemiológicos e clínicos têm demonstrado que a hipóxia e vias de sinalização induzida por hipóxia estão associados com mau prognóstico dos pacientes diagnosticados com tumores sólidos, incluindo o cancro da próstata (PCA). Evidências também sugerem que a hipoxia aumenta a migração celular, invasão, angiogénese e, conduzindo a fenótipos agressivas do tumor. Aqui, podemos confirmar que a hipoxia induz a migração celular, invasão, angiogénese e, e aumentou a produção de VEGF em células APC. Observamos também que a hipóxia induz a formação de prostaspheres em células APC, consistente com o aumento da expressão de genes marcadores CSC como Nanog, Oct4, EZH2, CD44, e EpCAM em células APC. Tem sido demonstrado que a hipóxia desempenha um papel-chave na regulação de características CSC através de proteínas HIF, e HIF genes alvo a jusante, tais Oct4 e Notch-1 [6]; [7]. Estes resultados sugerem que a hipóxia pode desempenhar um papel fundamental na regulação das características da CSC, levando a tumor fenótipo agressivo.

Novas evidências sugerem que miRNAs desempenham papéis críticos no desenvolvimento e progressão de tumores através da regulação da degradação do mRNA ou tradução de proteínas mediada através da sua ligação a região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) dos genes alvo. Tem sido documentado que o miR-21 é considerada uma molécula pró-oncogénica, que promovem a tumorigénese.