Abstract

Introdução

miosina-9 (MYH9) pertence à superfamília miosina de proteína do motor de ligação de actina. Recentemente, MYH9 foi pensado para ser associado com a migração de células de cancro, invasão e metástase. Os objetivos deste estudo foram analisar imunohistoquímica expressão MYH9 no cancro do pulmão de não pequenas células cirurgicamente ressecado (NSCLC), e avaliar suas correlações com os parâmetros clínico e o prognóstico dos pacientes.

Métodos

expressão MYH9 foi imunohistoquímica estudados em 266 CPNPC ressecados consecutivos, e suas associações com os parâmetros clínico foram avaliados. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier e Cox modelos de riscos proporcionais foram utilizados para estimar o efeito da expressão MYH9 na sobrevivência.

Resultados

expressão MYH9 foi detectada em 102 dos 266 (38,3%) CPNPC. expressão MYH9 foi significativamente correlacionada com a histologia de adenocarcinoma (

P

= 0,014), a diferenciação mais pobres ((

P

= 0,033), invasão vascular intratumoral e invasão linfática ((

P

= 0,013 e P = 0,045, respectivamente), e um pior prognóstico ((

P

= 0,032) Além disso, a análise multivariada revelou que a expressão MYH9 previu independentemente um pior sobrevida (HR, 2,15;. 95% CI, 1,17-3,92; (

P

= 0,01)

Conclusão

O presente estudo revelou que MYH9 é expressa em um subconjunto de NSCLC com uma natureza mais maligno, e sua. expressão é um indicador de probabilidade de sobrevivência mais pobre

Citation:. Katono K, Sato Y, Jiang SX, Kobayashi M, Nagashio R, Ryuge S, et al (2015) significado prognóstico de expressão MYH9 em recessionada Non. . Cell Lung Cancer -Small PLoS ONE 10 (3): e0121460 doi:. 10.1371 /journal.pone.0121460

editor do Academic: John Souglakos, University Hospital Geral de Heraklion e Laboratório de Tumor Cell Biology, Faculdade de medicina da Universidade de Creta, Grécia

Recebido: 29 de agosto de 2014; Aceito: 01 de fevereiro de 2015; Publicação: 31 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Katono et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não receberam qualquer financiamento específico para este trabalho

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

câncer de pulmão primário é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) respondendo por quase 80% das mortes [1]. O prognóstico dos pacientes com NSCLC está principalmente relacionada com a metástase do tumor. O processo de metástase do tumor consiste em etapas complexas: que envolve a migração de células tumorais, seguida por separação do tumor primário, invasão nos tecidos circundantes, intravasamento para vasos sanguíneos ou linfáticos, difusão no sistema hemolinfático, e extravasamento em locais secundários [2]. Compreender proteínas relacionadas com a migração de tumor, invasão e metástase podem ser úteis como novos marcadores de prognóstico ou alvos terapêuticos em NSCLC. A estreita correlação entre metástase e chemoresistance foi frequentemente observada em pacientes com câncer humanos, algumas moléculas que estão relacionados com metástase e chemoresistance foram relatados [3,4,5]. Portanto, nós nos concentramos proteínas a partir de sub-linhas resistentes à cisplatina para detectar um novo marcador que indica comportamento clínico agressivo em NSCLC.

No presente estudo, nós nos concentramos em miosina-9 (MYH9), que é maior em sub-linhas resistentes à cisplatina. A superfamília miosina é representado por quinze classes. Miosina-II, a miosina de duas cabeças convencional que forma filamentos bipolares, está diretamente envolvida na regulação da citocinese, motilidade celular e morfologia das células em células nonmuscle. Vertebrados expressar pelo menos duas miosina II pesados ​​isoformas da cadeia não-musculares, referidas como a miosina-IIA e miosina-IIB. O primeiro consiste em dois não-miosina do músculo IIA cadeias pesadas (NMMHC-IIA), referido como Miosina-9 (MYH9), duas cadeias leves de regulação (RLC), e duas cadeias leves essenciais. A actividade da miosina-AII é regulado, principalmente, pela fosforilação de RLC e MYH9 [6]. Porque MYH9 contribui para a polaridade celular, adesão, a divisão, migração e [7,8], vários estudos têm indicado que MYH9 desempenha um papel fundamental na migração de células de cancro, invasão e metástase [9,10]. Em células MCF-7 de cancro da mama humano, MCF-7/6 células que têm uma capacidade invasiva mostram uma expressão mais elevada do que as células de MYH9 /Z MCF-A, que são não-invasiva. A capacidade de invasão de células MCF-7/6 é diminuído, quer por knockdown de MYH9 ou tratamento com blebbistatin, que inibe a função de MYH9, indicando o envolvimento de MYH9 na migração e invasão de células cancerosas. A superexpressão de MYH9 está relacionado a um mau prognóstico no esôfago [11], bexiga [12], e câncer gástrico [13]. Maeda et al. informou que estágio pacientes I com adenocarcinoma de pulmão que faltam a expressão de qualquer MYH9 ou vimentina ter um desfecho favorável, sem quimioterapia adjuvante pós-operatório [14]. No entanto, as relações entre a expressão MYH9 e características clínico-patológicas e prognóstico dos pacientes precisam ser mais bem estudada em um grande número de casos NSCLC em vários estágios da doença, bem como em carcinoma de células escamosas do pulmão. O presente estudo analisou a expressão MYH9 no CPNPC ressecados incluindo carcinomas de células escamosas de estágio patológico I-III, e analisada a correlação com os parâmetros clínico dos pacientes e seu significado prognóstico.

Materiais e Métodos

Ética declarações

o estudo foi aprovado pelo Comitê da Faculdade de Medicina (B13-53) Universidade Kitasato de Ética e seguiu a Declaração de Helsinki protocolo. Todos os pacientes foram abordados com base em orientações éticas aprovados, concordou em participar neste estudo, podendo recusar a entrada e interromper a participação a qualquer momento. Todos os participantes provou consentimento por escrito. Animais do estudo foram tratados de acordo com as Diretrizes para a Experimentação Animal da Kitasato University School of Allied Health Sciences, e todos protocolo experimental animal foi aprovado pela Comissão sobre a ética da Experimentação Animal da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade Kitasato (14- 16).

As linhas celulares

O LCN1, derivado do grande carcinoma neuroendócrino de células, foi criada em nosso laboratório [15]. A LC-2 /AD e A549, ambas derivadas de um adenocarcinoma do pulmão, foram adquiridos a partir do RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japão) e japonês Cancer Research Resources Bank (Tóquio, Japão), respectivamente. Estas células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Sigma, Steinheim, Alemanha) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Biowest, Miami, FL, EUA), 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina ( GIBCO, Auckland, Nova Zelândia). Após a colheita e a lavagem duas vezes com solução salina tamponada com fosfato sem iões divalentes (PBS), as células sub-confluentes foram armazenadas a -80 ° C para análise proteómica e fixados em formalina a 10% e embebidos em parafina para imuno-histoquímica. células LCN1 também foram Amex-fixo [16] para o rastreio imuno-histoquímica. Os /células O-Ag14 SP2 derivadas de um mieloma de ratinho foram adquiridos a partir do RIKEN Bioresource Center, e foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 1 × 8-azaguanina (50 × Hybri-Max, SIGMA), 10% de FBS, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 mg /ml de estreptomicina (GIBCO).

sub-linhas resistentes à cisplatina

sub-linhas resistentes à cisplatina (cis-LCN1, LC-2 /ad-cis, e A549-cis) foram estabelecidas por cultura das células durante 6 meses com cisplatina (Randa inj., Nippon Kayaku Co., Ltd., Tóquio, Japão), partindo de uma concentração de 25 e aumentando gradualmente a 3200 ng /ml. sub-linhas resistentes à cisplatina foram cultivadas de forma estável a uma concentração de 3200 ng /mL de cisplatina durante mais de 12 meses, em nosso laboratório [17].

A geração de anticorpos monoclonais

lisado celular

LCN1-cis foi preparado com PBS (-) utilizando um homogeneizador ultra-sónica (UH-50; SMT Company, Tóquio, Japão). fêmea BALB /c com cinco semanas de idade foram imunizados intraperitonealmente com 50 mg de peso molhado de lisado celular LCN1-cis em 500 ml de PBS (-) 3 vezes com um intervalo de duas semanas. O título de anticorpo foi testado por IHC utilizando 100 vezes soros diluídos de ratinhos imunizados como o primeiro anticorpo em células LCN1-cis-AMEX fixos. Três dias antes da fusão celular, o animal com o título mais elevado foi intraperitonealmente potenciado pela mesma quantidade de lisado LCN1-cis. preparação de hibridomas e rastreio IHC com células LCN1-cis Amex-fixados foram previamente descritos [18,19].

Determinação do anticorpo isotipo

Um anticorpo, designado como KU-Lu-6, que mostrou a coloração das membranas em células LCN1-cis, mas não em suas células LCN1 pai, foi captado e mais estudados. Para determinar o isotipo do anticorpo KU-Lu-6 estabeleceu, foi utilizado o IsoStrip

Kit TM mouse Anticorpo Monoclonal isotipificação (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante.

Immunoprecipitation

o método utilizado para a imunoprecipitação da Pierce Proteína G agarose (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) no presente estudo foi de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, as células LC-2 /AD-cis foram lavadas com PBS (-) e tratada com ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão contendo Complete-Mini EDTA-livre (Roche Diagnostics) em gelo durante 30 min. Após centrifugação a 15.000 rpm durante 30 min a 4 ° C, o sobrenadante foi recolhido. Para conjugar o anticorpo primário, 200 pL de anticorpo primário (KU-Lu-6 sobrenadante de hibridoma) e 50 ul de esferas de proteína G de agarose em suspensão em tampão de RIPA foram incubados com rotação à temperatura ambiente durante 30 min. Após centrifugação, o conjugado de anticorpo-agarose e 500 ug de proteína celular total a partir do sobrenadante LC-2 /AD-cis foram incubados com rotação à temperatura ambiente durante 30 min. Os imunoprecipitados foram recolhidos por centrifugação a 15.000 rpm durante 5 min a 4 ° C. Após lavagem três vezes com tampão RIPA, o sobrenadante foi cuidadosamente removido e os sedimentos foram ressuspensos em 20 uL de 1 x tampão de Laemmili. Em seguida, todas as amostras foram fervidas e separadas por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida com 10%. Após SDS-PAGE, os géis foram corados com Zn-o kit Gel Stain MS negativa (Wako Puré Chemical, Tóquio, Japão), de acordo com as instruções do fabricante.

Identificação da proteína do antigénio

A mancha de proteína foi excisada do gel de SDS-PAGE e picada para 1 mm

3, descorado com solução de descoloração (Wako Pure Chemical), desidratou-se com 100% (v /v), ACN, e secou-se sob condições de vácuo. digestão tríptica foi realizada com um volume mínimo de solução de digestão contendo 10 ng /uL de tripsina (tripsina ouro, Espectrometria de Massa de Grau, Promega Madison, WI, EUA) e de NH4HCO3 25 mM durante 24 hrs a 37 ° C. Após a incubação, os fragmentos digeridos de proteínas eluídas em solução foram recolhidos, e os geles foram lavados uma vez com 5% (v /v) de ácido trifluoroacético /50% (v /v) de ACN e recolhido no mesmo tubo.

A fragmentos peptídicos recolhidos foram analisados ​​utilizando Autoflex III associado à matriz de dessorção /ionização por laser em tempo de voo /espectrometria de massa de tempo de voo (MALDI-TOF /TOF; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha). Uma placa descartável, manchado matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico para amostras, e PAC Peptide Calibstandard para calibração (Prespotted AnchorChip 96 set para Proteomics, Bruker Daltonik GmbH) foram utilizados. impressões digitais da massa dos péptidos (FMP) foram medidos e, em seguida alguns picos obtidos a partir de PMF foram adicionalmente medido para os seus espectros de massa em tandem como massas parentais. MASCOT (https://www.matrixscience.com) utilizando a base de dados de IPI 3,85 Humana (89,952 sequências; 36,291,020 resíduos), foi usada para determinar as proteínas de dados PMF e de massa em tandem

Como a KU-Lu-. 6 anticorpo não funciona por imunotransferência, o ensaio de absorção de anticorpo para a confirmação do antigénio utilizando proteína antigénio sintético purificado foi utilizado.

Um clone de expressão MYH9 foi construído a partir do clone e CU013414 pINSOL20 destino vector com o sistema gateway ( life Technologies, EUA). síntese de proteínas foi realizada utilizando o método em nosso relatório anterior [20]. A quantificação de proteína foi calculada como a densidade da banda de coloração com CBB em SDS-PAGE como proteína padrão de BSA.

Cem uL de cada sobrenadante de hibridoma não diluído foi pré-absorvido com 0,12, 0,24, e 0,48 ug de proteínas MYH9 sintéticos, respectivamente. Em seguida, elas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas e a 4 ° C durante a noite. Depois de ser centrifugado a 20000 g durante 10 min, cada sobrenadante foi recolhido e utilizado como os primeiros anticorpos.

IHC com anticorpos absorvidos foi descrito em 2.8.

Pacientes e amostras de tecido

Um total de 266 pacientes com NSCLC consecutivos submetidos a ressecção completa de janeiro de 2002 a dezembro de 2005 no Hospital Universitário de Kitasato, foram incluídos neste estudo de coorte retrospectivo. Aqueles que receberam quimioterapia e /ou radioterapia pré-operatória. Dez por cento de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina foram processados ​​em secções de 3 um de espessura e corados com hematoxilina e eosina. O diagnóstico histológico foi baseada nos critérios da Saúde /Organização Mundial da Associação Internacional para o Estudo da classificação Lung Cancer de pulmão e tumores pleurais [21]. Cada paciente foi reavaliada de acordo com a 7ª edição da classificação TNM [22]. Os parâmetros clínicos e patológicos retrospectivamente avaliação incluiu a idade na ressecção cirúrgica, sexo, tabagismo, tipo histológico, a diferenciação do tumor, patológica TNM (p-TNM) e estágio, estado nodal, invasão vascular intratumoral, invasão linfática intratumoral, invasão pleural, recebendo quimioterapia adjuvante, estado viabilidade e tempo de sobrevivência após a cirurgia. O status de viabilidade foi determinada com base em se ou não relacionadas com NSCLC ocorreu a morte, e o tempo de sobrevivência foi definida como a duração a partir da data da cirurgia até a data da morte ou fim de follow-up. Casos de morte por outras causas ou perdidos para follow-up foram tratados como casos censurados.

coloração imuno-histoquímica de anticorpos KU-Lu-6

Depois de deparaffinizing em xileno, de 3 mm de espessura ou preparações de células foram re-hidratadas numa série de etanol descendente, e, em seguida, tratada com peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 min. Eles foram antigénio-recuperado por autoclavagem durante 10 minutos em 0,01 M tampão citrato (pH 6,0) com 0,1% de Tween20. Após o bloqueio com 2% de soro de suíno /solução salina normal tamponada com Tris (Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5, NaCl 150 mM) durante 10 min, que foram feitos reagir com sobrenadante não diluído de anticorpo KU-Lu-6 durante a noite à temperatura ambiente . Depois de ser lavado em solução salina Tris-tamponada três vezes durante 5 min cada, que foram feitos reagir com reagente de ChemMate ENVISION (DAKO, Glostrup, Dinamarca) durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, foram visualizados com DAB solução estável (Invitrogen; Carlsbad, CA, EUA) e contrastadas com hematoxilina de Mayer. Os controlos negativos foram preparados substituindo solução salina tamponada com fosfato para o anticorpo KU-Lu-6.

Avaliação da coloração imuno-histoquímica

membranosa imunocoloração de células tumorais foi considerada positiva para a KU-Lu anticorpo -6. A intensidade da coloração foi categorizado em três grupos: 0 = negativo; 1 = fracamente positivo; 2 = fortemente positiva. As células tumorais, com uma pontuação de coloração 2 foram consideradas como positivas. Observou-se em todas as células de tumor do espécime, um tumor com coloração positiva em mais de 25% das suas células tumorais foi considerada como positiva. Todas as seções imunomarcadas foram revisados ​​por dois investigadores (KK e S. Y.) sem o conhecimento dos dados clínicos. casos discordantes foram analisadas e discutidas até que um consenso foi alcançado.

A análise estatística

As variáveis ​​contínuas são apresentados como a mediana (intervalo), enquanto que as variáveis ​​numéricas são dadas como N (%). As relações entre a expressão NMIIA e os parâmetros clínico foram avaliados com χ de Pearson

2 ou teste exato de Fisher, conforme apropriado. A sobrevivência cumulativa de pacientes foi estimada pelo método de Kaplan-Meier, e o significado das diferenças de sobrevida entre os grupos MYH9 positivos e negativos foi testada usando o teste log-rank. A probabilidade de sobrevivência cumulativa de 5 anos foi estimada utilizando o método de tabela de vida com o comprimento do intervalo fixado em 1 mês. A análise multivariada foi realizada através da utilização do modelo de riscos proporcionais de Cox para examinar a interação entre a expressão MYH9 e outras variáveis ​​clínico-patológicas, e estimar o efeito prognóstico independente de MYH9 na sobrevivência através do ajuste para fatores de confusão. O convencional

P

-valor de 0,05 ou menos foi usado para determinar o nível de significância. Todos os relatados

P

-Valores são duas faces. As análises foram realizadas de forma independente no nosso centro de investigação clínica usando SPSS versão 17.0 do software. (SPSS; Chicago, IL, EUA)

Resultados

Caracterização de anticorpos KU-Lu-6

Usando células LCN1-cis Amex-fixadas para o rastreio imuno-histoquímica, finalmente selecionou um clone designado como KU-Lu-6, que mostrou a coloração das membranas das células LCN1-cis, mas não em células LCN1 (Fig. 1).

a coloração das membranas foi observado em células LCN1-cis, mas não em células LCN1. (Ampliação original: A, B x 400).

por coloração imuno-histoquímica de Lu-KU-6 do anticorpo com linhas de células fixadas em formalina, a coloração intensa foi observada em linhas de células resistentes à cisplatina, especialmente nas células LC2 /ad-cis (Fig. 2A).

KU-LU-6 sobrenadante de anticorpo foi pré-absorvido com nenhum (A), 0,12 ^ g (B), de 0,24 ug (C), e 0,48 ug (D) de proteínas MYH9 sintéticos. Cada anticorpo absorvida foi imunocoradas com células /ad-cis LC2 fixados em formol. O corabilidade de anticorpo KU-Lu-6 foi reduzida gradualmente, dependendo da concentração de proteína MYH9.

De modo a identificar a proteína do antigénio reconhecido pelo anticorpo KU-Lu-6, foi realizada com IP ligado de-2 LC células /ad-cis. Os resultados de IP são mostrados na Fig. 2. A proteína antigénica foi observada a cerca de 250 kDa na pista 2 (Fig. 3). Nenhum sinal foi observado na pista 3 e 4 como um controlo negativo (Fig. 3). Para determinar a proteína antigénico reconhecido pelo anticorpo KU-Lu-6, que excisada e recolhido o ponto a partir do gel manchado de Zn, e prosseguiu com a digestão em gel. Após a análise utilizando uma busca de MALDI-TOF /TOF MS e MASCOT, a proteína foi determinada como uma isoforma de miosina-9 (MYH9, adesão: IPI00019502), o qual é composto de 1,960 aminoácidos com um P.M. previsto de 226.532 Da. O isotipo de imunoglobulina de anticorpo KU-Lu-6 foi determinada como IgM, k. No ensaio de absorção de anticorpo, o anticorpo de corabilidade KU-Lu-6 foi reduzida gradualmente, dependendo da concentração de proteína MYH9. O corabilidade de anticorpo KU-Lu-6 foi completamente perdida com 0,48 ug de proteína MYH9 (Fig. 2)

Pista 1:. Lisado LC-2 /AD-cis combinado com: marcador de peso molecular, pista 2 KU-Lu-6 anticorpo, pista 3: LC-2 lisado /aD-cis combinado com proteína G, pista 4: KU-Lu-6 anticorpo combinado com proteína G, pista 5: LC-2 /aD-cis lisado. Pistas 3 e 4 são controles negativos, eo produto imunoprecipitadas específica com o anticorpo KU-Lu-6 foi detectado em pista 2 (seta).

expressão MYH9 em NSCLC

MYH9 foi expressa na membrana e no citoplasma de algumas células tumorais. Especialmente, a intensidade da coloração foi marcado na membrana da célula. Dos 266 CPNPC cirurgicamente ressecado, incluindo 203 adenocarcinomas, 51 carcinomas de células escamosas, carcinomas de células grandes 10, e 2 carcinomas adenoescamosos, MYH9 expressão positiva em células tumorais foi observado em 102 casos (38,3%) (Fig. 4). MYH9 expressão foi também observada em fibroblastos do estroma do tumor e nas células epiteliais brônquicas normais. MYH9 expressão não foi detectada nas células epiteliais alveolares normais. Nenhuma expressão foi observada em controlos negativos

A:. MYH9 foi fortemente expresso na membrana de células de tumor em adenocarcinoma. B: MYH9 foi fortemente expresso na membrana e no citoplasma de células tumorais no carcinoma de células escamosas. (Ampliação original: A, B × 400)

características clínico-patológicos do paciente

As características clinicopatológicas dos pacientes estão resumidos na Tabela 1. Um total de 168 homens e 98 mulheres. foram incluídos, com idades variando de 34 a 85 anos (mediana, 64 anos), dos quais 166 (62,4%) eram fumantes. A duração global de acompanhamento variou de 3 a 129 meses (mediana, 84 meses). Um total de 142 pacientes estavam vivos no final do seguimento, 88 pacientes morreram de câncer de pulmão, 19 pacientes morreram de outras causas, e 17 pacientes foram perdidos para follow-up. As causas das 19 mortes de cancro não de pulmão foram pneumonia (n = 11), carcinoma colangiocelular (n = 2), doença pulmonar obstrutiva crónica (n = 1), sépsis (n = 1), enfarte cerebral (n = 1) , enfarte do miocárdio agudo (n = 1), cancro gástrico (n = 1), e leucemia (n = 1). Nenhum desses 19 pacientes tiveram mortes relacionadas com a cirurgia. No 17 perdeu-to-follow-up pacientes, todos foram perdidos para follow-up, devido à interrupção do atendimento hospitalar e foram incapazes de ser contactado. As durações de acompanhamento dos 17 pacientes perdidos para follow-up variou de 15 a 92 meses (mediana, 61 meses).

Relação entre a expressão MYH9 e as características clinicopatológicas

A relações entre expressão MYH9 e características clínico-patológicas estão resumidos na Tabela 2. expressão MYH9 foi mais frequentemente detectado em adenocarcinoma do que em carcinoma de células escamosas e outros subtipos histológicos (

P

= 0,014). expressão MYH9 também foi relacionada à diferenciação mais pobre (

P

= 0,033), invasão vascular intratumoral (

P

= 0,013) e invasão linfática intratumoral (

P

= 0,045) . Não houve associação significativa entre a expressão MYH9 ea idade, sexo, tabagismo, fase p-TNM, estado nodal, ou a invasão pleural

Kaplan-Meier da sobrevivência no MYH9-positivas e. – pacientes negativos

Todos os pacientes foram incluídos na análise de sobrevivência. Os períodos totais de acompanhamento variou de 3 a 129 meses (mediana, 84 meses), ea probabilidade de sobrevida cumulativa em 5 anos foi de 70% para todos os pacientes. Uma vez que uma probabilidade de sobrevivência cumulativa de 50% ainda não foi atingido, não foi determinado o tempo de sobrevivência global mediana. A probabilidade de sobrevivência cumulativa de 5 anos de 66% para o grupo MYH9-positivos e de 78% para o grupo MYH9-negativo. Enquanto o tempo médio de sobrevivência não estava disponível, a taxa de sobrevivência do grupo MYH9-positivo foi significativamente mais pobres grupo (

P

= 0,029) (Fig. 5A). Em análises posteriores, expressão MYH9 foi significativamente correlacionada com pior sobrevida em pacientes com adenocarcinoma quer (

P

= 0,007) (Fig. 5B) ou carcinoma de células escamosas (

P

= 0,032) (Fig . 5C). A probabilidade de sobrevida em 5 anos foi de 69 e 85% para MYH9-positivos e pacientes de adenocarcinoma -negative, respectivamente, e 43 e 74% para MYH9 positivos e negativos pacientes carcinoma epidermóide, respectivamente.

(A ) para todos os doentes; (B) para os pacientes com adenocarcinoma; (C) para pacientes com carcinoma de células escamosas, o tratamento de todas as outras causas de morte e perdidos para follow-up como casos censurados. expressão MYH9 foi significativamente correlacionada com pior sobrevida no CPNPC ressecados.

Efeito de expressão MYH9 na sobrevivência com uni e multivariada analisa

Análise univariada foi realizada de acordo com o modelo de riscos proporcionais de Cox para avaliar o efeito da expressão MYH9 e outros factores clinicopatológicas sobre a sobrevivência. Os resultados indicaram que o tipo histológico (HR, 1,94; IC 95%, 1,23-3,06;

P

= 0,004), fase p-TNM (HR, 4,58; IC 95%, 2,89-7,26;

P Art 0,001), quimioterapia adjuvante (HR, 2,81; IC 95%, 1,73-4,57;

P Art 0,001), diferenciação tumoral (HR, 2,45; 95% CI, 1.53- 3,92;

P Art 0,001), invasão vascular (HR, 5,67; IC 95%, 3,25-9,90;

P Art 0,001), invasão linfática (HR, 4,43; 95% CI, 2,65-7,40;

P Art 0,001), invasão pleural (HR, 2,64; IC 95%, 1,73-4,03;

P Art 0,001), e expressão MYH9 (HR , 1,57; IC 95%, 1,03-2,39;

P

= 0,03) foram preditores significativos de sobrevida específica para o câncer. Além disso, a expressão MYH9 e outras variáveis ​​clinicopathlogical incluindo o tipo histológico, estágio p-TNM, quimioterapia adjuvante, a diferenciação do tumor, invasão vascular, invasão linfática e invasão pleural foram inseridos em análise multivariada utilizando o modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox. Os resultados indicaram que a expressão MYH9 foi um preditor significativo independente de uma pior sobrevida. (HR, 2,15; IC 95%, 1,17-3,92;

P

= 0,01) (Tabela 3)

Discussão

no presente estudo, MYH9 foi expressa em 102 dos 266 (38,3%) CPNPC, e sua expressão foi significativamente correlacionada com a histologia de adenocarcinoma, diferenciação mais pobre, e vascular intratumoral e invasão linfática. De acordo com relatórios anteriores do esôfago [11], bexiga [12] e câncer gástrico [13], o presente estudo revelou que a expressão MYH9 é um fator prognóstico independente e associada a um pior prognóstico de pacientes com CPNPC ressecados. Embora Maeda et al. relataram que pacientes com estágio I adenocarcinoma de pulmão falta a expressão de qualquer MYH9 ou vimentina mostrar um resultado favorável, sem quimioterapia adjuvante pós-operatório [14], o presente estudo revelou que a expressão MYH9 é um fator prognóstico independente para sobrevida em pacientes com CPNPC ressecados, incluindo estágio patológico I-III e carcinoma de células escamosas do pulmão.

no presente estudo, a coloração MYH9 foi detectada em ambas a membrana e no citoplasma de algumas células tumorais, embora a intensidade da coloração foi marcadamente mais forte na membrana celular. Em MDA-MB-231 de cancro da mama espalhando células em fibronectina, MYH9 é observado na região marginal lamelar propagação das células [9]. Porque MYH9 é relatada para contribuir para a polaridade celular e lamelip�ios na periferia da célula e do bordo de ataque, intensidade de coloração forte na membrana celular pode reflectir a actividade MYH9 na migração das células do cancro e invasão.

invasão microambiente local, tais como permeação linfovascular intratumoral, é um passo importante na fase inicial de metástases tumorais. MYH9 contribui para migração celular, que é necessário para a invasão do microambiente local.

In vitro

, vários estudos relataram que as células MYH9-empobrecido mostrou migração defeituosa [10,11]. Além disso, a formação de lamelip�ios na vanguarda da célula é necessária para a migração de [23], e tais formação é controlado por Rac, o complexo de ondas, e Arp2 /3complex [24]. Recentemente, Morimura et ai. relataram que MYH9 também é necessário para a formação de lamelip�ios por ligação a WAVE2 [25]. Assim, a expressão MYH9 podem estar associados com a aquisição de recursos de migração e invasão de células tumorais, que posteriormente resulta na invasão linfovascular altamente intratumoral e prognósticos mais pobres do presente estudo.

No presente estudo, a expressão MYH9 foi significativamente correlacionada com diferenciação tumoral mais pobres. Mal carcinoma diferenciado é caracterizada pela facilitação da citocinese. Na citocinese, células construir um anel contráctil que contrai a membrana de plasma para gerar duas células filhas ligados por uma ponte citoplasmática. MYH9 contribui para a contracção do anel contráctil e desempenha um papel fundamental na citocinese [26,27]. Além disso, um estudo anterior relatou que o tratamento com blebbistatin, um inibidor de MYH9, leva à falha da citocinese [28]. Assim, não é surpreendente que a expressão MYH9 está associada com a diferenciação de tumor mais pobre no presente estudo.

Conclusão

relataram que MYH9 é expresso num subconjunto de NSCLC, e a sua expressão é relacionadas com a histologia de adenocarcinoma, diferenciação mais pobre, invasão vascular intratumoral, invasão linfática intratumoral, e um pior prognóstico. expressão MYH9 é um fator prognóstico independente para sobrevida em pacientes com CPNPC ressecados, embora o seu significado prognóstico ainda requer confirmação com populações maiores de pacientes.