Abstract
A incidência de cancro colorectal (CRC) aumenta com a idade e início precoce indica uma maior probabilidade de predisposição genética para esta doença. A genética somáticas do desenvolvimento do tumor em relação à idade do paciente permanece em grande parte desconhecido. Examinamos o estado de mutação de cinco genes críticos de câncer conhecidos em relação à idade no momento do diagnóstico, e compararam a complexidade genômica de tumores de pacientes jovens, sem síndromes CRC conhecidos com os de pacientes idosos. Entre 181 pacientes com CCR, estratificados por estado instabilidade de microssatélites, foram identificadas alterações seqüências de DNA em
KRAS
(32%),
BRAF
(16%),
PIK3CA
(4 %),
PTEN
(14%) e
TP53
(51%). Em pacientes com menos de 50 anos (n = 45),
PIK3CA
mutações não foram observadas e
TP53
mutações foram mais frequentes do que nos grupos etários mais velhos. O índice total mutação genética foi menor nos tumores de pacientes mais jovens. Em contraste, a complexidade do genoma, avaliada como aberrações no número de cópias, foi mais elevada em tumores de pacientes mais jovens. Um número comparável de tumores de jovens ( 50 anos) pacientes e idosos ( 70 anos) foi quadruple negativo para os quatro marcadores genéticos preditivos (
KRAS-BRAF-PIK3CA PTEN
); No entanto, 16% dos jovens contra apenas 1% dos pacientes antigos tinham mutações de tumor em
PTEN /PIK3CA exclusivamente
. Isto implica que o teste de mutação para a previsão da resposta ao tratamento EGFR pode ser restrito a
KRAS Comprar e
BRAF
em idosos ( 70 anos) pacientes. diferenças genéticas distintas encontradas em tumores de pacientes jovens e idosos, os quais são comparáveis para as variáveis clínicas e patológicas conhecidas, indicam que os pacientes jovens têm um perfil de risco genético diferente para o desenvolvimento CRC que pacientes mais velhos
Citation:. Berg M, Danielsen SA, Ahlquist T, Merok MA, Agesen TH, Vatn MH, et al. (2010) DNA Profiles Sequência do Colorectal Cancer Critical Gene Set
KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN-TP53
relacionada com a idade no início da doença. PLoS ONE 5 (11): e13978. doi: 10.1371 /journal.pone.0013978
editor: Kelvin Yuen Kwong Chan, da Universidade de Hong Kong, China
Recebido: 21 de junho de 2010; Aceito: 14 de outubro de 2010; Publicação: 12 de novembro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Berg et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado por doações do Cancer Society norueguês (https://www.kreftforeningen.no/english) a RAL (Número de concessão 95.068 /RAL, incluindo bolsas de doutoramento para SAD, MB e THA, e pós doc subvenção para TA), e doações da Fundação Norueguesa para a Saúde e Reabilitação (https://www.helseogrehab.no/) através do EXTRA fundos (número de concessão HF-52015/002) para ETE Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a incidência de cancro colorectal (CRC, MIM # 114500) tem aumentado no mundo ocidental, incluindo a Noruega durante os últimos 50 anos [1]. CRC é normalmente encontrado em pessoas idosas com uma idade média de início dos 70 anos, e apenas cerca de cinco por cento de todos os casos são diagnosticados em pacientes com menos de 50 anos de idade. síndromes hereditárias como a polipose adenomatosa familiar (FAP, MIM # 175100) e síndrome de Lynch (HNPCC, MIM # 120435) são encontrados em menos de cinco por cento de todos os CRCs [2]. Embora início precoce da doença é geralmente aceite como indicativo de um potencial risco genético, a maioria jovens de casos de início são considerados esporádicos como nenhuma predisposição genética conhecida é encontrada [3]. Poucos estudos têm-se centrado no desenvolvimento de tumores em pacientes jovens somática sem síndromes hereditárias conhecidas [4] – [6]
receptor tirosina-quinase de sinalização (RTK) é essencial para a manutenção do metabolismo, proliferação, a sobrevivência e a motilidade. de uma célula [7]. Assim, erros de componentes regulados por receptores tirosina-quinase (RTK) são comumente observados em cancros humanos [8], [9]. Os oncogenes
KRAS
(HGNC: 6407),
BRAF
(HGNC: 1097), e
PIK3CA
(HGNC: 8975) eo gene supressor de tumor
PTEN
(HGNC: 9588). são todos afectados em resposta às citocinas, fatores de crescimento e hormônios sinalização através RTK
ambos
KRAS Comprar e
BRAF
demonstraram têm mutações ativadoras em ~ 70% dos CRCs [10], levando a autonomia de ERK sinalização [11], [12]. Mutações em componentes da via de PI3-quinase têm sido descritos como mutado em ~ 40% em CRC [13], e as análises da paisagem genómico de tumores CRC demonstraram a via PI3K de ser afectada de uma forma estatisticamente significativa [14]. Em dois destes componentes,
PTEN
e
PIK3CA
, mutações resultar em ativação constitutiva da via PI3K pelo acúmulo de fosfatidilinositol (3,4,5) trifosfato (PIP
3) , que catalisa então a fosforilação de AKT. A AKT serina-treonina quinase activada regula uma ampla gama de proteínas alvo que participam numa variedade de percursos de sinalização a jusante [15]. Entre Akts alvos a jusante é o gene supressor de tumor
TP53
(HGNC: 11998), um fator de transcrição que integra informações de muitos tipos diferentes de estresse celular, e executar respostas a jusante apropriados para a entrada dada [16].
TP53
é encontrado mutado em cerca de metade de todos os carcinomas colo-rectal [17]
Estado da MSI no tumor primário tem impacto prognóstico em pacientes CRC [18] – [20]..
KRAS Comprar e
TP53
estatuto tem sido associada com pontos finais clínicos, o ex-somente com fraca associação em séries maiores e só esta última se subgrupos de mutações são consideradas [21] – [23] . Recentemente, um estudo demonstrou que
PIK3CA
mutações podem transportar informações de prognóstico em tumores de estádio I-III [24]. Este tipo de informação não foi publicada por
PTEN
mutações.
O tratamento da doença metastática visando EGFR é encontrado para ser eficaz apenas se
KRAS Comprar e
BRAF
não são mutantes [25]. No entanto, mesmo entre os pacientes com tipo selvagem
KRAS Comprar e
BRAF não
todos respondem a esta terapia [26,26]. Ultimamente, tem sido proposto que isto pode ser devido a mutações no
PIK3CA
e
PTEN
, tumores negativos mutação ou seja, apenas quadruple vai responder ao tratamento [26] – [29].
no presente estudo, compararam o estado de mutação sequência de DNA dos genes
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA, PTEN
, e
TP53
em amostras de tumores de pacientes com menos de 50 anos no momento do diagnóstico e sem conhecido síndromes hereditárias, estratificados de acordo com o estatuto MSI e os pacientes CRC idosos.
Resultados
dados clínicopatológicos para toda a série (n = 181), divididos em três grupos etários, são apresentados na Tabela 1.
instability- microssatélites e mutação do gene estatuto
o MSI- e mutação frequências da analisados genes são apresentados na Tabela 1, e um mapa de calor que representa dados de mutação para todas as amostras é mostrado na Figura 1. na série total MSI foi encontrada em 18% das amostras, variando de 13% no grupo 50 anos de idade para 20% na 70 anos de idade grupo. MSI foi significativamente associada com doença localizada, Tabela S1. Os genes foram mutados dentro do intervalo esperado de frequências. frequências de mutação para cada gene de forma independente, e as frequências de combinações de mutações nos genes testados, foram igualmente distribuídos entre todos os estágios. Diferenças atribuídas à idade de início são apontados abaixo.
Distribuição de mutações no conjunto gene
KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN-TP53
e status MSI, dentro de cada faixa etária. O código de cores: azul escuro = MSI, azul claro = MSS, vermelho = mutação, verde = tipo selvagem, branco = não detectado
No total, nove diferentes mutações foram observadas em
KRAS
, códons que afetam 12, 13 e 61. Vinte e oito tumores tinham o
BRAF V600E
mudança. Oito
PIK3CA
mutações foram identificadas em exons vinte e nove. Quatorze e quinze tumores tinham
PTEN
mutações e deleções, respectivamente. Noventa e três tumores tinham
TP53
mutações. Detalhes de todas as mutações observadas, podem ser encontrados na Tabela S2.
a comparação dos grupos etários
As relações entre os parâmetros clínicos e mutações dentro de cada grupo etário são apresentados na Tabela S1. Para todos os grupos etários, MSI-tumores foram mais frequentemente presente na localização do tumor do lado direito. No grupo de pacientes mais antigo MSI e
BRAF
mutações foram estatisticamente significativamente correlacionados (
P Art 0,001). Sem tal correlação foi encontrada no grupo de 50 anos. Os tumores MSI dentro do grupo de idade de 50, o grupo e idade 51-70 a 70 grupo de idade tinha 17%, 54% e 79%
BRAF
mutações, respectivamente (
P
= 0,04). Além disso, entre os seis tumores MSI no . 50 grupo só metade das amostras apresentaram mutações nos genes analisados, enquanto que entre os tumores MSI nos outros dois grupos de idade, todas as amostras apresentadas uma ou várias mutações
KRAS
mutações foram encontradas em 57 (32%) tumores na série total. As frequências de mutação eram ligeiramente diferentes entre os grupos etários, Tabela 1. A maioria das mutações foram encontradas em códons 12 (68%) e 13 (28%), independente da faixa etária. O códon 61 mutações só foram encontrados em amostras do . Grupo de 70 anos
KRAS Comprar e
BRAF
mutações eram mutuamente exclusivas na série total. A freqüência de mutações de tumores em qualquer
KRAS
ou
BRAF
aumentou com a idade do paciente, tanto na comparação entre os grupos etários e com a idade como uma variável contínua.
Surpreendentemente, nenhum dos os tumores no 50 faixa etária tinha
PIK3CA
mutações, enquanto cinco (7%) e três (4%) foram encontrados no grupo e 70. grupo, respectivamente
Dezoito
PTEN
mutações foram identificadas em sete de nove exões (não foram observadas mutações no exão 4 e 9). As mutações foram observadas em todas as faixas etárias, como foi o caso de
PTEN
exclusões. As deleções detectadas por MLPA foram encontrados em oito por cento das amostras no total, e coexistência de eliminação e alterações detectadas por sequenciação foram encontrados em três tumores. No geral, 14% dos tumores tiveram indicação de prejudicada
PTEN
função. A frequência de
PTEN
aberrações não apresentou diferença estatisticamente significativa entre os grupos etários; 18%, 10% e 16% em 50 grupo, 51-70 grupo e 70. Grupo, respectivamente
O número de
TP53
mutante tumores diferiu entre os três grupos etários (
P
= 0,02). Esta diferença também foi significativa quando se analisa apenas tumores MSS, (
P =
0,03). As mutações foram mais proeminentes no domínio de ligação a ADN, codificada pelos exões 5-8, e apenas cerca de cinco por cento das mutações foram observadas no exão 4 e o exão 11. Além disso, no grupo etário 50,
TP53
mutações e MSI eram mutuamente exclusivas, e inversamente correlacionados na gt 51-70 e . 70 grupos, respectivamente
complexidade do genoma e sequência de mutações
Para um subconjunto das amostras (n = 41) um conjunto de dados de alta resolução de alterações no número de cópias obtidos por matriz comparativa de dados de hibridização genoma (aCGH) estava disponível (Roche NimbleGen, 385 matriz sonda 000 oligo) [30]. Como publicado anteriormente [30], verificou-se a 50 grupo ter um número significativamente maior de aberrações do que a 70 grupo, mesmo que a parte total do genoma com aberrações foi similar nos dois grupos, Tabela 2. Um diferença em complexidade também foi encontrada no nível do gene, avaliada pelo índice de mutação: no grupo mais velho cada paciente tinha 1,5 mutações em média, em comparação com 1,0 no grupo etário mais jovem. A distribuição de fases do tumor foi um pouco inclinada entre os dois grupos. No entanto, nem a percentagem de aberrações cromossômicas, nem número de mutações diferiu entre os estágios tumorais.
associações clínicas
Não houve diferença na sobrevida foi encontrada comparando os grupos etários, mesmo quando se ajusta para o estágio do tumor no momento do diagnóstico. Houve uma tendência que a proporção de tumores do reto diminuiu com o aumento da idade (
P
= 0,08), e os pacientes mais jovens tendem a ter um tumor estádio mais avançado do que os pacientes idosos. A prevalência de estágio tumores III-IV foi de 54%, 46% e 36% nos 50, 51-70 e . 70 grupos, respectivamente
No conjunto total da amostra, estágio do tumor era a variável de prognóstico mais poderosa que diz respeito à sobrevida global de três anos, (
P Art 0,001). Na análise univariada, pacientes com tumores
TP53
mutantes tinham taxas de sobrevivência mais pobres do que os pacientes com o tipo selvagem
TP53
, 938 ± 31 dias vs. 1016 ± 23 dias (
P
= 0,04), respectivamente. No entanto, esta diferença não foi significativa quando corrigidos para o estágio do tumor.
TP53
mutações eram de maior significado prognóstico em tumores do lado direito, de 1051 ± 26 dias vs. 883 ± 65 dias para tipo selvagem e mutante
TP53
, respectivamente (
P
= 0,005).
Entre os pacientes na faixa etária mais jovem, aqueles com
KRAS
mutação tiveram uma sobrevida significativamente menor do que os pacientes com
KRAS
amostras do tipo selvagem, 841 ± 101 dias vs. 1033 ± 35 dias (
P
= 0,02), respectivamente. Nenhum dos outros parâmetros de mutação mostrou nenhuma diferença estatisticamente significativa em relação à sobrevivência, nem dentro nem entre os grupos etários.
Discussão
Descobrimos que o estado de mutação de um conjunto de genes do câncer conhecido varia em pacientes com CCR, dependendo da idade de início da doença, e fornecer mais evidências de diferenças no desenvolvimento somático de tumores em doentes jovens e idosos.
instabilidade de microssatélites estatuto
em todos os grupos etários, MSI foi estatisticamente significativamente associados com os tumores do lado direito, como esperado [18], [18], [31,32]. A frequência de MSI na presente série foi um pouco maior do que o relatado em outros lugares [33], [34], o que é melhor explicada por um excesso aleatória de tumores do lado direito na série total. No entanto, para o grupo de pacientes com idade inferior a 50 anos no momento do diagnóstico da frequência observada foram ligeiramente mais baixos do que o esperado [33], o que em parte pode ser explicado pela exclusão de pacientes com síndromes CRC conhecidos neste estudo.
pacientes com idade inferior a 50 anos, apenas 50% das amostras foram MSI mutado em um ou mais dos genes analisados, enquanto que em pacientes com idade superior a 50 para todas as amostras MSI indicadas as alterações do gene. Além disso,
BRAF
mutações não foram estatisticamente significativamente associada com o MSI no grupo de 50 anos, ao contrário do que era esperado [35]. A mutação no
BRAF
V600E é observado para induzir a infra-regulação de genes de reparo de DNA essenciais [36], com potencial para induzir MSI na célula, explicando essa correlação. Como
BRAF
mutações não são observados em tumores de pacientes com síndrome de Lynch [37], não podemos excluir que a MSI /
BRAF
amostras do tipo selvagem na presente série são de síndrome de Lynch clinicamente não detectada pacientes.
As mutações genéticas
mutações frequências em
KRAS, BRAF, PIK3CA, PTEN
, e
TP53
foram encontrados para estar dentro do intervalo anteriormente relatados de apoio a representatividade da série [38].
a coexistência de
BRAF
e
KRAS
mutações se presume ser incompatível com a proliferação, portanto, uma seleção negativa para a existência simultânea de ambas as mutações [12]. Fizemos confirmar uma correlação inversa entre mutações destes dois genes [39]. Além disso, um número crescente de tumores com um ou outro
mutação KRAS ou BRAF
foi observado com o aumento da idade, de acordo com um relatório recente sobre pacientes jovens com câncer colorretal [6].
No séries total tumores exibindo
BRAF
V600E eram tipicamente
TP53
tipo selvagem e
PTEN
mutado (Tabela S1), que também foi o caso de tumores dentro do 70 faixa etária. Assim, “
BRAF
V600E,
TP53
em peso,
PTEN
mut” pode ser considerada como um elemento de tumores esporádicos genuínos.
em comparação com a frequência relatada de 14% do
PIK3CA
mutações nos carcinomas colo-rectais no banco de dados COSMIC [38], a série atual mostra apenas 4% mutações. Isto pode em parte ser explicada pelo facto de que a série de corrente é enriquecida com amostras de pacientes jovens, e seus tumores não têm
PIK3CA
mutações. No entanto, esta última observação está em contraste com dois estudos anteriores [6], [40] que os relatórios de dois /um pacientes com menos de 50 anos com
PIK3CA
mutações. As diferentes metodologias utilizadas, tipo de amostra, fixados em formol ou tecido fresco congelado, eo tamanho da série pode explicar em parte essa diferença na frequência de mutação entre os estudos. Mutação tanto no oncogene
PIK3CA
ou o gene supressor de tumor
PTEN
pode levar a um acúmulo de PIP
3 e, a jusante de activação AKT. No entanto, uma vez que uma alteração na sequência
PTEN
implica um alelo de tipo selvagem remanescente, mutação activadora adicional na mesma via pode ser benéfico para as células tumorais [41]. Encontrámos 32 tumores com alteração (s) em cada um dos
PIK3CA
e /ou
PTEN
, incluindo sete tumores com vários
PTEN
aberrações. A sequência de codificação inteira de
PTEN
tem sido explorado [42] – [48], mas nenhum dos estudos investigaram os tumores de pacientes jovens especificamente. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório da combinação
PTEN
dados de sequência de codificação inteiras com o padrão de eliminação bruta no CRC de diferentes faixas etárias.
O
TP53
frequência de mutação foi significativamente maior no 50 faixa etária, do que nos outros grupos etários, o que é melhor explicada pela maior freqüência de cânceres lados e rectal deixados no grupo de 50 anos. Como esperado,
TP53
mutações foram associados a tumores MSS, ea diferença significativa entre os grupos de idade ainda era válida quando se analisa única tumores MSS.
Um índice de mutação foi calculada e tumores de pacientes idosos foram encontrados para ter acumulado mais mudanças de sequências genéticas do que os de pacientes jovens (1,5 contra 1,0), o que pode indicar uma diferença de tempo no desenvolvimento do tumor.
distinta composição genética de tumores de pacientes jovens e idosos
a partir de dados aCGH em um subconjunto de 41 amostras, observou-se que pacientes com menos de 50 anos tinham significativamente mais aberrações nos seus tumores do que os pacientes 70 anos fez,
ou seja
. um maior grau de complexidade do genoma. Contrariamente, como mencionado acima, os tumores de pacientes idosos teve o maior índice de mutação genética, embora este grupo incluía menos estágios avançados. Tomados em conjunto, pode-se especular que, entre os pacientes jovens não são portadores com predisposição genética que afecta genes que codificam proteínas que garantem a segregação cromossômica correta durante a mitose, ao invés de caminhos específicos.
Bardelli
et al.
[29] relataram que pacientes com doença metastática que são “quadruple negativo” no
KRAS BRAF-PIK3CA-PTEN-
conjunto de genes têm a maior probabilidade de resposta a terapias anti-EGFR. No entanto, atualmente só
KRAS
teste é recomendada antes da decisão no que diz respeito a tal tratamento, e
BRAF
teste é opcional [49].
Na presente série de primária cancros, frequências de mutação nestes quatro genes foram igualmente distribuídos entre todos os estágios tumorais. Por conseguinte, temos na seguinte hipótese de o número de respondedores potenciais com base em todo o conjunto de dados (Figura 2). Ao considerar os tumores com prejudicada
PTEN
e /ou mutada
PIK3CA
exclusivamente, a faixa etária mais jovem exibidos 16% (n = 7) mutações, em comparação com 1,4% (n = 1) na mais antigo grupo etário. Isto implica que para os pacientes mais idosos,
KRAS
e
BRAF
estado de mutação só revelará 98% dos pacientes não adequados para a terapia anti-EGFR, em comparação com 71% em pacientes com 50 anos . O efeito de mutações em
PIK3CA
e
PTEN
são debatidas no que diz respeito à terapia anti-EGFR [26], [28], [29]. Não obstante, se o seu estado mutacional não influencia sobre o efeito do tratamento com anti-EGFR, os pacientes mais jovens que se espera ter uma proporção ainda maior de respondedores potenciais para este tipo de tratamento do que os pacientes mais idosos (Figura 2).
distribuição percentual-wise de aberrações para
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA Comprar e
PTEN Comprar e suas combinações, no 50 faixa etária e 70 faixa etária. Os pacientes negativos para todas as mutações (negativos quadruple) são potenciais respondedores ao anti-EGFR-terapia. (Modificado de Bardelli
et al.
[
29
])
Associação de dados clínicos
A série amostra consecutiva de carcinomas colo-rectais de um único hospital mostraram distribuição global dos dados clínico-patológicos como esperado para uma coorte norueguês [1]. A proporção de cancros rectais diminuiu com o aumento da idade de início, ao passo que a tendência oposta foi observada para os tumores do lado direito, conforme relatado por outros [50], [51]. Além disso, a maior parte dos pacientes diagnosticados antes dos 50 anos de idade teve mais avançado estágio da doença em comparação com os grupos etários mais velhos. Isto pode reflectir que o CRC é inesperado em adultos jovens e sintomas são negligenciadas tanto pelo paciente e o médico [52]. Relatórios de jovens doentes com cancro colorectal difere no que diz respeito à agressividade da doença, e, por conseguinte, prognóstico [3], [52], [53]. No entanto, no presente estudo, a sobrevida global em três anos foi igual nos três grupos etários, mesmo quando o ajuste para o estágio do tumor. Isso pode indicar uma doença mais agressiva em pacientes jovens, como as pessoas mais velhas devem ter uma taxa de mortalidade mais elevada. Além disso, o grau mais elevado de complexidade observada nos tumores genómico a partir de jovens contra pacientes idosos também pode ser indicativo de uma diferença de agressividade. Note-se, que os jovens pacientes incluídos não são portadores de síndromes de câncer colorretal conhecido de acordo com critérios clínicos apenas.
O valor prognóstico e preditivo de
TP53
ainda é controverso [54]. Em nossos pacientes DataSet com
TP53
mutações tiveram sobrevivência significativamente menor do que os pacientes de tipo selvagem. Além disso, para pacientes com tumores do lado direito ou do MSI
TP53
mutações mostrou ainda maior valor prognóstico, em linha com resultados reportados pelo
TP53
grupo de estudo colaborativo -CRC [55].
em um estudo recente,
PIK3CA
mutações foram encontrados para servir como marcadores substitutos para a sobrevivência pobre em pacientes com câncer colorretal [24]. Como alguns
PIK3CA
mutações foram observadas em nosso conjunto de amostras, não foi possível confirmar estes resultados. No entanto, mutações foram encontradas apenas em amostras de pacientes mais velhos, e não estavam presentes em pacientes com metástases à distância, e só alguns em estágio III pacientes. Assim, nossos dados sugerem que o
PIK3CA
mutações são importantes para tumorigênese em pacientes idosos, mas não servem como um marcador para a capacidade de metástase.
Conclusão
Temos encontradas diferenças distintas na composição genética de carcinomas de pacientes jovens e idosos. Os tumores de pacientes jovens que não são portadores de síndromes hereditárias CRC conhecidos têm mutações genéticas menos, mas mais aberrações no número de cópias em todo o genoma. Estes dados sugerem que alguns pacientes jovens podem ter um potencial aumento do risco de câncer causado por alterações no gene (s) envolvido na manutenção segregação cromossômica correta.
Materiais e Métodos
Ética declaração
O consentimento informado foi obtido de todos os indivíduos incluídos. Os biobancos pesquisa são registrados de acordo com a legislação nacional e os estudos são aprovados pelo Comité Regional Medical Ética em Pesquisa (REK Sudeste: 1.2005.1629; REK do Sul, 2003: S-02126)
Os doentes. e amostras de tumor
um total de 181 pacientes foram incluídos no estudo,
ou seja
uma série consecutiva de 132 pacientes enriquecidos com uma série de 49 pacientes com doença em idade jovem ( 50 anos ). Cada série são descritos nos parágrafos seguintes. Os dados clínicos foram coletados prospectivamente. dados de óbitos foram recuperados a partir de qualquer dos registros do hospital ou do registo do norueguês População. Os dados clínicos e patológicos destas duas séries são apresentados na Tabela S3.
série consecutiva (n = 132).
Os pacientes submetidos à ressecção eletiva do adenocarcinoma colorretal em 2005-2007 no Hospital Universitário de Oslo , Aker, Oslo, foram incluídos. Os pacientes com FAP ou síndrome de Lynch foram excluídos com base em critérios clínicos. O tecido tumoral foi obtido imediatamente após a ressecção do espécime e instantaneamente congelados em azoto líquido. Todas as amostras de tecidos foram avaliadas por um patologista para estabelecer grau de diferenciação do conteúdo celular de carcinoma e de tumor.
séries de aparecimento precoce (n = 49).
Amostras de uma biobank de um multi-hospitalar estudo (INFAC-estudo – indivíduos com risco familiar de câncer), incluindo Hospital Oslo University, Aker, Oslo e outros cinco hospitais da mesma região geográfica da Noruega inscrito a partir de 2003-2008, foram incluídos no presente estudo. Os critérios de inclusão no INFAC-estudo foram idade 55 anos, excluindo aqueles que preencheram os critérios de todas as síndromes CRC conhecidos. tecido do tumor e amostras de mucosa normal correspondentes foram retirados do espécime ressecado no teatro de operação e prontamente incubadas em RNAlater. O tecido foi transferido para novos tubos depois de 36-72 horas, e armazenado a menos 80 ° C até à sua utilização. ADN a partir de tecidos normais e cancerosos foi extraída e utilizada para a análise.
amostras incluídas na análise CGH.
Para um subconjunto de pacientes (n = 41) de dados a partir de aCGH análises estavam disponíveis. Este subconjunto incluiu 24 pacientes com menos de 50 anos e 17 com mais de 70 anos no momento do diagnóstico primário. Os dados clínicos e mutacionais para estes pacientes são apresentadas na Tabela S2.
Agrupamento dos pacientes de acordo com a idade.
Pacientes da série de início precoce foram incluídos para enriquecer o número de pacientes de início precoce no conjunto total da amostra. Os pacientes da série início precoce foram selecionados para corresponder pacientes com menos de 55 anos na série consecutiva com relação ao sexo, idade média, estágio do tumor e localização, Tabela S3. Em seguida, as amostras a partir de duas séries foram combinadas e divididas em três grupos etários; sob idade 50 anos, 51 a 70 anos e mais de 70 anos, conhecido como 50, 51-70 e 70, respectivamente. A média de idade no momento do diagnóstico primário foi de 70 anos na série consecutiva, e que foi escolhido como ponto de corte para a faixa etária mais velha. O ponto de corte para o grupo etário mais jovem foi fixada em 50 anos, desde o início precoce pode ser devido a fatores genéticos herdados, e apenas ~ 5% de todo o CRC são diagnosticados antes dos 50 anos de idade. Os tumores no cólon proximal para a flexão do baço foram definidos como do lado direito: as do cólon restantes foram considerados como do lado esquerdo enquanto que recto foi definida como 15 cm da margem anal, quando medido com um proctoscópio rígida. doença localizada foi definido para /estágios AJCC UICC I e II e doença regional para estádios III e IV. utilizando
microssatélites instabilidade análise
Para todos os pacientes, foi analisada tumor e tecido normal ou sangue correspondente os marcadores de Bethesda [56]. A análise foi realizada como descrito por Wu
et ai.
[57]. Elevado grau de instabilidade microssatélite (MSI-H) em ADN de tumor, em comparação com DNA normal correspondente, foi definida quando dois ou mais marcadores mostraram perfil aberrante de pico após análise de fragmentos. Se tanto a amostra normal ea amostra de tumor de um paciente mostrou o mesmo padrão para todos os marcadores, o tumor foi considerado estável microssatélite (MSS). Análise
A mutação de KRAS, BRAF, PIK3CA, PTEN e TP53
para
BRAF
e
KRAS
, ativando mutações nas posições conhecidas para transportar com frequência alterações são relatados [11], [58]. Na
PIK3CA
mutações genéticas em cânceres colorretais agrupar em exons 9 e 20 [59], e por
TP53
e
PTEN
mutações são relatados ao longo da sequência de codificação inteira [ ,,,0],17], [60].
Para
TP53
e
PTEN
, a sequência de codificação total foram amplificados em reacções PCR multiplex, utilizando multiplex estojo de PCR, tal como recomendado pelo fornecedor (QIAGEN, GmbH, Hilden, Alemanha) [30], [60]. reações simplex PCR utilizando HotStar Taq (QIAGEN) foram utilizados para amplificar
PIK3CA
,
KRAS Comprar e
BRAF
amplicons [10], [59], [61]. Em
PIK3CA
exons 9 e 20 foram amplificados, no
KRAS
, exons 2 e 3, incluindo os códons frequentemente mutados 12, 13 e 61, e no
BRAF
exão 15, incluindo a mutação no codão 600, foram amplificados. Primers, condições e detalhes de fragmentos em execução estão descritos na Tabela S4.
Os produtos de PCR foram purificados utilizando colunas de Sephadex (Millipore, Billerica, MA, EUA e GE Healthcare, Chalfont St.Giles, Reino Unido) antes da incorporação do corante ddNTP marcado e sequenciação de 3730 no DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) [30]. Nos casos em que foi detectada uma mutação, um novo produto de PCR independente foi submetido a sequenciação para confirmar o resultado.
Multiplex dependente da ligação da sonda de amplificação (MLPA) de PTEN
Salsa MLPA kit P225- B2 PTEN (MRC Holland, Amsterdam, Holanda) foram utilizados de acordo com as instruções do distribuidor. No total, 25 sondas de cobrir o
gene PTEN
, um mínimo de duas sondas para cada um dos nove exões. Além disso, 10 sondas situadas noutro local no cromossoma 10, e 12 sondas de referência adicionais localizados em outros cromossomas serve como controlos. Os fragmentos amplificados foram analisados num analisador de ADN 3730 (Applied Biosystems). Os dados brutos foram analisados com Coffalyzer® (MRC Holland) com as configurações padrão. Pontos de corte de 1,2 e 0,8 foram utilizados para pontuação dos ganhos e perdas, respectivamente, além da avaliação individual do lote de cada amostra. Este marcador é determinado de acordo com o seguinte cálculo: uma cópia ganho ou perda de 60% das células num tumor triplóides é igual a 1,2 e 0,8, respectivamente. Pelo menos duas sondas vizinhas, localizadas no mesmo exão, com ganho ou perda concomitante, foram confinados para a atribuição de número de cópia aberrante em uma região.
Análise estatística
As variáveis clínicas foram testados para associações com mutacionais resultados para todos os genes analisados, e todos os genes foram testados para associações inter-relacional. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software PASW 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). O teste exato de Fisher foi utilizado para as variáveis de cross-tabulados.