Abstract

Objectivo

cancro colorectal de início precoce (CRC) representa uma forma clinicamente distinta da CRC, que é muitas vezes associado a um mau prognóstico. níveis de metilação de repetições genômicas, tais como elementos LINE-1 têm sido reconhecidos como fatores independentes para o aumento da mortalidade relacionada ao câncer. O estado de metilação de LINE-1 elementos em início precoce CRC não foi analisado anteriormente.

Design by

Foram analisados ​​343 tecidos CRC e 32 amostras de mucosa do cólon normais, incluindo 2 grupos independentes de CRC diagnosticado ≤50 anos de idade (n = 188), um grupo de esporádica CRC 50 anos (MSS n = 89; MSI n = 46), e um grupo de Lynch síndrome de CRCs (n = 20). a expressão da proteína tumoral incompatibilidade de reparação, status de instabilidade de microssatélites, LINE-1 e

MLH1

metilação, somática

BRAF V600E

mutação, e da linha germinativa

foram avaliados MUTYH

mutações.

resultados

os níveis médios de lINE-1 metilação (± DP) dos cinco grupos de estudo foram de início precoce CRC, 56,6% (8,6); esporádicos MSI, 67,1% (5,5); esporádica MSS, 65,1% (6,3); síndrome de Lynch, 66,3% (4.5) e mucosa normal, 76,5% (1,5). De início precoce CRC teve significativamente menor LINE-1 metilação do que qualquer outro grupo (p 0,0001). Em comparação com pacientes com 65% LINE-1 metilação em tumores, aqueles com ≥65% LINE-1 metilação tinham significativamente melhor sobrevida global (p = 0,026, teste logarítmico)

Conclusões

lINE-1 hipometilação constitui um recurso potencialmente importante de início precoce CRC, e sugere um subtipo molecular distinta. Mais estudos são necessários para avaliar o potencial de LINE-1 estado de metilação como um biomarcador de prognóstico para os jovens com CRC

Citation:. Antelo M, Balaguer F, Shia J, Shen Y, Hur K, Moreira L, et ai. (2012) um alto grau de LINE-1 hipometilação é uma característica única de início precoce de cancro colorrectal. PLoS ONE 7 (9): e45357. doi: 10.1371 /journal.pone.0045357

editor: Anthony WI. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 02 de julho de 2012; Aceito: 15 de agosto de 2012; Publicação: 25 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Antelo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O presente trabalho foi apoiado por subsídios R01 CA72851 e CA129286 do Instituto Nacional do Câncer, Instituto Nacional de Saúde; e os fundos do Instituto de Investigação Baylor para CRB e AG. FB foi apoiado por uma bolsa da Fundação Alfonso Martín Escudero e do Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). MA foi apoiada por uma “Bolsa de Tipo I de Pós-Graduação” dado pelo CONICET (Conselho Nacional de Investigações Científicas e Técnicas) dependente do Ministério da Ciência e Tecnologia da Argentina. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é um importante problema de saúde pública e representa o segundo tipo de câncer mais frequente ea segunda maior de mortalidade relacionada com o cancro causa na maior parte do mundo desenvolvido. A cada ano, um milhão de pessoas desenvolvem CRC, e 40-50% deles morrem dentro de 5 anos de diagnóstico [1]. Os CRCs são altamente heterogénea tanto histopatologicamente, e ao nível molecular e genética. Parece que a biologia e a resposta a terapias é igualmente diversos. A compreensão dos mecanismos moleculares de carcinogénese colorectal é essencial para o desenvolvimento de novas estratégias para a prevenção, diagnóstico, tratamento e prognóstico. Embora CRC tem sido um grande foco de atenção para a pesquisa básica e clínica durante os últimos 25 anos, ainda não temos biomarcadores robustas que podem ser usados ​​para o diagnóstico e tratamento da CRC.

O pico de incidência de CRC é entre 60 -70 anos de idade; no entanto até ocorrer a 10% de todos os casos antes da idade 50. Além disso, estudos epidemiológicos recentes sugerem que a incidência de CRC de início precoce está aumentando, o que representa um importante desafio clínico [2]. De início precoce CRC apresenta frequentemente com tumores em estágio avançado, o que contribui para uma maior taxa de mortalidade [3]. Desde os jovens não estão incluídas nos programas de rastreio CRC, há uma necessidade urgente de compreender a biologia dos tumores de início precoce, o que poderia facilitar a detecção e tratamento destes cancros mais cedo.

Embora de início precoce CRC levanta a possibilidade de um fator de risco hereditário, os conhecidos não-polipose síndromes hereditárias CRC (síndrome de Lynch e

MUTYH

-associated CRC) representa não mais do que 15-20% dos casos neste grupo [4], [5] , [6]. Síndrome de Lynch é responsável por cerca de 3% de todos os casos de CRC, e é causada por mutações germinativas do reparo incompatível DNA (MMR) genes (

MLH1, MSH2, MSH6

e

PMS2

) [7 ]. É caracterizada por cancros de início precoce que surgem nas colorectum e outros órgãos, e não existem actualmente várias estratégias e algoritmos para prever a presença de uma mutação da linha germinativa em um dos genes MMR [8], [9], [10], [11]. mutações bialélicos no

MUTYH

gene (um membro do sistema de excisão de bases de reparação) é responsável por 1% de todo o CRC, e, geralmente, faz com que uma forma atenuada da polipose, embora 30% destes pacientes pode se manifestar como uma não-polipose CRC [12] .Identifying indivíduos com mutações germinativas que predispõem a CRC tem implicações significativas para o manejo clínico de indivíduos afetados e para seus familiares.

os restantes 75-80% do CRC de início precoce representa um outro grupo em que a etiologia genética não foi ainda descoberto. Em contraste com o CRC em indivíduos mais velhos, de início precoce CRC é frequentemente caracterizada por estágio mais avançado, a localização distal (especialmente no reto), tumor mucinoso e pouco diferenciadas com células em anel de sinete, e um pior prognóstico [4], [13], [14]. A maioria destes cancros não mostram instabilidade de microssatélites (MSI), mas são estáveis ​​microssatélite (MSS). A base molecular para as diferenças biológicas e comportamentais em início precoce CRC não é clara.

Hipometilação de ADN à escala Genoma

é uma alteração epigenética frequente que é um evento precoce em CRC e tem sido associado com a activação de certos proto -oncogenes (ie MET) [15] e a presença de instabilidade cromossômica [16], [17]. A hipometilação de DNA global pode ser medida indirectamente através da avaliação do estado de metilação de sequências de repetição de nucleótidos elemento-1 (linha-1) de comprimento intercaladas [18]. O ensaio pyrosequencing para LINE-1 metilação tem sido encontrado para ser quantitativa, robusto e reprodutível [19]. O grau de LINE-1 hipometilação tem sido reconhecida como um fator independente para o aumento da mortalidade relacionada ao câncer e mortalidade global em pacientes CRC [20]. Embora tenha sido sugerido que a linha-1 está associado com hipometilação CRC em pacientes mais jovens [21], a associação específica entre o estado de metilação da Linha-1 e elementos de início precoce CRC não foi ainda analisada.

A objetivo deste estudo foi caracterizar a clínica, histológica e características moleculares de uma grande coorte de CRCs de início precoce no contexto do estado de metilação de elementos lINE-1. Nossos resultados indicam que LINE-1 hipometilação nestes tumores constitui uma característica única e específica, que é sugestivo de um subtipo molecular distinta nestas neoplasias colorretais. Nossos resultados sugerem que o status de LINE-1 metilação poderia ser usado como um biomarcador de prognóstico para os jovens com CRC.

Pacientes e Métodos

Ética Declaração

O estudo foi aprovado pelo a Institutional Review Boards (IRB) de cada centro participante, incluindo Hospital of Gastroenterology “Dr. C. B. Udaondo “, Buenos Aires, Argentina, Baylor University Medical Center, Dallas, TX eo consórcio Epicolon. Um consentimento informado foi obtido de todos os pacientes.

Os pacientes

Foram analisados ​​343 CRCs de diferentes grupos clínico-patológico e 32 amostras de mucosa do cólon normais. Incluímos uma coorte de 118 pacientes com CCR retrospectivamente recrutados ≤ 50 anos atendidos no Disciplina de Oncologia do Hospital Público argentino of Gastroenterology, entre 1993 e 2009. Os pacientes com polipose colorretal ou doença inflamatória intestinal foram excluídos. características demográficas e clínicas-patológicos foram coletados de histórico médico de cada paciente, e história familiar de câncer em primeiro e segundo grau parentes foi obtida por entrevista pessoal. O tempo médio de acompanhamento foi de 39 meses (variação de 1.5-195 meses). Para as análises de LINE-1 metilação, como um grupo de validação, que incluiu uma coorte descrito anteriormente de 70 pacientes com CCR diagnosticados ≤ 50 anos de idade tratados em dois centros espanhóis (Hospital Clinic de Barcelona e Hospital de Donostia) entre 1995-2007 [4 ]. Também incluiu uma coorte de base populacional de CRCs esporádicos 50 anos recrutados em Espanha (Epicolon I estudo) [9] categorizados pela presença de MSI ( “MSI esporádica”, devido à somática

MLH1

hipermetilação do promotor [n = 46], e “MSS esporádica” [n = 89]); e um grupo de CRCs síndrome de Lynch recrutados no Baylor University Medical Center (n = 20). Nós histologicamente analisadas mucosa do cólon normal a partir de 32 indivíduos submetidos a cirurgia do cólon para além do câncer razões (ou seja, diverticulose) recrutadas no Hospital Clinic de Barcelona, ​​Espanha.

DNA Isolation

O DNA genômico de cada paciente foram extraídos a partir de tecidos (FFPE) microdissecadas embebidos em parafina fixados com formalina e tumorais usando o kit de tecido QIAamp (Qiagen, Courtaboeuf, França) de acordo com as instruções dos fabricantes. DNA do sangue periférico foi extraído utilizando o QiaAmpDNA sangue Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, França). Para tumores do reto em que quimio-radioterapia foi administrada, amostras de tecidos de pré-tratamento foram analisados.

Tumor Incompatibilidade de Expressão Repair Protein

Um bloco de tecido tumoral FFPE foi selecionado por caso e imunocoloração foi realizada utilizando protocolos padrão. Foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais de ratinho: anti-MLH1 (clone G168-728, diluída 1:250, PharMingen, San Diego, CA), anti-MSH2 (clone FE11, diluídas a 1:50, Oncogene ResearchProducts, Cambridge, MA), anti-MSH6 (clone GRBP.P1 /2.D4, diluída 1:200; Serotec Inc., Raleigh, NC) e anti-PMS2 (A16-4 clone, diluída 1:200, BD PharMingen, San Diego, CA). Um tumor foi considerado negativo para a expressão da proteína somente se o epitélio neoplásico faltava coloração nuclear, enquanto as células epiteliais ou do estroma não neoplásicas retido expressão normal dessa proteína.

Tumor instabilidade de microssatélites Análise

análise

MSI foi levada a cabo usando alvos repetição microssatélites cinco mononucleótido (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 e NR-27) em um sistema de PCR pentaplex. As sequências dos iniciadores foram descritos anteriormente [22]. Tumores com instabilidade em ≥3 esses marcadores foram classificados como microssatélites instável (MSI) e aqueles mostrando instabilidade em ≤ 2 marcadores como estável microssatélite (MSS). Os pesquisadores marcando imunocoloração estavam cegos para os resultados MSI, e vice-versa.

As análises de metilação

DNA foi modificado com sódio-bissulfito utilizando o Kit EZ metilação Gold (Zymo Research, Orange, CA) . A metilação de sequências LINE-1 e o promotor de

MLH1

foi analisada por bissulfito pyrosequencing quantitativa, tal como descrito anteriormente [23]. Primers estão detalhados na Tabela S1.

germinativa MUTYH Gene Análise de Mutantes

Todos os pacientes foram selecionados para os dois

MUTYH

mutações mais prevalentes em populações caucasianas (p.G393D e p .Y176C) por pyrosequencing. Os iniciadores são detalhados na Tabela S1. Em heterozigotos para qualquer uma destas mutações, a região de codificação e exon-intron limites do

gene MUTYH

foram rastreados por SSCP com o seqüenciamento de turnos banda anormais, como descrito anteriormente [12].

somatic BRAF V600Emutation análise

O

BRAF V600E

análise mutacional foi realizada por pyrosequencing. Os iniciadores de PCR e sequenciamento são detalhados na Tabela S1.

Análise Estatística

As variáveis ​​quantitativas foram comparadas pelo teste de Student. As variáveis ​​qualitativas foram comparadas usando a Praça Chi ou teste de Fisher quando apropriado. Para as associações com deficiência de MMR e LINE-1 metilação (tratada como uma variável binária) uma análise multivariada, utilizando um procedimento de regressão logística backward stepwise foi realizada para avaliar as associações independentes. O teste de Mann Whitney foi utilizado para comparar valores LINE-1. A sobrevida global associado com variáveis ​​clínico-patológicas e moleculares (estágio do tumor, a deficiência de MMR, localização do tumor, história familiar de CRC, a diferenciação do tumor, componente mucinoso, linfócitos infiltrantes tumorais e LINE-1 metilação) foram calculados pelo método de Kaplan-Meier (log teste de classificação). Um valor-p de dois lados do 0,05 foi considerado significativo. software SPSS v17 foi usada para análise estatística.

Resultados

Características do paciente

Foram recrutados 118 pacientes com início precoce CRC. características clínico-patológicas são apresentados na Tabela 1. A média de idade no momento do diagnóstico foi de 37 anos (desvio padrão (SD), 8,25), e 61 (51,7%) pacientes eram do sexo feminino. Em 34 (28,8%) o tumor era proximal à flexão do baço, 35 (29,6%) estavam no cólon distal, e 49 (41,6%) estavam no reto. Na apresentação, 22 (18,6%) pacientes apresentavam 1-10 adenomas síncronos; 18 apresentou com 1-5 adenomas e 4 pacientes tiveram 6-10 adenomas. Três casos (2,5%) tinha um tumor síncrona (tumor 2 CRC e 1 neuroendócrino no apêndice) e 5 (4,2%) desenvolveram um tumor metacrônica durante o acompanhamento (4 CRC e 1 carcinoma urotelial). A maioria dos casos (77; 65,3%) foram diagnosticados em estágios avançados (III-IV). Mal tumores diferenciados foram observados em 15 (13,1%) pacientes, 41 (34,7%) tinham características mucinoso e 65 (55%) tinham características patológicas sugestivas do fenótipo MSI, com um ou mais dos seguintes: células em anel de sinete, Crohn’s- como reacção linfocítica, linfócitos infiltram no tumor, padrão de crescimento medular, ou características anaplásico. Mais de 85% (n = 100) dos pacientes tinha experimentado dor abdominal antes do diagnóstico, 83 (70%) apresentaram uma alteração nos hábitos intestinais, 71 (60%) apresentaram sangramento e perda de peso rectal, 34 (29%) teve a anemia ferropriva, 18 (15,5%) apresentaram obstrução intestinal, e 6 (5%) com perfuração. O atraso médio entre os sintomas iniciais eo diagnóstico CRC foi de 6,5 ± 5 meses. Quinze pacientes (12,7%) tinham uma história familiar de CRC ou de outra Lynch neoplasia associada à síndrome em primeiro ou de segundo grau parentes. Três pacientes preencheram os critérios de Amsterdam I, 3 pacientes preencheram os critérios de Amsterdam II, 4 pacientes tiveram um parente de primeiro grau com CRC, 3 pacientes tinham dois ou mais parentes de segundo grau com CRC, e 2 pacientes tiveram um parente até segundo grau com CRC.

germinativa MUTYH mutação genética Análise

mutações Bialélicos MUTYH foram encontrados em 1/91 casos MMR-proficientes (1,1%) (). Este único caso era um paciente de 29 anos de idade, com uma fase III do câncer retal e 2 adenomas síncronos. Dois irmãos de este paciente tinha uma história de polipose atenuada e CRC (apresentado com 30 adenomas e outro com 8 adenomas e um

in situ

carcinoma no ceco); em ambos os irmãos colectomias total ter sido realizada. Finalmente, foram identificados dois pacientes heterozigotos p.G393D que não tinham características clínico-patológicas específicas (Tabela S2).

Mismatch Repair Análise Deficiência

deficiência de MMR foi avaliada por análise MSI e imuno-histoquímica, e foi definida pela presença de MSI em um tumor, e /ou perda de expressão de qualquer uma das proteínas de MMR. Vinte e sete (22,9%) tumores foram classificados como MMR deficiente, e 25 deles apresentaram perda de expressão da proteína (8 para MLH1 /PMS2, 1 para MLH1 isolado, 4 para PMS2 isolado, 11 para MSH2 /MSH6, e 1 para MSH6 isolado ). características clínico-patológicas de pacientes com deficiência de MMR estão resumidos na Tabela 2.

Quase todos os casos de MSI teve perda de expressão da proteína; dois casos com MSI retido expressão normal de todas as quatro proteínas. Da mesma forma, um caso com a perda de expressão MSH6 e um caso com perda de PMS2 foram MSS. O último paciente era uma mulher de 24 anos que teve CRC aos 15 anos, um carcinoma urotelial aos 23 anos, uma CRC metacrônica aos 24 anos, e, finalmente, um linfoma de célula B mediastinal. Seus espécime CRC apresentaram perda de expressão de PMS2 em células de tumor e de cólon normal em torno do tecido, conduzindo a um diagnóstico presuntivo de síndrome de deficiência de MMR-constitucional devido a mutações PMS2 bi-alélicos.

Como se mostra na Tabela 1, em comparação com tumores MMR-proficientes, tumores deficientes em MMR tinham maior probabilidade de estar localizado no cólon proximal (59,3%

vs. 19,8%, p = 0,0001), a ser mucinoso (63%

vs

. 26,4%, p = 0,0001), para ter linfócitos infiltram no tumor (59,3%

vs.

11,5%, p = 0,0001), e de ter patologia MSI-sugestiva (81,5%

vs

. 47,2%, p = 0,002). tumores deficientes MMR também foram mais propensos a serem diagnosticados numa fase inferior (fase I-II:. 51,9%

vs

29,7%, p = 0,03) e ter menos recorrência do tumor ou progressão (22,2%

vs

. 44%, p = 0,042). A análise multivariada mostrou que as variáveis ​​independentes associadas à deficiência de MMR foram: localização proximal (OR = 3,86 [IC 95%: 1,32-11,32]; p = 0,013), características mucinoso (OR = 3,38 [IC 95%: 1,16-9,84]; p [IC 95%: 2,93-26,31] = 0,025) e na presença de tumores linfócitos infiltrantes (OR = 8,8; p = 0,0001). Embora não houve diferença na idade de diagnóstico CRC entre os 2 grupos, a chance de ter um tumor MMR deficiente foi maior entre os pacientes mais jovens (12-30 anos: 8/27, 29,6%; 31-40 anos: 9 /45, 20%, 41-50 anos:. 10/46, 21,7%)

Somatic

BRAF

mutação estava presente em um tumor MMR-deficiente (Tabela 2). Este caso foi um homem de 49 anos de idade com um tumor MSI no ceco, que mostrou a perda de expressão de proteínas MLH1 e PMS2. Este caso mostrou elevado grau de

MLH1

metilação do promotor (88%) e foi, portanto, provavelmente associado com CpG fenótipo ilha methylator (CIMP) [24]. No resto do

MLH1

tumores -deficient, presumivelmente portadores de

MLH1

mutações germinativas, 4 mostraram níveis muito baixos de metilação (variação de 1-2%), e os outros 4 mostrou níveis intermediários (variação de 25-51%).

lINE-1 metilação Análise

Foi utilizado o método bisulfite pyrosequencing quantitativa para determinar o estado de metilação de lINE-1 seqüências repetitivas no CRCs. A metilação média no CRCs era 59,97% (desvio padrão, 6,57), que se seguiu uma distribuição normal (Figura S1). características clínico-patológicas associadas com LINE-1 metilação são apresentados na Tabela 3. Uma diferença significativa no estado LINE-1 metilação foi encontrada de acordo com a localização do tumor, com baixos níveis de metilação em distal em comparação com tumores proximais (59,02%

vs .

62,3%, p = 0,015). Além disso, uma tendência para níveis mais baixos de metilação foi encontrada nas fêmeas (58,87%

vs. 60,93, P = 0,092) e em tumores não-mucinosos (59,24%

vs. 61,41%

, p = 0,096). Não há diferenças no estado de LINE-1 metilação foi encontrado com qualquer das outras características clínico-patológico.

Em seguida, compararam os níveis de metilação LINE-1 desta série com um outro grupo independente de pacientes com CCR diagnosticados at 50 anos de idade recrutados em Espanha [4], 2 grupos de pacientes com CRC esporádicos diagnosticados 50 anos de idade, categorizados pela presença ou ausência de MSI (MSI, n = 46, média de idade: 70,2 + 13,9 anos idade;; e MSS, n = 89 média de idade: 70,6 ± 11,4 anos de idade), um grupo de síndrome de Lynch CRCs (n = 20), e a mucosa de cólon normal de indivíduos sem tumores (n = 32) (Figura 1 e Tabela 4 ). características clínico-patológicas de ambas as coortes de CRCs de início precoce estão representados na Tabela S3. Ambos os grupos foram semelhantes em termos de localização do tumor e características patológicas do tumor. Como esperado, as médias LINHA-1 níveis de metilação em mucosa de cólon normal foram maiores do que em tecidos de tumor para todos os grupos. níveis de metilação LINE-1 em CRCs de início precoce foi de 59,9% (SD, 6,5) e 51,1% (SD, 9.2) para a Argentina e os grupos espanhóis, respectivamente. O nível médio de metilação no grupo combinado de início precoce CRCs (n = 185) foi de 56,6% (DP, 8,6). Curiosamente, tumor LINE-1 níveis de metilação nas duas coortes independentes de início precoce CRC foram significativamente menores do que a observada em CRCs mais velho de início e tumores síndrome de Lynch (Tabela 4), sugerindo que este representa uma característica única deste subgrupo de tumores (p 0,0001 para todas as comparações). LINE-1 níveis hipometilação foram semelhantes nos mais velhos de início tumores MSI esporádicas (67,1%, DP 5,5), Lynch síndrome CRCs (66,3%, DP 4,5), e tumores esporádicos MSS (65,1%, SD 6.3).

pyrosequencing Bissulfito de lINE-1 em tecidos colorretais; mucosa normal (n = 32), de início precoce CRC da Argentina (n = 116), início precoce CRC de Espanha (n = 70), mais velho CRC início com a estabilidade de microssatélites (MSS; n = 89), mais velho CRC início, com instabilidade de microssatélites (MSI) associado a

MLH1

hipermetilação promotor (n = 46) e Lynch síndrome CRCs (n = 20) .A barra horizontal preta indica o nível médio de metilação.

As análises de sobrevivência

O acompanhamento foi disponíveis em todos os 118 pacientes, variando de 1,5 a 195 meses, com média de 39 meses. A taxa de sobrevivência de 3 anos para todos os 118 pacientes nesta série foi de 84,7%; 46 pacientes (39%) recaíram ou tiveram progressão da doença, 22 (18,6%) morreram, e 3 pacientes foram perdidos para follow-up. estágio do tumor avançado foi significativamente associada com uma sobrevida global de 3 anos pior (fases I-II: 92,9% vs. fases III-IV: 82,9%; p = 0,046, teste logarítmico) e observou-se uma tendência para uma melhor sobrevida em pacientes com tumor mucinoso (95,1% vs 82,9%, p = 0,077, teste logarítmico) ou com linfócitos infiltrantes de tumor (96,2% vs 85,2%, P = 0,16, respectivamente; teste logarítmico). Pacientes com tumores MMR-deficientes mostraram uma tendência no sentido de uma melhor sobrevida de 3 anos em geral (96,3%

vs

83,5%;. P = 0,1, log-rank).

Em seguida, avaliou-se a efeito de lINE-1 hipometilação na sobrevida global dos pacientes com CCR. Com o objetivo de identificar um valor de corte de LINE-1, que podia distinguir um grupo de pacientes com pior prognóstico, foram avaliados vários pontos de corte a partir do nível mais baixo de LINE-1 metilação. Descobrimos que, em comparação com pacientes com 65% LINE-1 metilação, aqueles com ≥65% LINE-1 metilação tinham significativamente melhor sobrevida global (83,5% vs. 100%; p = 0,026, log-rank test; p = 0,039 , o teste exato de Fisher; Figura 2). Comparação das características clínico-patológicos e moleculares de pacientes de acordo com o nível da linha 1-metilação é mostrado na Tabela 5. Curiosamente, os tumores com a linha 1-metilação ≥65% eram mais frequentemente mucinoso (60,9% vs 24,5%, p = 0,003 ) e os pacientes apresentaram maior frequência de tumores sincrônicos ou metacrônicos (13% vs 2,2%, p = 0,054). A análise multivariada mostrou tumor mucinoso como a única variável associada a tumor com LINE-1≥65% (OR = 4,32 (IC 95%: 1,65-11,34); p = 0,003), independentemente do estado de deficiência de MMR

marcas de escala verticais

indicam eventos censurados. A linha verde representa a sobrevivência em CRCs com LINE-1 hipometilação 65% (n = 92) e a linha azul representa LINE-1 metilação ≥65% (n = 23). valor de p para log rank eo teste exato de Fisher são mostrados.

Discussão

Vários estudos têm sugerido que o início precoce CRC constitui uma doença biologicamente distinta que está frequentemente associado a estágio avançado, tumores distais, e mau prognóstico. Nós e outros autores mostraram que os conhecidos síndromes cancro hereditário explicam apenas numa minoria de casos CRC início precoce [2], [4], [5], [13]; Por conseguinte, o mecanismo patogénico, na maioria dos casos permanece desconhecida. Neste estudo objetivou-se obter mais conhecimentos sobre a patogênese da CRC de início precoce, avaliando as características clínico-patológicas e moleculares de 118 pacientes com início precoce CRC. O resultado mais interessante e inovador observamos é que LINE-1 hipometilação constitui uma característica única de pacientes com CCR de início precoce. LINHA-1 hipometilação é um marcador substituto para a hipometilação de todo o genoma e está associada com o aumento da instabilidade cromossómica [16], [17]; portanto, esta descoberta pode ajudar a explicar alguns dos mecanismos biológicos subjacentes início precoce CRC. Além disso, verificou-se que a freqüência da deficiência de MMR nesta coorte é ~ 20%, o que é consistente com relatórios anteriores que caracterizaram essas populações [4], [5], [6]. Finalmente, descobrimos que

MUTYH

contas de deficiência para ~ 1% dos CRCs MMR-proficientes. Este trabalho e com a ajuda de trabalho anterior excluir uma série de possíveis explicações para início precoce CRC.

O cancro é uma doença complexa, que surge como resultado de ambas as alterações genéticas e epigenéticas. Os CRCs humano muitas vezes exibem alterações na metilação do DNA, e que tem sido conhecido durante décadas que a hipometilação de todo o genoma é uma característica consistente bioquímica de tumores colorrectais humanos [16], [17], [25]. Em ratinhos, a hipometilação do ADN é suficiente para induzir linfomas de célula T [26]. hipometilação do genoma desempenha um papel causal no câncer através de diferentes mecanismos: a instabilidade genômica, a ativação da transcrição de proto-oncogenes, ativação de retrovírus endógenos e elementos de transposição, ea indução de mediadores inflamatórios. Todos estes mecanismos têm sido associados a hipometilação de DNA, mau prognóstico e a agressividade do tumor [26], [27], [28], [29], [30], [31]. elementos nucleotídeos repetitivas, incluindo elementos-1 nucleotídeos de comprimento, intercalados (ie, LINE-1) contêm numerosos locais de CpG, e estudos anteriores demonstraram que o nível de LINE-1 metilação é um indicador preciso do teor de 5-metilcitosina celular [18], que reflecte metilação global do DNA. Nos últimos anos, tem sido sugerido que a linha 1-metilação pode identificar diferentes subtipos moleculares de CRC. CIMP e MSI estão inversamente associados com a hipometilação do ADN, sugerindo que a hipometilação genómico representa uma via alternativa para a progressão de CRC, e pode reflectir um processo de doença fundamentalmente diferente, [33] [32]. Além disso, LINE-1 hipometilação tem sido associada com pior sobrevida em pacientes com CRC, e representa um fator independente para o aumento da mortalidade relacionada com o cancro ea mortalidade geral [20]. Portanto, a avaliação da tumoral LINE-1 metilação e sua correlação com características clínicas e patológicas é importante para determinar o potencial valor clínico deste biomarcador.

Foi utilizado um ensaio pyrosequencing quantitativo para LINE-1 metilação, que é um método robusto, preciso e reprodutível para quantificar precisamente este em tumores individuais [18]. Em comparação com tumores colorretais mais velho de início, encontramos níveis significativamente mais baixos de LINE-1 metilação em CRCs de início precoce. Esta observação foi validado em um conjunto independente de pacientes com CCR de início precoce, reforçando a força de nossas conclusões. Além disso, descobrimos que LINE-1 hipometilação foi associado a tumores distais e pior prognóstico. Embora não existam estudos anteriores que examinaram especificamente LINE-1 metilação em pacientes CRC de início precoce, um estudo recente sugeriu uma relação entre maior LINE-1 hipometilação no CRC e início mais precoce do cancro ( 60 anos) [21] . Globalmente estes resultados sugerem a presença de um subtipo específico de CRC com um único mecanismo patogénico [4], [13]. Como o grau de LINE-1 hipometilação é um marcador de prognóstico no CRC e os nossos dados mostram que LINE-1 hipometilação é uma característica da CRC de início precoce, este estudo fornece um novo e explicação previamente não reconhecido por algumas das diferenças biológicas (tumor localização, prognóstico e características patológicas) envolvido em CRCs de início precoce. Estes resultados fornecem uma oportunidade para melhorar a nossa compreensão do mecanismo por trás de início precoce CRC. A este respeito, estamos atualmente investigando se LINE-1 hipometilação provoca a reactivação da transcrição direta de certos proto-oncogenes neste cenário, uma característica única que pode ajudar a explicar o comportamento clínico agressivo de CRC de início precoce. Além disso, os nossos resultados dão origem à hipótese de que a linha de hipometilação-1 no sangue periférico também pode ser avaliada como um marcador de prognóstico em CRCs e de início precoce.

síndrome de Lynch é a causa mais frequente de hereditária CRC, e representa cerca de 1-3% de todos os CRCs [7]. É uma condição autossômica dominante causada por mutações germinativas nos genes DNA MMR (

MLH1, MSH2, MSH6, PMS2

), e

MSH2

e

MLH1

conta para ~ 90% das famílias identificáveis. Este síndrome tem uma penetrância variável dependente do gene para o CDC e carcinoma do endométrio, e um risco aumentado para vários outros tumores extra. O diagnóstico da síndrome de Lynch tem sido tradicionalmente baseada na análise de deficiência de MMR tumor quando esta doença é suspeita [10], [11], mas o diagnóstico definitivo é estabelecido por encontrar uma mutação germinativa deletério em um gene DNA MMR. No entanto, a detecção de síndroma de Lynch é um desafio particular, na ausência de uma história familiar de confiança. Por esta razão, a triagem universal com a análise do tumor MMR-deficiência tenha sido sugerido [34], [35]. Nós mostramos anteriormente que as contas de deficiência de MMR para até 20% dos casos de CRC início precoce [4], [5]. Descobrimos também que o padrão da deficiência de MMR em pacientes de CRC início precoce não é idêntico ao de todos os casos de síndroma de Lynch, e é caracterizado por em aumento da frequência de deficiência MSH6 e PMS2. Outro desafio diagnóstico são MSH6 deficiente CRC, pois estes podem ser dispensada se o algoritmo de rastreio depende inteiramente de testes MSI e não inclui MMR imunohistoquímica [22]. No presente estudo, avaliou-se o estado de MMR em uma população argentina de CRC de início precoce, analisando tanto a MSI e imuno-histoquímica dos quatro proteínas MMR. Vinte e sete (22,9%) tumores foram classificados como MMR deficiente. MSH2 e deficiência MLH1 responsável pela maioria dos casos, no entanto, até 20% foram devidas a deficiência seja MSH6 ou PMS2. Um dos 9 casos MLH1 com deficiência teve um

BRAF

mutação, que é tipicamente associada com

MLH1

hipermetilação do promotor.