Abstract

Um dos principais fatores prognósticos em câncer de reto é linfonodo metástases. A formação de metástases linfáticas depende da existência de um nicho premetastatic. Um factor importante anterior metástase são vasos linfáticos que estão localizados no nódulo linfático. Assim, a ocorrência de linf intranodal é pensado para indicar metástase distante e pior prognóstico. Para avaliar a importância de linfonodo lymphangiogenesis, estudamos formol fixa, embebidos em parafina adenocarcinomas e gânglios linfáticos regionais de 203 pacientes com câncer retal que foram tratados com radioquimioterapia neoadjuvante e cirurgia curativa consecutivos com câncer livre margens cirúrgicas (R0). vasos linfáticos regionais nódulos linfáticos foram detectados por imuno-histoquímica para podoplanina (D2-40). Nossos resultados mostram que a presença de vasos linfáticos nos linfonodos regionais afeta significativamente a sobrevida livre de doença em univariada e multivariada. Em contraste, não houve correlação entre a densidade de vasos linfáticos peritumoral ou intratumoral e prognóstico. Na verdade, nosso estudo demonstra a importância de lymphangiogenesis nos gânglios linfáticos regionais após radioquimioterapia neoadjuvante e cirurgia consecutivo como um marcador de prognóstico independente. A coloração para lymphangiogenesis e métodos de imagiologia intravital da linfangiogênese e fluxo linfático intranodal pode ser uma estratégia útil para prever o resultado a longo prazo em pacientes com câncer retal. Além disso, a adição de agentes para padronizados esquemas de tratamento neoadjuvante bloqueio VEGF-pode ser indicada no câncer retal avançado

Citation:. Jakob C, Aust DE, Liebscher B, Baretton GB, Datta K, Muders MH (2011) Linfangiogênese em linfonodos regionais é um prognóstico marcador independente em pacientes com câncer retal após neoadjuvante tratamento. PLoS ONE 6 (11): e27402. doi: 10.1371 /journal.pone.0027402

editor: Soumitro Pal, do Hospital Infantil de Boston Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de setembro de 2011; Aceito: 17 de outubro de 2011; Publicação: 07 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Jakob et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Nenhuma corrente fontes externas financiar este estudo específico. Geralmente, o trabalho dos pesquisadores foi apoiado por bolsas de MHM (Wilhelm Sander Stiftung fur Krebsforschung) e KD (R01-NIH, CA140432)

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pré-operatória (neoadjuvante), seguido por cirurgia curativa tornou-se no cancro rectal localmente avançado [1]. A regressão do tumor histopatológico como correlato para a eficácia do tratamento local varia de nenhuma às mudanças regressivas mínimas para completar resposta [2], [3]. O estado dos linfonodos após radioquimioterapia neoadjuvante, no entanto, continua a ser o fator prognóstico independente mais importante para a sobrevivência livre de doença, como pacientes com gânglios positivos linfáticos pós-terapêuticos (YPN +) têm um prognóstico desfavorável, independentemente da regressão do tumor primário [2], [3], [4], [5], [6]. Assim, a inibição de metástases em linfonodos regionais pode ser uma avenida futuro eficaz no tratamento de pacientes com câncer retal. Portanto, os esforços foram feitos para descobrir os mecanismos da metástase ganglionar. Tem sido sugerido que a indução da linfangiogénese no tumor primário e nos gânglios linfáticos contribui significativamente para metástases de tumores [7], [8]. Neste estudo, foram validados lymphangiogenesis nos linfonodos regionais como preditor de mau prognóstico e facilitador para metástases à distância em uma coorte de neoadjuvante tratados pacientes com câncer retal avançado. É um indicador melhor do que as densidades dos vasos linfáticos peri e intratumorais ou sistemas de classificação de regressão do tumor padronizados para este grupo de pacientes com câncer retal.

Resultados

caracterização clínico-patológico de coorte avaliada

Todos os pacientes foram submetidos a ressecção do reto com a excisão total do mesorreto após radioquimioterapia neoadjuvante. Em todos os pacientes, a ressecção localmente curativa foi alcançado (R0-situação). O estadiamento patológico é relatado na Tabela 1. regressão completa do tumor foi observada [9] em 10 casos (5%). 57 pacientes, de Grau 3 a regressão do tumor (28%). 85 pacientes mostraram regressão do tumor de grau 2 (42%) e 48 pacientes tiveram grau de regressão tumoral 1 (23%). Sem a regressão do tumor foi observada em 3 pacientes (1,5%). No seguimento médio de 223 semanas (95% intervalo de confiança 216,9 para 247,3 semanas) 38 pacientes tiveram recorrência da doença, 32 desenvolveram metástases à distância e 6 recorrências locais. metástases à distância foram detectados nos seguintes órgãos: hepática 15 (HEP), pulmonares 6 (PUL), distante linfonodos não regionais 3 (LYM), pleura 1 (PLE), pele 1 (pele), peritônio 1 (PER), osso 2 (OSS), hepática e pulmonar 2 (HEP e PUL) e outros 1 (OTH). Nestes casos, a recorrência da doença e metástases à distância foram confirmadas por avaliação e exame patológico. Em oito casos foi utilizada a informação clínica (acessado por uma assistente de documentação) para detectar a recorrência da doença.

Para detectar células tumorais metastáticas em linfonodos usamos padrão de coloração HE, bem como Pan-Cytokeratin coloração utilizando um anticorpo monoclonal comercialmente disponível (Dako Inc.) em pelo menos três cortes seriados do nódulo linfático. A mediana de 14 linfonodos regionais por caso foi estudado. A presença de células tumorais positivas pancitoqueratina indicado metástase ganglionar (Fig. 1A).

A. Imuno-histoquímica para pancitoqueratina para detectar micrometástases em linfonodos. B. podoplanina coloração com D2-40 em um dos linfonodos com metástases. O vermelho para marcas de coloração marrom linfa embarcações. coloração C. podoplanina com D2-40 em um linfonodo sem metástase.

Associação de regressão do tumor primário e metástases em linfonodos com os parâmetros clínico e parâmetros prognósticos

Uma correlação significativa foi encontrada entre os tipos de regressão do tumor (Fig. 2) e a sobrevivência livre de progressão quando dicotomizados para regressão do tumor alta e baixa (P = 0,0033 Log-Rank) (Fig. 3A) em Kaplan Meier. A análise multivariada revelou uma diferença estatisticamente significativa quando se compara TRG 1 e TRG 3 (Tabela 2). Tal como em relatórios publicados anteriormente [2], [3], [4], [5], [6], nós também demonstraram que metástase ganglionar é um importante fator prognóstico independente em nossa coorte (p = 0,0017 Log-Rank) ( Fig. 3B).

A. HE manchado adenocarcinoma rectal com o grau de regressão do tumor 1 (40x). B. Ele manchado tecido de cancro rectal com o grau de regressão do tumor 1 (100x) carcinoma C. retal com grau de regressão do tumor 2 (40x) adenocarcinoma D. retal com grau de regressão do tumor 2 (100x). E. grau de regressão do tumor 3 (100x) no câncer de reto com o acúmulo de mucina extracelular. F. A linfa grau de regressão metástase 2 (40x). G. A linfa grau de regressão metástase 3 (40x). H. Regional metástases em linfonodos (400x) na coloração HE standard.

A. O tempo para progressão nas últimas semanas em relação à probabilidade de sobrevivência sem progressão estratificada por uma classificação de regressão do tumor dicotomizada (TRG 0/1/2 = nenhuma regressão ou massa tumoral dominante com fibrose óbvia ou mucina ou fibrótica dominantemente ou alterações mucinoso, com células tumorais ou grupos; TRG 3/4 = muito poucas células tumorais em tecido fibrótico ou mucinoso ou não células tumorais, única fibrótico ou mucinoso massa /regressão total;. acordo com Dworak et al, 1997). B. O tempo para progressão nas últimas semanas em relação à probabilidade de sobrevida livre de progressão estratificada por metástases em linfonodos (ypN0 e YPN +).

Associação de densidade de vasos linfáticos peritumoral e intratumoral com linfonodo metástase, palco UICC e prognósticos parâmetros

em uma próxima etapa, avaliamos a lymphangiogenesis peritumoral e intratumoral (pLVD e ilvD) e sua relação com metástase em nossa coorte. Linfangiogênese foi avaliada utilizando um anticorpo comercialmente disponível que detecta podoplanina (D2-40, Dako) (Fig. 1B e 1C). A coloração é específico para o endotélio linfático e não mancha qualquer vasos sanguíneos com eritrócitos intraluminais detectáveis. pLVD não foi significativamente correlacionada com metástases em linfonodos (p = 0,08 χ

2). Não houve correlação significativa de pLVD e ypUICC palco ou sobrevida livre de doença. Além disso, ilvD não se correlacionou com o prognóstico, linfonodo metástases, ou estágio ypUICC.

Associação de lymphangiogensis intranodal nos gânglios linfáticos regionais com estágio UICC, sobrevida livre de progressão, e tipo de recaída

tabela -1-captionIn paralela, avaliou-se a linfangiogénese intranodal por coloração nódulos linfáticos regionais com mesorreto D2-40 como anteriormente descrito. Um nó de linfa é classificado como positivo para a linfangiogénese intranodal quando, pelo menos, um vaso linfático pode ser detectado no folicular ou /e interfoliculares região de, pelo menos, um nó de linfa mesorreto (designado como NLV +). Em essência, em 102 pacientes todos os linfonodos foram negativos para linfonodo lymphangiogenesis, enquanto que em 43 pacientes em um único linfonodo lymphangiogenesis detectável podia ser visto. Em 58 pacientes mais de um linfonodo regional tem lymphangiogenesis detectável.

Nós encontramos uma correlação estatisticamente significativa entre NLV + (lymphangiogenesis em pelo menos um mesorreto /linfonodo regional) e reincidência do tumor, bem como estágio ypUICC (Tabela 1 ). Kaplan Meier revelou uma correlação significativa de NLV + com o tempo sem progressão sobrevida (p = 0,0071 Logrank) em toda a coorte (Fig. 4A). Além disso, NLV + foi um fator prognóstico independente como estudado pelo modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox com as co-variáveis ​​ypUICC-estágio, idade, sexo, regressão do tumor, densidade de vasos linfáticos intratumoral, densidade de vasos linfáticos peritumoral e linfonodo densidade de vasos linfáticos (Tabela 2 ). Assim, a análise de subgrupos de pacientes nó-negativos apresentaram uma correlação significativa entre NLV + e sobrevida livre de doença (Fig. 4B) usando análise de Kaplan-Meier. Ao comparar a frequência de metástases hepáticas em pacientes com e sem mesorreto lymphangiogenesis intranodal (NLV +), encontramos mais metástases hepáticas em pacientes com lymphangiogenesis nodal (13 metástases hepáticas em pacientes com lymphangiogenesis intranodal versus 2 metástases hepáticas em pacientes sem lymphangiogenesis intranodal). Também foram avaliados o número de vasos linfáticos (densidade de vasos linfáticos, nLVD) detectados nos gânglios linfáticos regionais. Aqui, o número máximo de vasos linfáticos detectados em um linfonodo com lymphangiogenesis correlaciona-se significativamente com o status do nó (ypN0 ou YPN +; p = 0,01 χ

2) (Fig 5B.). Em contraste, não houve correlação entre o número máximo de vasos linfáticos com metástases distantes. Quando dicotomizando de acordo com a mediana da densidade máxima de vasos linfáticos nó de linfa, não foi possível detectar qualquer correlação significativa com o tempo de progressão. Além disso, o número de nódulos linfáticos com linfangiogénese não se correlacionou com a fase ypUICC ou reincidência do tumor no subgrupo de pacientes com NLV +. Em resumo, a presença de vasos linfáticos regionais linfonodo representa um parâmetro de prognóstico independente, enquanto que a densidade de vasos linfáticos nodal, bem como o número de nódulos linfáticos com linfangiogénese nodal detectável pode ser de menor importância para o prognóstico.

“com linfonodo lymphangiogenesis” é definida como pelo menos um linfonodo regional /mesorreto com lymphangiogenesis detectável no folicular ou área interfolicular. A. O tempo de progressão em semanas em relação com a probabilidade de sobrevivência livre de doença estratificada para a presença de linfonodo linfangiogénese em todos os pacientes. B. O tempo para progressão nas últimas semanas em relação à probabilidade de sobrevida livre de doença estratificados quanto à presença de linfonodo lymphangiogenesis em pacientes negativos nó.

A. Os diagramas de caixa comparando o número de vasos linfáticos na região peritumoral com a presença ou ausência de linfonodo metástases. parcelas B. Box comparando o número de navios de linfonodos linfáticos regionais em relação à presença ou ausência de metástase linfonodal em pacientes com vasos linfáticos detectáveis ​​nos gânglios linfáticos regionais.

Associação de metástases linfonodais classificação de regressão e prognóstico

em nossa coorte, não houve correlação estatisticamente significativa entre a classificação de regressão dos linfonodos metástases e recidiva tumoral /sobrevida livre de doença no modelo de Kaplan Meier em todos os pacientes e em análises de subgrupos. Em análises multivariadas nenhuma correlação estatisticamente relevante poderia ser encontrado.

Discussão

Independentemente do tamanho do tumor e extensão da invasão, dos linfonodos regionais metástase (YPN +) é um importante fator prognóstico em pacientes tratados com neoadjuvante radioquimioterapia [2], [3], [4], [5], [6]. Portanto, é importante para elucidar os mecanismos de metástases linfonodais, bem como como metástase linfonodal pode influenciar a sobrevida global dos pacientes. Embora controversos, vasos linfáticos peritumorais são relatados por alguns de desempenhar um papel na promoção da metástase linfonodal no carcinoma colorectal [10], [11], [12], [13] [12], [14], [15]. Usamos D2-40 anticorpo (podoplanina, superfície celular glicoproteína sialiladas) [16], [17] para corar vasos linfáticos em adenocarcinomas primários e linfonodos mesorreto de 203 pacientes com câncer retal. Estes doentes foram tratados com radioquimioterapia pré-operatório seguido por remoção cirúrgica completa do tumor (R0). Nossos resultados indicam nenhuma correlação significativa entre lymphangiogenesis peritumoral e intratumoral e prognóstico do paciente. Curiosamente, observamos linfonodo lymphangiogenesis foi um importante parâmetro prognóstico neste grupo de pacientes. Como relatado anteriormente, os factores de crescimento linfangiogênicas tais como VEGF-C e VEGF-A pode migrar para os nódulos linfáticos regionais a partir de tumores primários e promover a linf [7], [18]. Podemos prever um fenómeno semelhante para o cancro colorectal como o nível de VEGF-C foi mostrado ser elevado no soro do sangue de pacientes com cancro colorrectal [19]. Postula-se que os vasos linfáticos nódulo linfático pode actuar como um nicho metastático para células [7] cancerosas, [8], [20], [21] e facilitar ainda mais a transformação metastático das células tumorais. Isso pode levar a câncer metastático resistente à terapêutica e é, portanto, responsável por mau prognóstico do paciente. Estudos realizados em outros tipos de câncer também indicam um significado prognóstico semelhante de linfonodo lymphangiogenesis. Num modelo de ratinho de melanoma B16 foi demonstrado que linfonodo linfangiogénese é uma resposta rápida ao crescimento do tumor e precede a metástase tumoral [22]. O significado de sentinela linfangiogénese nódulo linfático em disseminação metastática do cancro da mama para os nódulos linfáticos não-sentinela tem sido demonstrado em pacientes humanos. [23]. Resultados semelhantes indicando a importância de linfonodo lymphangiogenesis foram relatados no câncer de pâncreas [8], a cabeça escamosa e pescoço [21], e da doença de Paget extramamária [20].

Multimodal de pré-tratamento de cancro rectal localmente avançado mostrou benefícios terapêuticos aos pacientes [24]. Anteriormente, demonstrou-se que os factores de crescimento, por exemplo, linfangiogênicas O VEGF-C foram regulados positivamente por células tumorais durante o stress e promovida a sua capacidade de tensão-resistência, [25] ,, [26]. Portanto, é possível que o stress durante o tratamento terapêutico de cancro rectal neoadjuvante aumenta o nível de síntese de factores de crescimento linfangiogênicas e aumenta a formação de vasos linfáticos nos nódulos linfáticos regionais. Este eventualmente leva à recorrência de tumores e metástases. Bloqueando o eixo linfática durante a terapia neoadjuvante deve, portanto, melhorar o resultado de modalidades de tratamento atuais para câncer avançado estágio rectal. A associação de lymphangiogenesis de linfonodos e pior prognóstico sugere ainda a detecção de rotina de linfonodo lymphangiogenesis como um parâmetro importante para a previsão de recaída de câncer e como um indicador para um tratamento adjuvante mais agressivo.

Em conclusão, nosso estudo demonstra que a presença de lymphangiogenesis intranodal representa um marcador de prognóstico independente associado com a sobrevivência livre de progressão mais curto em doentes com cancro rectal localmente avançado, que são tratados com radioquimioterapia neoadjuvante. Portanto, as estratégias para detectar linfonodos lymphangiogenesis no contexto clínico pode ajudar a identificar os pacientes que poderiam se beneficiar de opções de tratamento mais agressivas. Além disso, a inclusão de uma abordagem terapêutica para bloquear lymphangiogenesis seria benéfico para pacientes com câncer retal avançado neoadjuvantly tratados.

Materiais e Métodos

Material Paciente

O material usado neste estudo é abrangidas pela aprovação do comitê de ética do Hospital Universitário “Carl Gustav Carus”, TUD-Faculdade de Medicina, para o uso em pesquisa (EK59032007; “Feingewebliche und molekularpathologische Untersuchung em langzeit-archiviertem Gewebsmaterial des Institut fuer Patologia des UNIVERSITAETSKLINIKUM Dresden /Medizinische Fakultaet Carl Gustav Carus, TU Dresden “; Presidente da Comissão: W. Kirch, MD). A decisão do Comité de ética aprovado especificamente a utilização de material de tecido para este estudo minimamente invasiva e retrospectivo que utiliza material de paciente que foi armazenado por mais de três anos. Todos os pacientes consentiram com o uso de material de tecido para a pesquisa (como observado nos arquivos dos pacientes). De acordo com o seu consentimento oral comissão da Ética é suficiente neste caso (este processo de aprovação é aprovado pela comissão da Ética), porque o material usado aqui não está associado com o nome do paciente e está codificada. Duzentos e três pacientes (sexo masculino: n = 152, do sexo feminino: n = 51, idade média = 70 anos) com adenocarcinoma rectal localmente avançado (UICC fase II /III) entre 2001 e 2008 foram incluídos neste estudo (Figura 1). Todos os pacientes foram submetidos a pré-operatório (neoadjuvante) 5-fluorouracil (5-FU) radioquimioterapia base e cirurgia R0 curativa em analogia ao randomizado de fase III alemães Trials câncer retal CAO /ARO /AIO-94 [1]. Os dados para as recaídas da doença (metástases distantes ou recorrências locais), bem como outros dados relevantes foram recuperados do banco de dados do Instituto de Patologia, Hospital Universitário “Carl Gustav Carus”, Faculdade de Medicina da Universidade de Dresden, na Alemanha.

o exame patológico da amostra de cancro após a terapia neoadjuvante

Pelo menos quatro amostras foram colhidas e avaliadas do câncer retal primário. No caso do câncer residual oculto durante o exame macroscópico, a completa área de câncer primeiro foi incorporado e estudado por histologia. No caso da ausência de células cancerosas residuais nas células cancerosas epiteliais vitais coloração HE foram detectadas por coloração com citoqueratina. Este procedimento garante que a terapia de fibrose induzida por tecido, bem como acumulações de mucina extracelulares não foram considerados como tecido de cancro residual e incluido na classificação do grau de regressão do tumor. Mesorreto linfonodos regionais foram dissecados de acordo com o “Union internationale câncer contre” (UICC). No caso do exame de menos do que doze nódulos linfáticos regionais mesorreto perirretais tecido adiposo (mínimo de dez blocos de parafina) foram embebidos e avaliadas para a presença de mais nódulos linfáticos que não eram detectáveis ​​por exame macroscópico. Para detectar as células cancerosas residuais coloração pancitoqueratina foi realizada como descrito.

Tumor e nódulos linfáticos de classificação metástase

regressão tumoral histopatológico (TRG) dentro do tumor primário foi classificada de acordo com o sistema semi-quantitativo estabelecido pela Dworak et ai. [9]: TRG 0 = sem regressão; TRG 1 = massa tumoral dominante com fibrose óbvia ou mucina; TRG 2 = fibrótica dominantemente ou alterações mucinoso, com células tumorais poucos ou grupos; TRG 3 = muito poucas células tumorais em tecido fibrótico ou mucinoso; TRG 4 = ausência de células tumorais, apenas a massa fibrótico ou mucinoso /regressão total [2] (Fig. 2).

Evidência de resposta do tumor a radioquimioterapia pré-operatória dentro dos nódulos linfáticos perirretais foi definido como a presença de fibrose nodal ou piscinas de mucina (com ou sem as células de tumor residuais), como descrito anteriormente [27], [28]. Metástases linfonodais de regressão (LRG) foi avaliada com os mesmos parâmetros como a regressão do tumor primário, considerando cada linfonodo metastático: LRG 0 = sem regressão; LRG 1 = massa tumoral dominante com fibrose óbvia ou mucina; LRG 2 = fibrótica dominantemente ou alterações mucinoso, com células tumorais poucos ou grupos; LRG 3 = muito poucas células tumorais em tecido fibrótico ou mucinoso; LRG 4 = ausência de células tumorais, a massa única fibrótico ou mucinoso /regressão total. nódulos linfáticos não metastáticos foram distinguidos daqueles com regressão metastático total (LRG 4) pela ausência de fibrose ou mucina (fig. 2). Quando diferentes LRGs foram encontrados em um paciente, foi considerado apenas o linfonodo com a pior regressão.

Imunohistoquímica

A imuno-histoquímica foi realizada em 2 pm seções de blocos embebidos em parafina do tumor primário e linfonodos regionais. Desparafinação, de re-hidratação, e recuperação de antigénio foram realizados por cozimento a vapor (98 ° C, 45 minutos) em tampão de Módulo PT (pH 8,0) (Thermo Scientific, Medac, Hamburgo, Alemanha). Os tecidos foram lavados em solução salina tamponada com Tris (TBS) (Thermo Scientific, Medac, Hamburgo, Alemanha) e incubadas com anticorpo monoclonal anti podoplanina humano detectar D2-40-anticorpo (DAKO, Hamburgo, Alemanha, 1:400 diluição) para 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, a actividade de peroxidase endógena foi inibida por incubação das lâminas em 3% H

2O

2 durante 10 minutos. Após lavagem em TBS, Ultravision LP sistema de detecção de grande volume HRP Polymer (Thermo Scientific, Medac, Hamburgo, Alemanha) foi utilizada de acordo com a recomendação do fabricante. Os cortes foram corados com 0,5 mg /ml diaminobenzidina tetrahydrochlorid (DAB) e contra-coradas com hematoxilina. Em todos os experimentos, foram incluídos controles positivos e negativos.

Avaliação da imuno-histoquímica

densidade de vasos linfáticos foi avaliada pelo método de “hot-spot”, como descrito anteriormente, e foi também referida como a Chalkley método de ponto de retícula [29]. Em resumo, todos os slides foram feitos a varredura em baixa ampliação (x40) e foram identificadas as áreas com a maior densidade de D2-40 vasos positivos. Em seguida, o número de vasos positivos D2-40 foi contado nos domínios em cinco campos de alta potência (HPF, x400) por dois patologistas independentes (CJ e MHM) sem o conhecimento dos resultados clinicopatológicas, e o valor médio de contagem de vasos eram calculado. Intratumoral (vasos linfáticos dentro da massa do tumor) e peritumoral (vasos linfáticos fora do tumor, mas a cerca de 2 mm a partir da frente invasão do tumor) DBT foi determinado separadamente. Vasos perto de áreas ulceradas não foram contados. DBT foi avaliada em todos os gânglios linfáticos mesorreto dissecados incluindo metástases, tecido linfóide residual de linfonodos metastáticos (se existente), e todos os nodos linfáticos não-metastáticas. Vasos preexistentes intranodal (sinusite intermediário, bem como marginal) não foram contados. Durante a avaliação concordância entre observadores foi confirmada por meio do coeficiente Kappa de Cohen (κ = 0,8; p 0,001). Em caso de diferenças inter-observador, o caso foi reavaliado pela reavaliação simultânea da amostra.

A análise estatística

Todos os testes são realizados usando SAS JMP versão 9. Associações entre as diferentes variáveis ​​categóricas foram avaliadas usando o χ

2 de teste. As variáveis ​​contínuas foram comparadas usando U-test ou ANOVA de Mann-Whitney. Hora de taxas de progressão foram comparados por meio da análise univariada de Kaplan-Meier, a análise multivariada foi realizada utilizando o modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox com as co-variáveis ​​ypUICC-estágio, idade, sexo, regressão do tumor, intratumoral linfático densidade de vasos, peritumoral linfático densidade de vasos, linfonodo densidade de vasos linfáticos. Os valores de p menor do que 0,05 foram considerados estatisticamente significativa.

Reconhecimentos

Os autores agradecem Marissa J Stanton, University of Nebraska Medical Center, para a revisão crítica do manuscrito.