Sumário
Tip60 (KAT5) é uma acetiltransferase histona (enzima HAT) envolvido em vários processos celulares, incluindo a regulação da transcrição, DNA reparação de danos e sinalização celular. No cancro da próstata, casos agressivas sobre-expressa Tip60 que funciona como um co-activador de receptor de androgénio por acetilação directa de resíduos de lisina dentro do motivo KLKK da região de charneira do receptor. O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar um inibidor acetilase Tip60. rastreio de alto rendimento revelou um isotiazol que inibiu tanto Tip60 ea atividade p300 HAT. Esta substância (inicialmente identificado como 4-metil-5-bromoisotiazol) e outros isotiazoles foram sintetizados e ensaiados contra Tip60. Apesar de uma amostra autêntica de 4-metil-5-bromoisotiazol era inactivo contra Tip60, num disulfane
In vitro
ensaio de HAT, 1,2-bis (isotiazol-5-il) (NU9056) foi identificado como um relativamente potente inibidor (IC
50 2? M). A actividade celular foi confirmada por análise de acetilação de histonas e proteínas não-histonas em um modelo de linha celular de cancro da próstata. NU9056 tratamento inibiu a proliferação celular num painel de linhas celulares de cancro da próstata (50% de inibição de crescimento, 8-27 uM) e induziu apoptose através da activação de caspase 3 e caspase 9 de um modo dependente da concentração e do tempo. Além disso, a diminuição do receptor de androgénio, antigénio específico da próstata, os níveis de p53 e proteína p21 foi demonstrada em resposta ao tratamento com NU9056. Além disso, o pré-tratamento com NU9056 inibida tanto fosforilação ATM e estabilização Tip60 em resposta à radiação ionizante. Com base na actividade de NU9056 e a especificidade do composto em direcção Tip60 em relação a outras enzimas chapéu, estes estudos de biologia química identificaram Tip60 como um alvo terapêutico potencial para o tratamento de cancro da próstata
citação:. Coffey K, Blackburn TJ, Cook S, Golding BT, Griffin RJ, Hardcastle IR, et al. (2012) Caracterização de um Tip60 inibidor específico, NU9056, no câncer de próstata. PLoS ONE 7 (10): e45539. doi: 10.1371 /journal.pone.0045539
editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria
Recebido: 18 Abril de 2012; Aceito: 21 de agosto de 2012; Publicação: 08 de outubro de 2012
Direitos de autor: © Coffey et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O financiamento foi fornecida pelo Cancer Research UK (CRUK) (C240 /A7409; C29821 /A10348) (www.cancerresearchuk.org) e do Conselho de Investigação médica (MRC) PROMPT (G0100100 /64424) (www.mrc.ac.uk). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. KH foi contratado pela OSI Pharmaceuticals, Inc. compostos discutido neste artigo não são patenteados , no desenvolvimento ou sendo comercializados por esta empresa. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
acetilação de histonas e desacetilação são eventos-chave na regulação da estrutura da cromatina. histona acetiltransferase (chapéus) catalisam a adição de grupos acetilo do terminal ε-amino de resíduos de lisina dentro de histonas. Acetilação resulta em uma estrutura da cromatina aberta removendo cargas positivas de histonas, induzindo, assim, mudanças de conformação de proteínas, o que permite maquinaria transcricional para acessar o DNA e promover a atividade transcricional. histona desacetilases (HDAC) se opõem a este processo, promovendo uma estrutura da cromatina fechado, que é transcricionalmente reprimida. Além disso, marcas de acetilação das histonas pode funcionar como locais de ancoragem para outras proteínas de interpretar o “código de histonas ‘; Por exemplo, o motivo tripartido contendo 24 (TRIM24) foi recentemente descrita como uma proteína “leitor”, que reconhece tanto histona H3 não modificado na lisina 4 e histona H3 acetilada na lisina 23 sobre a mesma cauda de histona resultando num aumento da expressão do gene [1] . Além disso, as proteínas não-histonas, tais como p53 [2], [3], a ataxia telangiectasia mutada (ATM) [4] e o receptor de androgénio (AR) [5], [6] também pode ser acetilado resultando em actividade de proteína alterada. Assim, a acetilação de proteínas e desacetilação pode ter efeitos significativos sobre a função das células, e para as células para manter o crescimento normal e diferenciação, é importante que estas duas funções manter o equilíbrio. Em apoio a este conceito, os inibidores de HDAC foram encontrados para ter amplos efeitos celulares e actividade clínica em leucemia [7], [8], com Vorinostat (SAHA) ser aprovado para uso clínico desta doença. Modulação da acetilação das histonas claramente tem potencial terapêutico.
Tip60, recentemente renomeado KAT5, é um membro da família MYST de enzimas HAT identificado pela primeira vez em 1996 [9]. Desde então muitas funções celulares foram encontrados para utilizar esta proteína. Perda de Tip60 resulta em reparo de DNA danificado, como este chapéu é activado em resposta à radiação ionizante (IR), causando acetilação das histonas e ativação de p53 e ATM [4]. A inibição da Tip60 deve, por conseguinte, sensibilizar células a agentes que danificam o ADN utilizados como terapêuticos para o cancro. Tip60 também funciona na via de NF-kB, através de interacções com células B-CLL /linfoma 3 (BCL-3) [10] e a sinalização dependente de cAMP [11]. Além disso, Tip60 pode funcionar como um co-activador para um número de receptores de hormonas esteróides, incluindo a AR, a qual está envolvida no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata (CaP). Estudos têm demonstrado que a AR pode ser acetilada por uma série de enzimas chapéu, incluindo p300, p300 /factor de PLQ-associado (PCAF) e Tip60, para aumentar a sua actividade de transcrição [6], [12]. AR acetilação é pensado para regular o recrutamento de co-activadores para a maquinaria de transcrição de genes que respondem a androgénios [13]. Além disso, Tip60 é funcionalmente-regulada em amostras de CaP clínicos e de expressão se correlaciona com a progressão da doença [14]. Em contraste, um relatório sugeriu que Tip60 é necessária para expressar a metástase tumoral KAI1 supressor em linhas celulares de CaP, sugerindo que Tip60 é um supressor de tumores [15]. Da mesma forma, um estudo knockout gene Tip60 proposta Tip60 como um supressor de tumor haplo-insuficiente nas fases pré e early-tumorais de linfoma, peito e cabeça e pescoço cancros [16]. No entanto, estudos sobre espécimes de próstata clínicos contradizem esta sugestão e apoiar Tip60 como um oncogene em Cap [13], [17]. Assim, tendo como alvo a atividade acetilase de Tip60 poderia ser uma estratégia terapêutica útil no PAC.
Um pequeno número de inibidores HAT foram relatados. Acoplamento de um péptido de histona H3 para CoA para formar um inibidor da actividade bisubstrate chapéu foi descrito; No entanto, o composto tem a permeabilidade da membrana celular pobre [18]. Os produtos naturais de ácido anacárdico e garcinol são inibidores chapéu que sejam celular permeável; eles sensibilizar células para IR, o que pode ser útil como uma terapia de combinação para o tratamento do cancro. Outros inibidores da função CHAPÉU incluem butirolactonas ct-metileno [19], acetonas benzilideno [20] e malonatos alquilideno [21]. Mais recentemente, isotiazolonas, que se ligam covalentemente ao chapéu local activo de tiol, têm sido descritos como um ponto de partida eficaz para abordagens baseadas em modelação molecular para a geração de inibidores mais potentes e específicos [22] – [24]. No estudo actual, empregue uma abordagem de rastreio de alto rendimento para identificar inibidores selectivos da Tip60. Com base na molécula de chumbo, estruturalmente compostos relacionados foram gerados e testados para a inibição HAT e especificidade Tip60 a fim de identificar uma ferramenta molecular para estudos em modelos de linhas celulares de CaP.
Resultados
High Throughput tela (HTS) e Hit Validação
uma campanha de rastreio de alto rendimento para os inibidores Tip60 foi realizado em OSI Pharmaceuticals Ltd. ensaios baseados na tela do ALPHA ™ e formatos DELFIA ™ foram desenvolvidas e utilizadas para rastrear um conjunto composto estruturalmente diversa (~80,000 membros). Um número de acertos foram identificados a partir da tela principal ALPHA ™. No entanto, a maioria destes não mostrou actividade significativa no ecrã secundário. Um único composto oxa-10 (inicialmente identificado como 4-metil-5-bromoisotiazol, 1), foi identificado como uma batida em ambas as telas e a actividade foi repetido com material readquirida. Readquiridas oxa-10 mostraram actividade contra Tip60 (IC
50 1,1 uM – A Figura 1) e P300 (IC
50 2,7 mM) (Tabela 1), mas não outros histona acetiltransferase, v.g. PCAF e GCN5 (IC
50 100? M). A análise por LC-MS da amostra readquiridas de oxa-10 indicou a presença de ~ 80% de 4-metil-5-bromoisotiazol 1, mas mostrou que continha ~ 20% de uma impureza desconhecida. A fim de validar um como o inibidor activo de Tip60 em oxa-10, a síntese de 1 foi realizado, juntamente com os análogos, a fim de desenvolver as relações estrutura-actividade. Detalhes da síntese química (Figura 2) pode ser encontrada em informações suplementares.
Para avaliar a atividade contra Tip60 HAT,
in vitro
ensaios Hat usando
3H acetil-CoA foram realizadas histonas utilizando como substratos. Os ensaios foram realizados em quadruplicado e repetido duas vezes. Para os compostos que produzem 50% de inibição a 100 ^ M, IC
50 valores foram calculados. Individuais
50 valores IC são apresentados. Para outros compostos a inibição% a 100? M é apresentado.
Especificidade do NU9056 para Tip60 acetiltransferase
NU9056 (7), bem como os compostos 5 e 6, foram testados para
in vitro
actividade contra um painel de enzimas de HAT recombinantes, incluindo p300, PCAF e GCN5, para determinar se apresentam maior especificidade para Tip60 do que o composto 1. ICR CCT129182, o que tem sido demonstrado que têm actividade inibidora contra a P300 e PCAF, também foi testado [24]. Uma série de compostos foi encontrado para inibir a actividade de Tip60 em baixas concentrações micromolares (Figura 1; Figura Suplementar S1). No entanto, a especificidade em relação Tip60 sobre outras enzimas HAT testadas verificou-se ser maior com o composto 7 (NU9056) como mostrado na Tabela 1 (16.5-, e 29- 50 vezes para selectividade para Tip60 sobre PCAF, p300 e GCN5, respectivamente ).
NU9056 Inibe a acetilação de proteínas em linhas celulares de cancro da próstata
Tip60 acetila proteínas histonas, especificamente histonas H4 e H2A, num contexto nucleosomal [25]. Além disso,
In vitro
estudos demonstraram que Tip60 pode também núcleo acetilam histonas H2A (Lys 5), H3 (Lys 14) e H4 (5 Lys, Lys 8, 12 Lys e Lys 16) [26], [27]. Para testar se NU9056 poderia inibir a acetilação de proteínas endógenas alvo de Tip60, as células LNCaP foram utilizadas como estes são um modelo representativo de androgénio CaP dependentes. O estado de acetilação de histona H4 em lisina 8 (H4K8) e 16 (H4K16) e histona H3 na lisina 14 (H3K14) foi investigada nestas células por Western blotting. Além disso, o nível de Tip60 foi avaliado após tratamento com o composto NU9056 e controlo, 1,2-bis (4-piridil) etano (Figura 3A), demonstrando que os níveis Tip60 próprios não são afectados. À medida que os níveis basais de histonas acetiladas estas marcas são bastante baixos, o inibidor de HDAC tricostatina A (TSA) foi introduzida para remover a influência da actividade de HDAC em acetilação no ensaio celular. Na presença de TSA por si só, acetilação foi aumentada em H4K8, H4K16 e H3K14 (Figura 3B), consistente com relatos anteriores [28] – [30]. O aumento das concentrações de NU9056 resultou na diminuição dos níveis de histona acetilada H4K16, H3K14 e H4K8, alvos para a acetilação Tip60-mediada (Figura 3C). Além disso, o composto de controlo, 1,2-bis (4-piridil) etano, não afecta qualquer uma das modificações de histonas estudados
Parte 1 -. Síntese dos compostos 4-7. Parte 2 – Síntese de Compostos 1 e 11.
células LNCaP foram tratadas com concentrações crescentes de NU9056 ou o composto de controlo, 1,2-bis (4-piridil) -etano durante 24 horas. (A) Níveis de Tip60 foram avaliadas por transferência de Western. (B) As células LNCaP foram tratados com TSA 2 uM durante 6 horas e os níveis de histona H4 acetilada-lisina 16, histona H4 acetilada-lisina 8 e histona H3 acetilada lisina 14 foram avaliadas por transferência de Western. As células LNCaP foram tratadas com concentrações crescentes de NU9056 ou o composto de controlo, durante 2 horas, em seguida, tratados com o inibidor de HDAC de TSA (2 pM) durante mais 4 horas. (C) Níveis de histona H4 acetilada-lisina 16, histona H4 acetilada-lisina 8 e histona H3 acetilada lisina 14 foram avaliadas por transferência de Western. (D) As células LNCaP foram tratadas com 24? M NU9056 ao longo de 4 dias e os níveis de tubulina acetilados foram avaliadas por transferência de Western. células LNCaP (e) foram tratadas com concentrações crescentes de NU9056 ou o composto de controlo, durante 2 horas, em seguida, tratados com o inibidor de HDAC de TSA (2 pM) durante mais 4 horas. Níveis de tubulina acetilados foram avaliadas por transferência de Western. Alfa-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. blots representativos são mostrados para as experiências em duplicado.
Para definir ainda mais a actividade inibidora de HAT NU9056, acetilação da proteína não-histonas α-tubulina foi também investigada. Quando as células LNCaP foram incubadas com NU9056 (24 uM) durante 24 horas observou-se uma diminuição da tubulina acetilada. No entanto, 72 horas por acetilação tinha voltado aos níveis basais (Figura 3D). Para confirmar que este efeito era devido à NU9056, tubulina acetilada foi monitorizada, mas nenhuma alteração nos níveis foi observada dentro de 6 horas ao contrário de alterações de modificações de histonas (Figura 3E). Densitometria para todas as transferências de Western é mostrado na Figura Suplementar S2.
NU9056 Inibe o Crescimento celular
Observamos que knockdown de Tip60 em células LNCaP resultou numa inibição da proliferação de células em cerca de 33% (p -valor = 0,0019) (Figura 4A). knockdown eficiente de ARNm Tip60 nestas células foi confirmada por PCR em tempo real (Figura 4B, 70% knockdown; valor-p = 0,0313) e Western blot (Figura 4C). Se uma acção NU9056 foi mediada através de inibição da actividade enzimática Tip60, seria de esperar que a inibição da proliferação de células por NU9056. De facto, a proliferação foi encontrado para ser reduzida na presença de NU9056 em todas as linhas de células de teste da tampa, conforme medido por ensaio de sulfo-rodamina B (SRB) (Tabela 2, Figura Suplementar S3, S4). Curiosamente células LNCaP, que são responsivos androgénio e expressam um AR mutante mas funcional, assim como p53 do tipo selvagem, e a metástase derivada células PC3 óssea, o que não expressam um AR funcional e são p53 nulo, exibida GI semelhante
50 concentrações (24 ± 2 uM e 27 uM ± 2 para células de LNCaP e PC3, respectivamente). No entanto, as células LNCaP-AI, uma sub-linha de células LNCaP mantida em série em meio destituído de esteróides, que ainda expressam uma AR funcional e são um modelo de tampa de segurança terapia pós andrógeno ablação de castração, tem um IG mais baixo
50 ( 24 uM ± 2 e 16 ± 1 uM para LNCaP e LNCaP-AI, respectivamente). Outros modelos de linhas celulares de independência de androgénio, v.g. LNCaP-CdxR, que é mantido em série na presença de bicalutamida e CWR22rv1, mostram significativamente maior sensibilidade para NU9056 do que a linha celular LNCaP parentais (GI
50 valores de 12 uM ± 2,5 e 7,5 uM ± 0,2 (p 0,05 e p 0,0005, respectivamente)). Tip60 níveis foram medidos por transferência Western nestas linhas celulares (Figura 4D) para revelar que a linha celular mais sensível, CWR22rv1, realmente expressa a mais Tip60.
(A) Para confirmar que a inibição de Tip60 pode reduzir a celular 2,5 nM de proliferação de siRNA especificamente dirigida contra Tip60 em células LNCaP ou foi utilizado um controlo não-silenciamento. A proliferação foi determinada por ensaios de proliferação em três tempos de duplicação de controlo depois de siRNA transfecção em meio de crescimento normal de sulforrodamina B (SRB). Para confirmar Tip60 knockdown, o ARN foi recolhido às 96 horas a partir de uma experiência paralela e avaliados quanto à expressão utilizando Tip60 (B) PCR em tempo real e (C) Western blotting. níveis (D) Tip60 em linhas celulares de cancro da próstata foram avaliadas por transferência de Western. sobrevivência de células de cancro da próstata (E) foi avaliada por tratamento das células LNCaP com 24 NU9056 uM durante 24 horas, depois do plaqueamento a densidades celulares variando (3 × 10
3, 1,6 × 10
4 e 3 × 10
4 ) e permitindo que as colónias se formar mais de 2 semanas. As colónias foram então fixadas com fixador de Carnoy e coradas com violeta de cristal. As colónias foram então contadas e a eficiência de formação de colónias calculada. A média de 3 experiências ± desvio padrão é mostrado em gráficos de barras. * Valor de p . 0,05
Para testar se NU9056 pode reduzir a sobrevivência das células PAC, formando colónia capacidade foi avaliada após exposição de células LNCaP a 24 mM (GI
50) NU9056 durante 24 horas. capacidade de formação de colónia foi reduzido após a exposição NU9056, que foi estatisticamente significativa (p 0,05). (Figura 4E)
NU9056 Tratamento causa apoptose via Caspase Activation
Os efeitos da NU9056 na fase do ciclo celular distribuição e indução da apoptose, também foram testadas em células LNCaP. Para avaliar os efeitos apoptóticos, foi utilizada a análise FACS para caspase ativada 3 e caspase ativada 9. NU9056 resultou em tanto de caspase 3 e caspase 9 activação num tempo e modo dependente da concentração (Figura 5A, Figuras complementares S5 e S6). Os níveis de apoptose, também foram comparados com outros inibidores HAT demonstrando que NU9056, com a sua maior especificidade para Tip60, podem induzir apoptose em níveis semelhantes aos inibidores mais promíscuos (Recurso Figura S7). Análise da população sub-G1 em células LNCaP (Figura 5B) confirmou a indução de apoptose de uma maneira tempo e dependente da concentração para NU9056. No entanto, sob nenhuma condição de exposição ao NU9056 fizemos observar qualquer G1 ou G2M paragem do ciclo celular em células LNCaP; única acumulação na fase sub-G1 foi observado (Figura 5C, D). Para determinar se resistente à castração linhas de células são mais sensíveis à NU9056 como sugerido por GI
50 determinação de uma comparação de células LNCaP com células LNCaP-CdxR LNCaP-AI e após o tratamento com NU9056 durante 24 horas, foi levada a cabo. Com efeito, as células LNCaP-AI e LNCaP-CdxR parecem ser mais sensíveis à NU9056 do que as células LNCaP como mostrado por uma população maior de ser na fase sub-G1 do ciclo celular (Figura 5E). Ao utilizar o LNCaP GI
75 de dose (36 uM) um aumento significativo da Sub-G1 foi visto em células LNCaP-AI (p = 0,036) em comparação com células LNCaP. Tendências semelhantes foram observados para LNCaP-CdxR embora este não foi estatisticamente significativa (p = 0,1679).
células LNCaP (A) foram semeados em placas de 6 poços por 24 horas, em seguida, doses crescentes de NU9056 foram aplicados ( i) 24 horas, (ii) 96 horas ou (iii) IG
25 (17? M) ou (IV) IG
50 (24 uM) foi aplicada ao longo de 4 dias. Todas as células foram recolhidas e fixadas com Cytofix /Cytoperm (BD), em seguida, caspase 3 e caspase 9 kits de ensaio (BD) foram utilizados para avaliar a sua actividade por citometria de fluxo. A fluorescência foi detectada no canal FL-1 do FACSCAN. (B) Análise da população SubG1 foi realizada nestas mesmas células utilizando iodeto de propídio para corar o ADN celular. As células LNCaP foram semeadas em placas de 6 cavidades, durante 24 horas, em seguida, foi aplicado para NU9056 (C) 1 ou (D) 4 dias. (E) LNCaP, LNCaP-AI e as células LNCaP foram semeadas-CdxR-se para placas de 6 cavidades e NU9056 foi aplicada durante 24 horas. Análise de SubG1 foi realizada como descrito acima. Todas as células foram recolhidas e fixadas com Cytofix /Cytoperm (BD), em seguida, análise do ciclo celular foi realizada utilizando iodeto de propídio para corar o ADN celular. Todos os dados foram analisados utilizando FACS WinMDI. Todas as experiências foram realizadas 3 vezes e a média ± erro padrão é mostrado. * Valor de p 0,05; ** Valor de p 0,005; *** Valor p . 0.001
NU9056 tratamento reduz PSA expressão em células LNCaP
Tip60 foi reportado como um co-ativador AR [31], que desempenha um papel no desenvolvimento do PAC. Para confirmar o papel da expressão Tip60 em PSA, siARN foi usada para knockdown Tip60 níveis em células LNCaP e os níveis de ARNm de PSA monitorados em resposta à estimulação de androgénio (di-hidrotestosterona (DHT)). Na presença de um não-silenciamento siARN PSA foi induzida por aproximadamente 10 vezes na resposta a DHT (Figura 6A). No entanto, após o knockdown de Tip60 (Figura 6B) apenas um aumento de 2,5 vezes foi observado (Figura 6A). Para investigar os efeitos sobre a função de NU9056 AR, as células LNCaP foram tratadas com 24? M NU9056 ao longo de um período de 48 horas, após o que os níveis de proteína AR e PSA foram avaliadas por transferência de Western. Além disso, investigou-se os níveis de p53 e p21 seu gene alvo, como p53 é também um alvo para Tip60. Nós descobrimos que os níveis de ambos RA e p53 foram reduzidos após 24 horas por 2- e 3-vezes, respectivamente, e que os produtos dos genes alvo, p21 e PSA, foram igualmente reduzidas em 3 e 2 vezes, respectivamente (Figura 6C, D). Este resultado sugere que, de facto Tip60 está envolvida na sinalização de AR e p53 nesta linha de células e que NU9056 pode, por modulação da actividade acetilação Tip60 afectam estas importantes alvos a jusante.
Para confirmar os efeitos da Tip60 sobre a actividade do receptor de androgénio usamos 2,5 nM siRNA dirigida especificamente contra Tip60 em células LNCaP, ou não silenciar controle. Knockdown foi alcançada após 48 horas em meio empobrecido esteróide, após o que 10 nM de DHT foi aplicado para induzir a actividade do receptor de androgénio e a expressão do PSA. O ARN foi recolhido após 24 horas de estimulação DHT, transcrição e PCR em tempo real realizado reversa. A expressão de (A) e PSA (B) Tip60 foi normalizada em relação ao HPRT1 expressão. (C) As células LNCaP foram tratadas com 24? M NU9056 mais de 48 horas e amostras de proteína foram recolhidas em tampão de amostra de SDS. A análise de proteínas foi realizada por SDS-PAGE e Western blotting para p53, p21, AR, PSA e alfa tubulina. (D) A densitometria foi executada em transferências de Western. Todas as experiências foram realizadas duas vezes e a média ± desvio padrão é mostrado.
NU9056 inibe a resposta de danos de ADN em células de cancro da próstata
Tip60 é conhecida por desempenhar um papel de danos no DNA resposta [25]. Após a exposição a IR Tip60 é activada, o que resulta na acetilação de histonas e proteínas de activação de ATM e de p53 [4]. Para testar se NU9056 poderia inibir a resposta a danos no ADN através da inibição da actividade acetilase Tip60, a activação de ATM foi avaliada por transferência de Western em resposta aos IR após pré-tratamento com NU9056. Em resposta aos IR, Patm níveis foram aumentados dramaticamente dentro de 10 minutos. Ao longo do tempo os níveis Patm caiu gradualmente. No entanto, na presença de NU9056 esta diminuição foi muito mais rápida (Figura 7A). Além disso, em resposta a níveis de proteína IR Tip60 foram estabilizados resultando na acumulação. As células que foram pré-tratados com NU9056 não demonstraram acumulação Tip60 (Figura 7B), o que pode explicar a maior volume de níveis Patm.
Para demonstrar a inibição da actividade por Tip60 NU9056, os níveis de Patm, Tip60 e γH2AX foram investigados em resposta a RI na presença e na ausência de fármaco. As células LNCaP foram tratados com 24 ^ M ou veículo de controlo NU9056 durante 1 hora antes de 0,5 Gy IR. Os lisados de proteína foram recolhidas em vários pontos de tempo pós-IR e analisados por transferência de Western para (A) e os níveis de Patm (B) Tip60. (C) 293T, (D) LNCaP e (e) células LNCaP-CdxR foram pré-tratados com NU9056 (24 uM) ou controlo de veículo, durante 1 hora antes de 2 Gy IR. As células foram fixadas e coradas para γH2AX focos ao longo do tempo e focos determinado por imunofluorescência para células 293T e a citometria de fluxo para LNCaP e LNCaP-CdxR. As experiências foram repetidas 3 vezes com imagens representativas mostradas e quantificados dados mostrados como células médios% corados para γH2AX ± desvio padrão.
Tip60 acetilase actividade é necessária para facilitar a ubiquitina-ligase ubiquitinação mediada por UBC13 e destruição subsequente de γH2AX [32]. Por conseguinte, a inibição da actividade acetilase Tip60 irá impedir a regulação negativa do sinal γH2AX. Para testar isto, células 293T foram tratados com NU9056 (24 uM) ou controlo de veículo, durante 1 hora antes de IV (2 Gy) exposição. As células foram então fixadas e γH2AX focos visualizados por imunofluorescência. Comparado com o controle do veículo, formação γH2AX foi ainda claramente enriquecido até 24 horas após a estimulação IR (Figura 7C), sugerindo que a reparação do dano ao DNA é prejudicada. Isto também é visto em células LNCaP e LNCaP-CdxR que foram avaliadas por citometria de fluxo para γH2AX. Em células LNCaP, o número de focos foi significativamente mais elevada após 24 horas de recuperação, na presença de inibidor (p = 0,0277) (Figura 7D) enquanto em células LNCaP-CdxR uma diferença significativa é observada após quatro horas de recuperação (p = 0,0324) ( A Figura 7E). Um aumento na γH2AX também é visto em 24 horas de recuperação, mas não foi considerado estatisticamente significativo.
Discussão
acetilação de proteínas, como um mecanismo regulador, está provando ser importante em muitos caminhos celulares , e não apenas a transcrição de genes através de modificação das histonas. Ambos os conjuntos de enzimas responsáveis pela regulação de acetilação, chapéus e HDACs, são de-regulada em estados de doença. Por conseguinte, ambos os tipos de segmentação enzimas com inibidores de moléculas pequenas como uma estratégia terapêutica é válido. Inibidores contra HDACs foram encontrados para ser bem sucedido em ensaios clínicos; no entanto, os inibidores HAT estão em um estágio inicial de desenvolvimento. Recentemente, tem havido alguns inibidores HAT putativos descritos, embora nenhum parece capaz de distinguir de forma significativa entre os diferentes membros da família chapéu e nenhum foi desenvolvido especificamente contra Tip60, uma enzima HAT que parece desempenhar um papel específico no desenvolvimento PAC e progressão. Para fazer face a este ponto, identificamos um inibidor da HAT, utilizando HTS e síntese de compostos alvo, que inibe Tip60 sobre outras enzimas HAT.
O requisito para validar totalmente HTS bate através resynthesis é amplamente aceito como material em colecções de compostos comerciais pode incluir impurezas não identificadas, ou podem degradar durante a armazenagem, tipicamente na forma de soluções de DMSO congelados, dando falsos positivos. Neste caso, uma síntese literatura para 1 não estava disponível, e um percurso tinha de ser desenvolvido. O primeiro esquema tentada (Parte 1) não deu os compostos-alvo, 1, ou seu análogo desmetil; No entanto, foram preparados os análogos dissulfureto isocianato e 4-7. O Composto 1 foi preparado com êxito por meio de uma rota alternativa (parte 2).
A actividade biológica observada para os dissulfuretos 5 e 7 (NU9056), levou-nos a investigar a actividade dos outros dissulfuretos aromáticos e heteroaromáticos simples. Curiosamente, estes compostos são desprovidos de actividade inibidora Tip60, indicando que a inibição Tip60 não é somente devido à presença do grupo dissulfureto. De modo semelhante, o análogo de bromotiofeno isotiazole 1 era inactivo.
isotiazolonas têm sido previamente relatado para atingir a actividade de muitas enzimas acetilase HAT incluindo p300 e PCAF [24]. No entanto, não foi descrito um inibidor específico para Tip60. Há muitos benefícios a serem obtidos, visando desta proteína devido aos diversos processos celulares em que Tip60 está implicada. Por exemplo, não só faz isso a função da proteína para aumentar a actividade transcricional do AR e p53, mas ele também pode desempenhar um papel na reparação do ADN, onde ele pode acetilar proteínas histona para marcar locais de danos no ADN e activar a ATM [25].
neste relatório, nós preparamos um composto de isotiazolona, NU9056 (7) que tem como alvo a atividade HAT Tip60 resultando seletivamente em acetilação reduzido de proteínas histonas
in vitro
. Tip60 foi encontrado para ser expressas de forma aberrante em um certo número de cancros, incluindo cancros da próstata e da pele. Especificamente, Tip60 pode acetilam a AR, um fator de transcrição chave no PAC, para promover a atividade transcricional aumentou AR [6] e expressão Tip60 também foi mostrado para correlacionar com a progressão da doença [14]. Assim, tendo como alvo a atividade acetilase desta proteína poderia ser benéfico para pacientes que sofrem com fecho resistente à castração que já não responde à terapia de privação de andrógeno. Por conseguinte, para testar a capacidade de NU9056 para inibir a actividade HAT em células que foram utilizados modelos de linhas celulares PAC. Nestas linhas de células que demonstraram o efeito inibidor do NU9056 contra a actividade de Tip60 HAT. Por outro lado, a acetilação de proteínas não-histona tais como a tubulina foi encontrado para ser reduzida nestas linhas celulares em resposta a NU9056. Interessantemente, os níveis de AR e p53 diminuiu ligeiramente após o tratamento NU9056 em células LNCaP de suporte a relatos anteriores que acetilação aumenta a estabilidade destas proteínas [33], [34]. Devido à importância de AR e p53 e a sua presença em células LNCaP, isto pode explicar por que tanto a apoptose é aumentada e a proliferação é reduzida em resposta ao NU9056 de um modo dependente da concentração e do tempo. No entanto, existem diferenças na sensibilidade entre as diferentes linhas de células PAC, que não podem ser explicados apenas por estatuto AR ou p53. Esta última observação sugere que a actividade de AR Tip60 direcção e p53 não é um factor que contribui para a resposta celular ao fármaco. No entanto, em resposta ao DNA IR prejudicial, que activa a actividade da acetilase Tip60, descobrimos que NU9056 inibe o desenvolvimento do sinal Patm e impede a estabilização da própria Tip60, potencialmente através da inibição da auto-acetilação. Além disso, NU9056 prejudica a sobrevivência da célula em resposta à RI e dificulta a remoção da marca γH2AX potencialmente impedir a reparação do ADN.
Curiosamente, os modelos de linhas de células de resistência de castração parecem ser mais sensíveis à NU9056. níveis e estabilidade do Tip60 aumentou em células andrógeno-insensitive, devido ao crescimento crônica em condições de andrógeno ablação, tem sido relatado em outros modelos similares de linhas celulares [35], xenotransplantes CaP humanos e das amostras de biópsia de pacientes resistentes castração [14]. É possível que células de androgénios são mais insensíveis dependente dos níveis de Tip60 para o seu crescimento, em comparação com os seus homólogos que respondem a androgénios, resultando em uma maior sensibilidade para NU9056. Na verdade, os estudos iniciais mostram que os níveis de proteína Tip60 variam entre as linhas de células testadas, com as mais NU9056 linhas celulares sensíveis, CWR22rv1 e LNCaP-CdxR demonstrando os mais altos níveis de Tip60. As diferenças na actividade enzimática de Tip60 entre as linhas celulares podem também ser importantes. Esta hipótese deve ser totalmente testada em estudos futuros em um número de linhas de células e
in vivo
sistemas modelo para determinar conclusivamente o mecanismo de sensibilidade. Quanto à possibilidade NU9056 é geralmente tóxicos para as células; acreditamos que isso é improvável em sua maior parte. Em primeiro lugar, não houve alteração na coloração γH2AX NU9056 quando foi aplicada às células, sugerindo ausência de indução de dano do ADN. Em segundo lugar os efeitos diferenciais foram vistos, dependendo da linha de células sugerindo geralmente toxicidade não foi a causa dos efeitos celulares prejudiciais.