Sumário

Como o cancro da próstata progride para a doença resistente à castração, há um aumento na actividade de transdução de sinal. A maioria dos tumores da próstata resistente à castração continuar a expressar o receptor de androgénio (AR), bem como genes responsivos aos andrógenos, apesar da ausência quase total de andrógeno em circulação nesses pacientes. A AR é regulada não só pelo seu cognato hormona esteróide, mas também através de interacções com uma constelação de moléculas co-reguladoras e de sinalização. Assim, a actividade de sinalização elevada que ocorre durante a progressão para a resistência à castração pode afectar o crescimento de células de cancro da próstata, quer através da AR ou independente do AR. A fim de identificar as vias de sinalização que regulam o crescimento de células de cancro da próstata, que um painel blindado de segmentação shRNAs 673 quinases humanos contra células de cancro da próstata LNCaP crescidas na presença e na ausência de hormona. A tela identificados vários clones shRNA contra alvos de genes conhecidos e novos que regulam o crescimento de células de câncer de próstata. Com base na magnitude do efeito sobre o crescimento, foram selecionados seis quinases para um estudo mais aprofundado: MAP3K11, DGKD, Ick, CIT, GALK2 e PSKH1. Knockdown destas cinases diminuiu o crescimento das células em ambas as células de cancro da próstata dependentes de androgénio e resistente à castração. No entanto, estas quinases tiveram efeitos diferentes sobre a actividade de transcrição basal ou induzida por androgénio de genes alvo AR. MAP3K11 knockdown mais consistentemente alterada a transcrição de genes alvo de AR, sugerindo que MAP3K11 afectado o seu efeito inibidor do crescimento através da modulação da transcrição programa AR. Consistente com MAP3K11 agir sobre o AR, knockdown de MAP3K11 inibida AR Ser 650 fosforilação, apoiando ainda mais o estresse regulação quinase de AR fosforilação. Este estudo demonstra a aplicabilidade do shRNA baseada lentiviral para a realização de telas fenotípicas e identifica MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2 e PSKH1 como reguladores de crescimento de células de câncer de próstata. A avaliação completa destes alvos quinase irá pavimentar o caminho para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes para o câncer de próstata resistente à castração

Citation:. Whitworth H, Bhadel S, Ivey M, Conaway M, Spencer A, Hernan R, et ai. (2012) Identificação de quinases regulação do crescimento celular do cancro da próstata Usando uma tela de RNAi fenotípica. PLoS ONE 7 (6): e38950. doi: 10.1371 /journal.pone.0038950

editor: Jindan Yu, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 11 Janeiro, 2012; Aceito: 15 de maio de 2012; Publicado: 27 Junho 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Whitworth et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde Grant R01 CA124706 a DG eo Paul Mellon Cancer Institute Urológica da Universidade de Virginia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: Andrea Spencer, Ronald Hernan, e Heather Holemon estavam empregados na Sigma-Aldrich Biotecnologia durante a tela de RNAi. Sigma-Aldrich vende a biblioteca de missão que foi utilizada neste estudo. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O receptor de andrógeno (AR) é um regulador crítico da progressão do câncer de próstata e é cada vez mais evidente que a AR é regulada não só pelo seu cognato hormona esteróide, mas também através de interacções com uma constelação de moléculas co-reguladoras e de sinalização [1] – [3]. Para pacientes que se apresentam com cancro da próstata disseminada, o tumor é tipicamente dependente do androgénio para o crescimento e, por conseguinte, inicialmente sensíveis às cirúrgica e /ou depleção farmacológica de androgénios circulantes [4]. No entanto, o sucesso terapêutico é temporário. O câncer quase invariavelmente é recorrente e progride para uma doença metastática e letal. A extensa conversa cruzamento entre as vias de sinalização, tais como andrógenos e peptídeos vias de sinalização, múltiplas mutações genéticas, e a plasticidade genética do câncer, todos contribuem para a resistência inerente e adquirida à ablação do andrógeno [5].

Estudos anteriores demonstraram que as vias de transdução de sinal de factor de crescimento de polipéptido pode estimular a activação de AR, sugerindo que o aumento do factor de crescimento e expressão do receptor pode ser causal na progressão do cancro da próstata a resistência castração. estimulação do factor de crescimento tem sido relatado para processar promotores AR-responsivo com hipersensibilidade à androgénio [6] – [14], e forçado através de expressão de HER2 /neu em células de cancro da próstata dependentes de androgénio tem sido mostrado para conduzir o crescimento resistente à castração [15] , [16]. Além disso, a inibição da EGFR sinalização /HER2 pode inibir o crescimento de células de câncer de próstata

in vitro

e

in vivo

[17], [18], bem como a atividade transcricional AR, a estabilidade da proteína, DNA vinculativo e Ser 81 fosforilação [19]. A capacidade de cascatas de sinalização de influenciar a função de AR pode desempenhar um papel significativo no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata, onde o aumento da actividade de transdução de sinal tem sido associada com a aquisição da doença resistente à castração. Isto sugere que as estratégias terapêuticas destinadas cascatas de cinase pode ultrapassar os mecanismos de sinalização compensatórias que limitam a eficácia da ablação de androgénios.

De modo a identificar as vias de sinalização que regulam o crescimento de células de cancro da próstata, que um painel blindado de shRNAs que segmentar o kinome humano contra células de cancro da próstata LNCaP crescidas na presença e na ausência de androgénio. Temos procurado por quinases que tiveram efeitos de crescimento gerais e cinases que compensaram ablação de androgénios. A tela identificados vários clones shRNA contra alvos de genes que regulam tanto a sensibilidade andrógeno e crescimento celular. Nós relatamos aqui os resultados de nossa tela e da avaliação detalhada de um subconjunto de quinases identificadas como reguladores de crescimento de células de câncer de próstata.

Resultados

Antes de triagem de um painel de shRNAs que visam o humano kinome contra células de cancro da próstata LNCaP, foi realizada optimização cuidadosa de parâmetros, incluindo as condições de crescimento celular, a multiplicidade de infecção, o tratamento selecção puromicina, androgénio, e as medições de viabilidade celular (dados não mostrados). Foram identificados clones que shRNA diminuição e o aumento de crescimento celular de LNCaP tanto na presença como na ausência de androgénio (Figura 1). A tela usada a biblioteca MISSION® com três a cinco shRNAs para cada um dos 673 alvos quinase; três repetições biológicos independentes foram executadas em dias separados. Seguindo knockdown, alterações no metabolismo celular de LNCaP foram determinados utilizando AlamarBlue como um substituto para a proliferação celular. Foram identificados vários clones shRNA contra alvos de genes que afetam o crescimento celular.

células LNCaP foram transduzidas em triplicado com três a cinco shRNAs dirigidas contra 673 quinases humanos. O crescimento celular foi medido por alamarBlue no dia 7. plotados é o crescimento celular em relação ao controlo pLKO vector vazio em resposta a cada um shRNA na presença e na ausência de hormona (0,05 nM R1881). As linhas vermelhas e verdes demarcar pontos de corte com base em controlos incluindo pLKO, NTC, meios sozinho, e AR shRNA. A linha vermelha indica inibição do crescimento e o crescimento linha verde.

Não houve diferença no crescimento quando comparados pLKO vector vazio a um controlo não-alvo (NTC) (n = 82, os dados não mostrados) . células tratadas-andrógeno cresceu 3,2 vezes maior do que as células tratadas com veículo (N = 82). knockdown AR usando shRNA foi usada como um controlo positivo no ecrã, inibindo o crescimento de mais de 60% em células cultivadas na presença de androgénio (n = 41, os dados não mostrados), mas que tem efeito mínimo sobre as células LNCaP crescidas na ausência de androgénio (n = 41, os dados não mostrados). Na presença de androgénio, que teve shRNAs que inibiram o crescimento de pelo menos 75%, o que representa menos de 1% do topo da shRNAs inibidor do crescimento, como shRNAs segmentação quinases que regulam positivamente o crescimento celular de LNCaP. Na ausência de androgénio, que teve shRNAs que inibiram o crescimento em 50% ou mais, o que representa menos de 2% do topo do shRNAs inibidor do crescimento, como shRNAs segmentação quinases que regulam positivamente o crescimento celular de LNCaP. Usando esses critérios, shRNA knockdown de 46 cinases inibiu o crescimento celular. Curiosamente, muito poucos shRNAs mostrou um efeito que era dependente da presença ou ausência de androgénio. A maioria dos shRNAs inibiu o crescimento em ambas as condições, embora a magnitude de inibição foi variável, indicando que esta tela não revelam especificamente quinases que regulam o crescimento celular de LNCaP induzida por androgénio. proteína ribossomal S6 quinase (RPS6KA3), que tem sido implicado na regulação da actividade de AR e o crescimento de células de cancro da próstata [20] – [24], foi identificado nesta tela, apoiando uma abordagem de triagem para identificar o RNAi cinases regulam o crescimento de células de cancro da próstata. Observou-se também 34 quinases que representam 1% do topo, cujo knockdown aumento do crescimento de células LNCaP (Figura 1)

Foram selecionados seis quinases inibidoras para um estudo mais aprofundado com base na magnitude do efeito pela shRNA knockdown:. Proteína ativada por mitógeno quinase quinase quinase 11 (MAP3K11), diacilglicerol-quinase delta (DGKD), quinase da célula intestinal (ICK), ró citron interagindo quinase (CIT), galactokinase2 (GALK2) e serina proteína H1-quinase (PSKH1). Uma previsão postula que, se as quinases que diminuem o crescimento quando derrubado são causais na progressão do cancro da próstata, então a actividade destas cinases deve aumentar durante a progressão do cancro. Como um passo intermediário para examinar o estado de activação das quinases, foram examinados os níveis de mensagem da quinase na base de dados Oncomine. Verificou-se que em pelo menos dois estudos independentes, os níveis de mRNA para os seis quinases aumentada ou quando o cancro da próstata primário é comparado ao da próstata normais ou quando o cancro da próstata metastático é comparada à doença primária ou da próstata normal (Figura S1).

Nós validado o efeito crescimento e knockdown dos nossos seis quinases selecionados usando o CyQUANT Ensaio, que mede o conteúdo de DNA como um substituto para o número de células, e usou esta técnica para também estender a nossa análise para a linha celular resistente à castração, C4-2B. As células foram transduzidas com as partículas lentivirais que expressam dois específica shRNAs para cada quinase de interesse ou pLKO controle de vetor vazio na presença (0,05 nM R1881) ou ausência de andrógeno. Como pode ser observado na Figura 2, o crescimento foi reduzido em ambas as linhas celulares em resposta a cada um shRNA. Em geral, cinase knockdown inibiu o crescimento na presença e ausência de androgénio. Além disso, cinase knockdown de crescimento afectada de forma equivalente, tanto no LNCaP dependente de androgénios e a linha celular resistente à castração C4-2B.

O efeito relativo dos dois shRNAs independentes por cinase sobre o crescimento celular de LNCaP em (A) e C4- 2B células (B). conteúdo de DNA medida CyQUANT Ensaio como um substituto para o número de células de 7 dias após a transdução de shRNA. O experimento foi realizado na presença e na ausência de hormona (0,05 nM R1881), n ​​= 3 a 7 dependendo da quinase. O crescimento celular foi comparada com o controlo não tratado pLKO e os valores foram a média entre réplicas biológicas. As barras de erro representam o erro padrão da média. * Denota significância estatística.

qPCR foi utilizado para determinar quinase knockdown por shRNA em LNCaP e as células C4-2B (Figura 3). Hormona foi adicionado a várias concentrações (veículo, 0,05, 0,5, e 1 nM R1881) e o ARN foi isolado a 2 e 24 horas a seguir ao tratamento hormonal. Estes tratamentos hormonais foram os mesmos que os utilizados para avaliar o efeito do knockdown quinase na actividade transcricional de AR, o qual é descrito abaixo e apresentado na Tabela 1. Cada cinase foi derrubado em ambas as linhas celulares com dois shRNAs diferentes e em comparação com o vazio pLKO controle de vetores. Não foi observado um efeito da dose de hormona na eficiência de knockdown cinase (Figura S2); Assim, os dados mostrados na Figura 3 são os valores qPCR média entre réplicas biológicas e concentrações de hormona para cada shRNA ou o controlo pLKO às 24 horas após a estimulação hormonal. Os vírus shRNA extrair maior do que 50% knockdown do ARNm alvo de quinase em comparação com pLKO, com a maioria dos knockdowns maior do que 70% em ambos os pontos de tempo e em ambas as linhas celulares. Essencialmente idênticos observações foram feitas por cinase knockdown seguinte 2 horas de estimulação hormonal (dados não mostrados).

os níveis de transcritos de cinase in LNCaP (A) e C4-2B (B) células seguintes knockdown com dois shRNAs independentes por cinase . níveis de transcrição foram medidas por qPCR no dia quatro a seguir a transdução e 2 horas após o tratamento com a hormona R1881 (veículo, 0,05, 0,5, e 1 nM). níveis de transcrição foram comparados com o controlo não tratado pLKO e normalizada para o gene doméstico, PSMB6. Os valores foram na média entre as concentrações hormonais e repetições biológicas. As barras de erro representam o erro padrão da média. * Denota significância estatística.

Houve alguma knockdown diferencial de mRNA quinase por shRNA, o que pode contribuir para o knockdown diferencial de crescimento. Por exemplo, em células de LNCaP, o CIT shRNA-2 induziu uma inibição do crescimento superior a CIT shRNA-1, que se assemelha o efeito sobre knockdown de ARNm de cinase, em que o CIT shRNA-2 reduziu os níveis de mRNA CIT mais do que shRNA CIT-1. No entanto, as semelhanças entre a inibição do crescimento e ARNm knockdown não são evidentes para todos os cinases orientadas.

De modo a determinar se a inibição do crescimento induzida por knockdown quinase era específico para células de cancro da próstata, medimos o crescimento de LHS e MCF10A células em resposta a segmentação shRNA os sete quinases (Figura 4). LHS células são células epiteliais não tumorigénicas da próstata humana imortalizadas gerados pela expressão ectópica de antigénio T grande de SV40, pequeno, e a telomerase humana [25]. MCF10A é, uma linha celular epitelial da mama não tumorigénico espontaneamente imortalizada [26]. células LNCaP serviu como controlo, com experiências paralelas que demonstram a inibição do crescimento celular de LNCaP e expressão quinase (dados não mostrados). Em geral, shRNA dirigido contra as cinases teve um efeito mínimo no crescimento celular LHS e MCF10A, sugerindo selectividade em relação a células de cancro da próstata (Figura 4). O knockdown da mensagem de cinase em células de LHS e MCF10A foi variável (dados não mostrados). Em células de LHS, MAP3K11 foi derrubado eficaz (75 a 90% de inibição) e PSKH1 (50% de inibição); No entanto, o knockdown era ineficaz para as outras cinases. Em células MCF10A, o CIT foi inibido (80%) e PSKH1, DGKD, e cada GALK2 foram inibidas em cerca de 50%. A incapacidade para inibir a expressão da quinase a um nível semelhante como em LNCaP, C4-2B, (Figura 3) e as células CWR22Rv1 (dados não mostrados), complica a interpretação da importância destas cinases no crescimento celular normal e sobrevivência. No entanto, todos os seis cinases foram derrubados em pelo menos uma das linhas de células normais testados. Assim, estes resultados são consistentes com a existência de selectividade para o direccionamento destas cinases em células de cancro em relação às células normais.

O efeito relativo dos dois shRNAs independentes por cinase sobre o crescimento celular no LHS (A) e MCF10A células (B) . conteúdo de DNA medida CyQUANT Ensaio como um substituto para o número de células de 7 dias após a transdução de shRNA. n = 2 para células de LHS e n = 3 para as células MCF10A. O crescimento celular foi comparada com o controlo pLKO e os valores foram a média entre réplicas biológicas. As barras de erro representam o erro padrão da média.

Uma vez que a AR é uma importante regulador do crescimento de células de câncer de próstata, queríamos determinar se qualquer um dos seis quinases selecionados podem afetar o crescimento através da regulação do transcriptoma AR . Para examinar o efeito da quinase knockdown da transcrição do gene alvo AR, qPCR foi utilizado para medir os níveis de transcrição de genes alvo dois Ar, TMPRSS2 e SGK, em células LNCaP e C4-2B com dois shRNAs independentes utilizados para inibir a expressão de cinase (Tabela 1) . Examinámos a transcrição destes genes em 2 e 24 horas para avaliar o efeito do knockdown quinase sobre os níveis de resposta e de estado estacionário imediatos-iniciais de actividade transcricional AR. A análise estatística indica que não houve efeito da dose de hormona na capacidade de quinase knockdown de afectar a transcrição AR; quinase knockdown transcrição alterados de forma equivalente, ou não teve qualquer efeito, em cada dose de androgénio. Manutenção de indução de androgénio em pLKO foi observada em todas as experiências analisadas. Relatados na Tabela 1 são as mudanças estatisticamente significativas na transcrição de AR TMPRSS2 e SGK em resposta a quinase knockdown por dois shRNAs independentes às 2 e 24 horas após a dosagem de androgénio três tratamentos diferentes. Ambos shRNAs tinha para alterar a transcrição do gene significativamente no mesmo sentido, por relatar na tabela.

Não houve diminuição consistente na actividade de transcrição em resposta a AR knockdown das seis quinases em ambas as linhas celulares, genes alvo AR examinados , e os dois pontos de tempo testados (Tabela 1). Knockdown de MAP3K11 diminuiu transcrição de TMPRSS2 em LNCaP células às 24 horas e em células C4-2B às 2 horas após a adição do androgénio. No entanto, MAP3K11 knockdown aumento da transcrição de SGK em células C4-2B 2 horas após a adição ou hormona. Knockdown de DGKD diminuiu transcrição de TMPRSS2 em células e C4-2B de SGK em células LNCaP de 24 horas. Não houve alteração na TMPRSS2 ou transcrição SGK em qualquer linha de células como resultado de o knockdown de ICK ou PSKH1. CIT knockdown tem efeitos díspares sobre a transcrição AR. Curiosamente, o efeito mais consistente sobre a transcrição de AR foi GALK2 knockdown, o que causou um aumento na SGK às 24 horas após a adição da hormona em ambas as linhas celulares e em 2 horas em células C4-2B. No entanto, examinando única TMPRSS2 e SGK como genes alvo AR representante pode criar viés de seleção; portanto, nós expandimos a nossa análise de genes regulados por AR.

Foram analisados ​​14 genes adicionais, incluindo a genes PSA activado-AR, FKBP51, ORM1, veado, NKX3.1, FASN, AQP3, KLK2 e UGT2B ; os genes reprimidos-AR DKK e FST; e que o câncer de próstata regulamentada-AR genes resistente à castração CDC20, CDK1 e UBE2C. A transcrição em células LNCaP seguintes knockdown MAP3K11 foi examinada 24 horas após o tratamento de androgénio. Como esperado, androgénio induzida ou reprimida transcrição de todos os genes alvo de AR nas células de controlo pLKO. O efeito da MAP3K11 knockdown na transcrição AR é dependente alvo. transcrição de TMPRSS2, SGK andrógeno-estimulado, e ORM1 foi reduzido em resposta ao MAP3K11 knockdown (Figura 5A). O inverso foi verdadeiro para os genes reprimidos andrógeno-DKK e FST. MAP3K11 knockdown estimulada a expressão do gene e diminuiu a quantidade de repressão induzido por androgénio (Figura 5B). PSA, FKBP51, veado, NKX3.1, FASN, AQP3, KLK2 e UGT2B não se alterou em resposta a MAP3K11 knockdown. Na medida em que este subconjunto de genes alvo Ar representa o transcriptoma AR, estes dados sugerem que a inibição do crescimento de células em resposta a MAP3K11 quinase knockdown pode ser devido à regulação da actividade de transcrição AR em um subconjunto de genes AR-regulados. A AR regula seletivamente genes regulados pelo ciclo celular, tais como CDC20, CDK1 e UBE2C para promover o crescimento celular [27]. Descobrimos que MAP3K11 knockdown conduziu a um ligeiro, mas estatisticamente significativa redução na transcrição destes genes regulados por AR de fase M (Figura 5C).

níveis (A) transcrição de genes alvo AR induzida por andrógeno que mudou em resposta a MAP3K11 knockdown em células LNCaP transduzidas com dois shRNAs independentes e controle pLKO. O RNA foi isolado 24 horas após a adição de R1881 a 1 nM. níveis de transcrição foram medidas por qPCR, em comparação com pLKO e normalizada para o gene doméstico, de GUS. (B) os níveis de transcrição de genes alvo AR reprimido-andrógenos e níveis (C) transcrição de genes M-fase AR-regulamentados descritos em [27]. (B) e (C) foram processados ​​tal como descrito para (A). Os valores foram a média entre réplicas biológicas, n = 3. As barras de erro representam o erro padrão da média. * Denota significância estatística.

Anteriormente, demonstramos que quinases de stress poderia regular AR Ser 650 fosforilação [28]. Assim, para explorar ainda mais o mecanismo de regulação MAP3K11 do crescimento de células de câncer de próstata e AR transcrição, nós testamos se MAP3K11 knockdown regulada AR Ser 650 fosforilação desde MAP3K11 é um regulador a montante da actividade JNK. PMA induziu fosforilação AR Ser 650 em células LNCaP e C4-2B mais de 3 vezes (Figura 6). Nestas experiências, tanto shRNAs diminuiu MAP3K11 expressão da proteína, com um MAP3K11 shRNA-expressão a diminuir em maior extensão do que MAP3K11 shRNA-2. Foram observadas alterações semelhantes no fosforilação de c-Jun, sugerindo que a MAP3K11 shRNAs inibiu a sinalização da cinase estresse induzido por PMA. Sob estas condições, AR Ser 650 fosforilação foi diminuída em ambas as células LNCaP e C4-2B. Observou-se uma diminuição paralela na AR total. A quantificação da quantidade relativa de Ser 650 a fosforilação total de AR demonstraram uma redução na fosfo-Ser 650 (Figura 6 histograma), sugerindo uma mudança estequiométrica em AR Ser 650 fosforilação em resposta a MAPK3K11 knockdown. MAP3K11 shRNA-1 teve o maior impacto na AR Ser 650 fosforilação, em paralelo com o efeito sobre a expressão da proteína MAP3K11 e fosforilação de c-junho Estas observações são consistentes com os nossos resultados anteriores que sugerem que a sinalização de estresse quinase regula AR Ser 650 fosforilação [28] e ainda sugerem que MAP3K11 knockdown pode estar provocando a inibição do crescimento através de interrupção da AR.

LNCaP e C4-2B As células foram transduzidas com dois shRNAs independentes segmentação MAP3K11 ou controlo pLKO. As células foram tratadas com quer veículo ou PMA. Total de AR foi imunoprecipitada e transferido para os níveis totais de AR e fosfo-S650. O lisado celular foi transferido para MAP3K11 total, a JNK total, a fosfo-JNK, e tubulina. Plotados é o sinal de fosfo-S650 normalizados para AR total n = 3. A determinação quantitativa foi realizada em sistema de imagem Odyssey LICOR. As barras de erro representam o erro padrão da média.

Discussão

O nosso estudo demonstra a aplicabilidade do shRNA baseada lentiviral para a realização de telas fenotípicas para identificar alvos envolvidos no crescimento do câncer de próstata. As vias de sinalização que regulam o crescimento de células de cancro da próstata e a actividade de AR desempenham um papel crucial na transição do cancro da próstata dependente de androgénios para a doença resistente à castração [29]. A fim de identificar quinases dentro destas redes, examinamos como RNAi knockdown de cinases afecta o crescimento de células de cancro da próstata LNCaP. Nós previmos encontrar ambos os reguladores novos e conhecidos de crescimento. As cinases de tela identificado mostrado anteriormente para regular o crescimento de células de cancro da próstata e a actividade de AR, incluindo a cinase ribossomal S6 (RSK ou RPS6KA3) [30]. RSK é a jusante de MAPK e aumenta a transcrição de PSA. inibição química de RSK diminuição da expressão de PSA e o crescimento de células de cancro da próstata [30]. RSK parece mediar a ativação AR transcrição por meio de sua própria função quinase, bem como interações com p300, um co-regulador de AR com a atividade HAT. Identificar RSK em nossa tela suporta telas genéticos hipomórfico para identificar quinases que regulam o crescimento de células de câncer de próstata.

Vários alvos foram identificados em nossa tela de RNAi, sugerindo que a quinase múltiplas vias de sinalização regular o crescimento de células de câncer de próstata. Foram selecionados seis quinases para um estudo mais aprofundado, incluindo MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2 e PSKH1. Knockdown de todos os seis quinases foi encontrada para reduzir o crescimento celular em ambas as células de cancro da próstata dependentes de androgénio e resistente à castração. Para determinar se o efeito de crescimento foi mediada através da AR, foi inicialmente examinada a transcrição de dois genes responsivos AR bem caracterizados, TMPRSS2 e SGK. Nós não observamos um efeito consistente em todos os pontos de tempo e linhas celulares testados na transcrição AR de TMPRSS2 e SGK quando os seis quinases foram derrubados. No entanto, quando expandimos nossa análise ao total de 16 genes regulados por AR em resposta a MAP3K11 knockdown, descobrimos que um subconjunto de genes alvo AR foi alterada. Isto sugere que MAP3K11 knockdown pode modular a atividade transcricional AR e podem mediar os seus efeitos de crescimento através da AR. Além disso, estes dados para adicionar a evidência de que a AR pode ser regulada de forma selectiva promotor, que lhe permite servir como um integrador de vários sinais extracelulares. Nosso laboratório e outros têm relatado esta em estudos anteriores [31], [32]. Outras experiências envolvendo genes alvo AR adicionais será necessário avaliar totalmente os efeitos de knockdown destes seis cinases na transcrição AR.

MAP3K11, também chamado de linhagem mista Quinase (MLK3), é um membro da serina /treonina família cinase que preferencialmente activa MAPK8 JNK quinase /e funciona como um regulador positivo de sinalização JNK [33]. Além disso, esta quinase pode fosforilar e activar directamente quinase IkappaB e está envolvido na actividade transcricional de NF-kB mediada por Rho GTPases da família. MAP3K11 é necessário para a proliferação celular estimulada por soro e de mitogeno e de citocinas activação de p38, ERK, e JNK1. MAP3K11 também desempenha um papel na fosforilação estimulada por mitogénios e activação de BRAF, sem fosforilar directamente BRAF. Assim, MAP3K11 funciona como um nó nas vias de sinalização de stress e mitogénio. Foi anteriormente demonstrado que a activação da via da cinase MAP se correlaciona com a progressão do cancro da próstata em uma variedade de configurações e determinado que a sinalização de stress quinase regula AR Ser 650 fosforilação [28], [34]. Neste estudo, confirmamos que a sinalização de estresse quinase regula AR Ser 650 fosforilação; knockdown de MAP3K11 estequiometricamente diminuído induzido por PMA AR Ser 650 fosforilação. Modulação de Ser 650 fosforilação pode ser regulação da atividade transcricional AR dos genes-alvo AR que foram alteradas em cima MAP3K11 knockdown, incluindo TMPRSS2, SGK, ORM1, DKK e FST. Nós também descobrimos que os castração-resistente do cancro da próstata AR genes regulados da fase M CDC20, CDK1, e UBE2C [27], foram reduzidos em resposta à MAP3K11 knockdown, embora a diminuição na transcrição destes genes podem reflectir a inibição do crescimento desencadeada pela MAP3K11 knockdown e não representam alterado atividade AR transcrição. A nossa tela também identificadas outras quinases de stress, incluindo MAP3K7, MAP4K3, e MAPKAPK5 (dados não mostrados), o que reforça a natureza crítica de sinalização de stress quinase na regulação do crescimento de células de cancro da próstata.

DGKD é uma enzima que fosforila diacilglicerol (DAG) para produzir o ácido fosfatídico (PA). DGK catalisa a fosforilação de DAG, convertendo-a PA, trocando deste modo um segundo mensageiro para o outro e activação da proteína quinase C (PKC) [35]. Existe uma evidência crescente sugere que DGKD está envolvido na regulação dos níveis de PA e DAG em resposta a vários factores de crescimento e hormonas [35]. DGKD foi relatado para interagir com RACK1, uma proteína que se tinha demonstrado anteriormente que uma proteína que regula interagindo AR AR fosforilação e actividade de transcrição [36], [37]. Assim, DGKD pode contribuir para a regulação AR através RACK1. No entanto, knockdown de DGKD não teve um efeito significativo sobre a atividade transcricional AR. pesquisa anteriores mostraram que, na ausência de DGKD, a sinalização do EGFR é diminuída, porque tanto a expressão e a actividade de cinase são inibidas [38]. Este efeito sobre o EGFR é um resultado de uma redução em uma deubiquitinase, USP-8, e, portanto, aumento da ubiquitinação e degradação do EGFR [38]. sinalização de factor de crescimento é conhecido um regulador do crescimento de células de cancro da próstata [29]. É, portanto, possível que o efeito de crescimento que corresponde com DGKD knockdown é o resultado de sinalização do receptor de tirosina quinase alterada.

ICK é uma cinase de serina /treonina que contém um sítio de fosforilação dupla encontrado em proteínas cinases de activação de mitogénio cuja actividade é regulada pela cinase relacionada com o ciclo celular (CCRK) e fosfatase humano proteína 5 (PP5) [39]. ICK está relacionada com a proteína-quinase associada às células germinais masculinas (MAK). MAK é um co-regulador de AR que se liga directamente a AR em experiências de co-imunoprecipi tacão e aumenta a transcrição dependente de RA de um modo dependente-quinase [40]. A inibição da MAK com qualquer RNAi ou uma forma de cinase morta diminuiu o crescimento de células LNCaP. O efeito da MAK knockdown no crescimento paralelo com as nossas observações com ICK embora não se tenha observado um efeito de ICK na transcrição AR sugerindo um mecanismo alternativo de regulação do crescimento. ICK pode fosforilar foice, uma proteína anti-apoptótica e, portanto, podem regular a sobrevivência das células [39], [41].

O CIT é uma proteína quinase de especificidade dual que é um RHO putativo e efectora RAC, que pode desempenhar um papel na citocinese [42]. CIT knockdown pode perturbar citocinese e crescimento das células, portanto. GALK2 é uma cinase N-acetilgalactosamina (GalNAc), que também tem actividade em concentrações de galactose galactoquinase elevadas [43]. Regulação do metabolismo de hidratos de carbono é necessária para o crescimento celular e GalNAc é crítico para a O-glicosilação ligada e a regulação correspondente da sinalização celular [44]; GALK2 knockdown pode interromper esses processos celulares fundamentais. PSKH1 é um pouco estudado quinase que pode ser um compartimento associado serina-quinase factor de splicing com um papel na intranucleares snRNP não-tráfico factor de splicing e de pré-processamento de ARNm [45]. A ausência de um efeito significativo nas células da próstata LHS não tumorigénicas MCF10A e células da mama pode ser devido a diferenças na eficácia relativa do knockdown e /ou requisito para estas quinases nestes processos celulares fundamentais. É plausível que o requisito para o CIT, GALK2, e PSKH1 varia dependendo do estado tumorigénico uma vez que os níveis de mRNA destas cinases aumentar à medida que progride o cancro da próstata (Figura S1). Estudos adicionais são necessários para determinar o mecanismo de regulação do crescimento para estas cinases em cancro da próstata.

Neste estudo, um painel blindado de shRNAs segmentação do kinome humano contra células de cancro da próstata LNCaP crescidas na presença e na ausência de androgénio para identificar as vias de sinalização que regulam o crescimento de células de cancro da próstata. Foram identificados vários clones shRNA contra quinases que regulam o crescimento de células de câncer de próstata andrógeno-dependentes e resistente à castração. Este estudo demonstra ainda mais a aplicabilidade de lentivírus com base shRNA para a realização de telas fenotípicos para identificar alvos envolvidos numa variedade de processos biológicos, e estabelece MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, e PSKH1 como reguladores de crescimento de células de cancro da próstata.