Sumário

A trombose é comum em cancro do ovário. No entanto, a interacção de plaquetas com células de cancro do ovário não foi examinada criticamente. Para resolver isso, nós investigamos interacções plaquetas em uma variedade de linhas celulares de cancro do ovário com diferentes potenciais metastáticos [HIO-80, 59m, SK-OV-3, A2780, A2780cis]. As plaquetas aderiram a células de cancro do ovário com a adesão mais significativa para a linha de células de 59M. células de cancro do ovário a activação de plaquetas induzidas [expressão da selectina P] de uma forma dependente da dose, com a activação mais significativa observada em resposta à linha de células 59M. Os antagonistas de plaquetas [cangrelor, MRS2179, e apirase] inibiram a activação de células induzida 59M sugerindo um mecanismo receptor P2Y12 e P2Y1 mediada da activação das plaquetas dependente da libertação de ADP por 59M células. células A2780 e 59m potenciada PAR-1, de PAR-4, e o receptor TXA2 de plaquetas mediada por activação, mas não teve nenhum efeito sobre a activação induzida pelo ADP, epinefrina, colagénio ou. Análise das alterações de expressão de genes em células de cancro do ovário, após o tratamento com plaquetas lavadas ou releasate plaquetas mostraram uma regulação positiva subtil mas válida de anti-apoptótica, pró-angiogénico, ciclo-celular anti-Pro autofagia e genes metabólicos. Assim, as células de cancro do ovário com diferentes aderir potencial metastático e ativar as plaquetas diferencialmente enquanto ambas as plaquetas e releasate plaquetas mediar sinais pró-sobrevivência e pró-angiogénicos em células de cancro do ovário

Citation:. Egan K, Crowley D, Smyth P , O’Toole S, Spillane C, Martin C, et al. (2011) na adesão plaquetária e Degranulação Induzir Pro-Sobrevivência e Pro-angiogénicos Sinalização em células do cancro do ovário. PLoS ONE 6 (10): e26125. doi: 10.1371 /journal.pone.0026125

Edição: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Recebido: 10 de maio de 2011; Aceito: 20 de setembro de 2011; Publicação: 12 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Egan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por uma bolsa da Science Foundation Ireland [SFI] como parte do Instituto de Diagnóstico Biomedical [Centro BDI-2 para a Ciência e Tecnologia Excellence (CSET)]. KE é suportado através do Biophotonics Nacional e plataforma de imagem, Irlanda, e financiado pelo Programa do Governo irlandês de Investigação em terceiro lugar instituições de nível, Ciclo 4, Plano Nacional de Desenvolvimento 2007-2013. DC é apoiado pelo Conselho de Investigação em Saúde (Irlanda) Programa Scholars: Medicina Molecular – a partir de genes para funcionar. BF e LMcE são suportados pelo Casey Foundation Emer, Irlanda. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a quinta principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres [1]. É a neoplasia maligna ginecológica mais comum e tem a maior mortalidade a proporção de caso de todas as malignidades ginecológicas. A taxa de sobrevivência pobres é o resultado de diagnósticos fase tardia. A maioria dos pacientes são assintomáticos até que a doença tenha metastizado [2]. Propagação do cancro do ovário foi considerada como ocorrendo principalmente no peritoneu [3]. No entanto, estudos de autópsia e de imagem [4], bem como evidência para a presença de micrometástases em aspirados óssea de pacientes estágio inicial de câncer de ovário [5] sugerem que a metástase hematogênica é mais comum do que se pensava anteriormente.

Durante disseminação hemática, acredita-se que a capacidade das células de tumor circulante para interagir com as plaquetas para promover a sobrevivência no interior da circulação e, por conseguinte, facilitar a metástase. experiências com animais pré-clínicos demonstraram que a farmacologicamente [6] ou geneticamente [7] trombocitopenia induzida, bem como defeitos na função das plaquetas [7] – [10] está associado com a metástase reduzida. Acredita-se que a interação de células cancerosas com plaquetas para conferir uma série de vantagens que promovem a metástase bem sucedida, incluindo a protecção contra agressão imunológica e evasão de vigilância imune [11], [12], a liberação de crescimento, angiogênico, e os fatores de permeabilidade vascular durante ativação e degranulação [13]

Trombose e trombocitose são complicações frequentes de câncer de ovário e estão associados com mau prognóstico [14] – [16]., destacando a importância de plaquetas na patologia de câncer de ovário. No entanto, a interacção entre as plaquetas e células de cancro do ovário não tem sido bem estudada. Neste estudo, teve como objetivo caracterizar a interacção de plaquetas com células ovarianas, usando uma linha normal de ovário celular [HIO-80] e do ovário células cancerosas linhas com diferentes propriedades biológicas e potenciais metastáticos [59M, SK-OV-3, A2780, e A2780cis].

em primeiro lugar, estudou-se a adesão de plaquetas às células de cancro do ovário, em condições estáticas para determinar se uma interacção adesiva entre as plaquetas e células de cancro do ovário existe. Em segundo lugar, foi avaliada a capacidade das células de cancro do ovário para induzir a ativação plaquetária e degranulação [expressão P-selectina]. Depois de estabelecer que as plaquetas aderem às células de cancro do ovário e células de cancro do ovário são capazes de induzir a ativação plaquetária e degranulação, nós próxima avaliadas mudanças de expressão gênica no nível transcriptoma em células de câncer de ovário tratados com plaquetas ou releasate plaquetas. Os nossos resultados mostram interacções diferenciais entre as plaquetas e linhas celulares de cancro do ovário, não só em termos de adesão e activação de plaquetas, mas também alterações em expressão de genes em células de cancro tratados com plaquetas lavadas ou releasate plaquetas. Múltiplas interações ocorrem entre plaquetas e células de cancro do ovário que envolvem fatores liberados por plaquetas e células cancerosas, bem como as interacções celulares de plaquetas-ovariano diretos. Essa interação resulta em um pró-sobrevivência, sinal pró-angiogénicos para a célula de câncer de ovário.

Métodos

Ética declaração

A coleta de sangue para este estudo foi aprovado pela Real college of Surgeons na Irlanda comissão de ética e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores antes da flebotomia.

reagentes

Todos os reagentes foram adquiridos de Sigma-Aldrich [St Louis, MO, EUA], a menos de outro modo indicado. O colagénio [pele de vitela solúvel], a adenosina-5′-difosfato, epinefrina, e ácido araquidónico foram obtidos a partir de BioData [Horsham, PA, EUA]. Alexa Fluor-488-faloidina etiquetada, calceína AM, e o fibrinogénio foram obtidos a partir de Invitrogen [Carlsbad, CA, EUA]. Ficoeritrina [PE] marcado com [IgG de ratinho] anti-humano da selectina P, PE-rotulados rato de controlo de isotipo de IgG, e marcado com PE anti-humano CD42a [IgG] anticorpos foram adquiridos da BD Pharmingen [San Diego, CA, EUA].

as linhas celulares

a seleção de linhagens de células de ovário de origem epitelial foram escolhidos para a inclusão neste estudo como cancros do ovário epiteliais são o tipo histológico mais comum. HIO-80 [um presente a partir do centro do cancro Fox Chase, Philadelphia, PA] representa uma linha não-tumorigénico humano normal célula epitelial do ovário, que foi imortalizada por transfecção com um plasmídeo que codifica para o gene de T grande de SV40. As células HIO-80 foram mantidas em uma mistura 01:01 de meio MCDB 199 e-105 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e 0,2 UI /mL de insulina humana recombinante, tal como recomendado por Fox Chase. 59M [Coleção Europeia de culturas de células (ECACC), Salisbury, Reino Unido] representa um carcinoma do ovário humano tumorigênico epitelial do tipo endometrioid com componentes de células claras, originalmente isoladas a partir de ascite de um paciente de 65 anos com câncer de ovário metastático. 59M células foram mantidas em DMEM, 1 g de glucose /L, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina, tal como recomendado por ECACC. SK-OV-3 [American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EUA] representa um adenocarcinoma de ovário humano tumorigénico epitelial, originalmente isolado a partir de ascites de uma doente de 64 anos com cancro metastático do ovário. SK-OV-3 foi cultivada com meio 5A de McCoy suplementado com 10% de soro fetal de bovino [Invitrogen, Países Baixos], 100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, tal como recomendado pela ATCC. A2780 [ECACC, Salisbury, Reino Unido] é derivado a partir de um tecido de tumor epitelial do ovário seroso num doente não tratado. A linha de células resistentes à cisplatina A2780cis foi desenvolvido pela exposição crónica da linha de células sensíveis a cisplatina A2780-mãe a concentrações crescentes de cisplatina. Ambas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, tal como recomendado por ECACC. Todas as linhas celulares foram crescidas em condições padrão numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 a 37 ° C.

preparação de plaquetas

O sangue foi obtido a partir de dadores saudáveis ​​que não tinham tomado medicamentos conhecido por afetar a função plaquetária por pelo menos 10 dias. O sangue foi colhido por punção venosa através de uma agulha de borboleta de calibre 19, sem um torniquete, para evitar a activação de plaquetas. As plaquetas foram preparadas como previamente descrito [17]. Em resumo, para a preparação de plasma rico em plaquetas [PRP], recolheu-se sangue para uma seringa contendo 3,2% de citrato trissódico como anticoagulante [10% vol /vol, em seguida, centrifugada a 170 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Para a preparação de plaquetas lavadas, do sangue foi recolhido em ácido-citrato-dextrose [ACD: ácido cítrico 38 mM, citrato de sódio 75 mM, 124 mM de D-glucose] como anticoagulante [15% vol /vol]. O sangue foi centrifugado a 170 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. PRP foi acidificada a pH 6,5 com ACD, e PGE

1 [1 uM] foi adicionado para evitar a activação das plaquetas durante a centrifugação. As plaquetas foram sedimentadas por centrifugação a 720 g durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o sedimento de plaquetas foi ressuspenso em tampão de JNL [NaCl 130 mM, citrato de sódio 10 mM, 9 NaHCO mM

3, mM de D-glicose-6, e MgCl 0,9 mM

2, KH 0,81 mM

2 PO?

4, e Tris 10 mM, pH 7,4] para uma concentração de 2,5 × 10

8 /mL e suplementado com CaCl 1,8 mM

2.

ensaio de adesão de plaquetas

O ensaio de adesão de plaquetas foi realizada como previamente descrito [18]. Em resumo, as células do ovário foram semeadas numa placa de 96 poços [Nunc, Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Alemanha] a uma concentração de 5 × 10

4 /ml e cultivadas até à confluência. As plaquetas lavadas [1,5 × 10

8 /ml] pré-carregado com calceína AM [2? g /ml] foram deixadas aderir às células durante 45 minutos a 37 ° C. A fluorescência total [485/535 nm] por poço foi medido utilizando um Victor2 ™ contador Wallac 1420 multilabel [Perkin Elmer, Waltham, MA., EUA] leitor de placas. A placa foi lavada três vezes, 100 ml de JNL foi adicionado a cada poço da placa, e a fluorescência remanescente foi lido. % A adesão de plaquetas foi calculada como [fluorescência remanescente – em branco] /[fluorescência total – em branco] × 100. A adesão de plaquetas às células de ovário foi visualizada por microscopia de fluorescência. Quando confluentes, as células foram descoladas com EDTA 7 mM em PBS de Dulbecco, lavou-se duas vezes, e ressuspensas em JNL suplementado com CaCl 1,8 mM

2. Células [1 × 10

5 /ml] foram incubadas em BSA a uma corrediça revestidos com poli-L-lisina durante 45 minutos a 37 ° C. Após a adesão, as plaquetas lavadas [50 × 10

6 /ul] foram adicionados à corrediça e incubadas durante 45 minutos a 37 ° C. As amostras foram fixadas com 3,7% de paraf ormaldeido durante 15 minutos à temperatura ambiente e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100. As plaquetas e células do ovário foram coradas com Alexa Fluor 488-faloidina [41,25 nM,] durante 15 minutos à temperatura ambiente. As plaquetas foram especificamente corada com o anticorpo CD42a ficoeritrina anti-humano marcado com [1,25 ug /mL] durante 2 horas a 37 ° C. As lâminas foram montadas e fotografadas através de microscopia de fluorescência.

activação de plaquetas

A capacidade das células de cancro do ovário para induzir a activação de plaquetas (P-selectina expressão) foi avaliada por um ensaio de citometria de fluxo com base modificado de Nylander et al [19]. Num volume total de reacção de 100 ul, 10 ul de PRP foi incubado com células de cancro do ovário [0 – 1,5 x 10

6 /ml,] na presença de um anticorpo de P-selectina anti-humano marcado com PE [1,25 ug /ml] ou um controlo de isotipo adequado [1,25 ug /mL]. Todas as incubações foram realizadas à temperatura ambiente durante 15 minutos. A reacção foi então terminada com 1 ml de tampão de JNL antes da análise por citometria de fluxo. As amostras foram analisadas usando um BD FACS Calibur [Becton Dickinson, Palo Alto, CA, EUA] em 1 hora. O instrumento foi criado para medir o tamanho [dispersão para a frente, FSC], granularidade [dispersão lateral, SSC] e fluorescência celular. Usando um log de FSC vs. log gráfico de pontos SSC, um portão dois análise dimensional foi tirada por volta da população de plaquetas, e um histograma de fluorescência [log FL2 vs. contagem] foi obtido para 10000 eventos de plaquetas para cada amostra. Os dados foram analisados ​​utilizando o software CellQuest Pro e expressas como percentagem das plaquetas que foram P-selectina positivo em relação ao controlo de isotipo.

Isolamento de plaquetas releasate

plaquetas lavadas [2,5 × 10

8 /ml] foram estimuladas com ambos TRAP [trombina receptor do peptídeo de activação, 20