Abstract

na progressão tumoral alterações definitivas na matriz nuclear (NM) composição de proteína, bem como na estrutura da cromatina ocorrer. O NM interage com cromatina através de sequências de DNA especializadas chamadas regiões de ligação à matriz (Marte). No presente estudo, usando uma abordagem proteômica, juntamente com um ensaio Texmex bidimensional e microscopia confocal a laser, mostramos que a diferenciação de células de carcinoma de próstata humana estabilizados é marcada por modificações tanto a composição de proteína NM e ligação entre proteínas e Marte NM. responsivos aos andrógenos bem diferenciado e de crescimento lento, células LNCaP são caracterizados por um padrão de menos complexo e por um grande número de proteínas de ligação a sequências de Mar, em comparação com células que expressam 22Rv1 receptor de androgénio, mas independente de androgénios. Finalmente, nas células PC3 independente de andrógeno pouco diferenciadas e fortemente agressivos a complexidade do padrão NM novos aumentos e um número menor de proteínas se ligam a Marte. Além disso, nesta linha celular relativamente às células LNCaP, estas alterações são síncronos com modificações tanto na distribuição das sequências nucleares MAR e nas dimensões médias de ansa que aumentam significativamente. Embora a expressão de muitas proteínas alterações NM durante desdiferenciação, apenas a um grupo muito limitado de proteínas de ligação MAR-parecem desempenhar um papel-chave no presente processo. As variações na expressão de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e especial rica em AT proteína-1 (SATB1), juntamente com um aumento da fosforilação da lamina B representam alterações que podem desencadear passagem para um fenótipo mais agressivo de ligação sequência . Estes resultados sugerem que elucidar as proteínas MAR-ligação que estão envolvidos na diferenciação de células de câncer de próstata pode ser uma ferramenta importante para melhorar a nossa compreensão deste processo de carcinogênese, e eles também podem ser novos alvos para terapia de câncer de próstata.

Citation: Barboro P, Repaci E, D’Arrigo C, Balbi C (2012) O papel da matriz Nuclear proteínas de ligação a regiões de ligação à matriz (MARS) no câncer de próstata Diferenciação celular. PLoS ONE 7 (7): e40617. doi: 10.1371 /journal.pone.0040617

editor: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Dezembro, 2011; Aceito: 11 de junho de 2012; Publicação: 11 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Barboro et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Regione Liguria (www.regione.liguria.it), número de concessão 563/2009; Compagnia de San Paolo (www.fondazioneintesasanpaoloonlus.org), número de concessão 2.009,127; Ministero dell’Universita ‘e Ricerca Scientifica – MIUR (www.prin.miur.it) projeto PRIN, conceda número 2005065404-003. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

organização nuclear anormal e alterações na quantidade e distribuição de heterocromatina têm sido reconhecidos como marcas do câncer humano [1]; No entanto, neste momento, não sabemos as causas exactas destas modificações, nem sabemos como a atividade /silenciamento de milhares de genes é orquestrado. Em eucariotas, o genoma é compartimentada em domínios de cromatina através da anexação de cromatina para uma estrutura de suporte: a matriz nuclear (NM). As interações entre cromatina ea NM ocorrer através de sequências de DNA AT-ricos chamadas regiões de ligação à matriz (Marte). A função de Marte em vários processos, incluindo a organização de ciclos de cromatina, aumentando a expressão de genes e facilitando a replicação [2]. Nem todos os MARs potenciais estão vinculados ao NM ou participar na organização das regiões de ligação ao loop. MAR de ligação é um evento dinâmico que é do tipo de células e /ou dependente do ciclo celular e podem permitir a regulação de genes distantes de uma forma coordenada [3]. Várias proteínas de ligação-MAR foram identificadas, algumas das quais são desregulados drasticamente em células tumorais. Muitas vezes, sua expressão é também significativamente correlacionadas com fenótipos de tumor agressivo. Da mesma forma, modificações nas interações entre proteínas e Marte NM pode estar relacionado com a reorganização da cromatina em larga escala observada durante a carcinogênese. Isso levou um interesse crescente em Marte e proteínas como potenciais alvos para fármacos antineoplásicos [2].

Recentemente, demonstramos que nos primeiros estágios da carcinogênese fígado de rato, em larga escala cromatina reorganização é MAR-vinculativo relacionada a alterações composição morfológica e proteína do NM. Estas alterações modificar a capacidade das proteínas NM para se ligarem ARN e sequências de ADN contendo MAR-[4]. Além disso, estas alterações estão em sincronia com mudanças na organização da lamins no nucleoplasma. Em hepatócitos normais, as laminas são montados em filamentos que formam uma estrutura ortogonal, enquanto que em hepatócitos transformaram o bidimensional ordem local está perdido [5].

carcinoma da próstata (PCA) representa um importante problema de saúde porque o seu incidência continua a aumentar, e não existem actualmente biomarcadores capazes de distinguir tumores indolentes de os agressivos. ablação de androgénios é a abordagem terapêutica mais comum de CaP. Infelizmente, após alguns anos de tratamento, a doença progride, na maioria dos pacientes, em seguida, que adquirem um fenótipo independente de androgénios para o qual não existem tratamentos disponíveis [6]. Um entendimento das vias que levam à independência androgénio é, por conseguinte, crítica para o desenvolvimento de novas terapias. Trabalho realizado em nosso laboratório e outros a procurar marcadores APC com melhores recursos de diagnóstico e prognóstico identificou várias proteínas NM que são diferencialmente expressos em APC com relação ao tecido não-tumoral; Além disso, algumas proteínas foram significativamente correlacionados com a agressividade do tumor e /ou risco de progressão bioquímica [7], [8].

Neste estudo, foi utilizada uma abordagem proteômica, juntamente com bidimensional Texmex blot (SWB ) e confocal análises para caracterizar a ligação entre proteínas e Marte NM em três linhas de células CaP humanos que representam modelos de diferentes fases de progressão PCA: a linha de células LNCaP andrógeno responsivo bem diferenciado, a AR intermediária diferenciar células 22Rv1 que expressam o receptor de andrógeno ( ), mas independente de androgénios e, finalmente, o PC3 pouco diferenciado e fortemente agressivo que não expressa AR. Estas linhas celulares são um sistema modelo bom para estudar a progressão CaP como mais do que 70% das proteínas expressas NM combinar as isoladas a partir de tecidos de CaP [9]. Aqui nós fornecem evidências de que existe uma relação inversa entre a complexidade da formulação de proteína NM e o grau de diferenciação da linha de células e que as interacções nm com sequências MAR alterar durante a diferenciação, o que modifica as dimensões do laço da cromatina e, consequentemente, a expressão do gene.

Materiais e Métodos

Cultura de células

LNCaP, linhas de células de carcinoma 22Rv1 e próstata PC3 foram obtidas de ATCC (CRL-1740, CRL-2505 e CRL-1435, respectivamente; Rockville, MD, EUA) e mantidas em meio RPMI-1640 sem vermelho de fenol (Celbio, Milão, Itália) contendo soro inactivado pelo calor 10% de bovino fetal (carvão despojado), 1% penicilina, 1% estreptomicina e 1% de glutamina. forma de LNCaP e 22Rv1 também foi suplementado com HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM e 4,5 mg /ml de glucose. Os números de passagem em que as células LNCaP foram colocados em meio de manutenção variou de 24 a 34. As células foram cultivadas em monocamada em presença de 0,1 nM de 5-α-di-hidrotestosterona (Sigma, St. Louis, MO, EUA) a 37 ° C em 5% de CO

2. Todas as experiências foram realizadas usando células a partir de uma cultura em fase exponencial.

Isolamento do NM

Para um ou electroforese em gel de poliacrilamida bi-dimensional (1D ou 2D-PAGE), era o NM isolado de acordo com Barboro

et al

. [10]. As concentrações de proteína foram determinadas usando o Bio-Rad (Munique, Alemanha) microensaio de proteína com albumina de soro bovino como padrão. Para a microscopia confocal, o NM foi extraído

in situ

como descrito por Zeng

et al

. [11].

(A) gel 1D Representante Deep Purple-manchados eo SWB correspondente. As setas à direita indicam as três bandas principais resultantes em 1D SWB, cada um dos quais corresponde a vários pontos em 2D, como é evidente em (D), (F) e (H). (B) A comparação entre a quantidade relativa de ligação a proteínas XmnI NM nas diferentes linhas celulares. Ordenada representa a média ± SE de as quantidades relativas de Xmnl, tal como determinado por análise quantitativa de três preparações diferentes. A diminuição na 22Rv1 e PC3 com células LNCaP respeito, foi significativa (P = 0,004 *, ** P 10

-5). Mapas de gel (C, E e G) representativas 2D corados com prata e (D, F e H) SWB de proteínas NM extraídos de LNCaP (C, D), 22Rv1 (E, F) e PC3 (G, H) de células. As proteínas identificadas são destacadas em caixas vermelhas. Os três setas mostram os três grupos de proteínas apontadas em (A). L, Lamin; h, RNPhn, fr, fragmentos

Preparação de DNA Probe

Uma sequência de DNA altamente repetitivo de 370 pb (XmnI) obtido do banco de dados de transações S /MAR [http.: //smartdb.bioinf.med.uni-goettingen.de] libertar 2.3 (número de acesso SM0000134) foi utilizado como uma sonda para experiências de ligação de ADN. XmnI é uma sequência de ADN rica em AT dentro de uma região de base-Desemparelhar (BUR) e é capaz de se ligar as mesmas proteínas que se ligam a MAR contendo ADN co-isolado com o NM, como já anteriormente demonstrado [4]. O plasmídeo pUC57 com a sequência XmnI foi construído por GenScript Corporation (Piscatway, NJ, EUA).

Escherichia coli TOP

F10 ‘foi transformada com pUC57, e as células transformadas foram seleccionadas em placas de agar suplementado com ampicilina. Os plasmídeos foram isolados usando o kit Qiagen Plasmid Maxi, restrição digerida com

Xmn I e subsequentemente a partir de agarose utilizando um kit de purificação de PCR puro alta produto (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), purificado em gel.

amostras de DNA foram biotinilados através do procedimento de tradução nick (BioNick DNA Labeling Sistema, Invitrogen /Life Technologies, San Diego, CA). os nucleótidos não incorporados foram removidos a partir da amostra utilizando uma coluna de centrifugação de Sephadex G-25 (Roche Diagnostics).

Nuclear Preparação halo e halo por fluorescência A hibridação in situ (FISH)

halos nucleares foram preparados de acordo com o método de de Belle

et ai. [12] com pequenas modificações. Resumidamente, LNCaP e células PC3 foram lavadas duas vezes em fosfato tamponado salino (PBS) e os núcleos foram extraída por incubação das células em KCl 100 mM, sacarose 300 mM, PIPES 10 mM, pH 6,8, MgCl 3 mM de

2, 0,5% de Triton X-100 a 4

°

C durante 20 min. Em seguida, 3 × 10

5 núcleos foram cytospun em lâminas durante 10 minutos a 100 ×

g.

As lâminas foram imersas durante 4 minutos em uma solução contendo NaCl a 2 M, PIPES 10 mM, pH 6,8 e EDTA e 10 mM, em seguida, lavado por 2 min por uma série de 10X, 5X, 2X e 1X PBS, pH 7,4. Após fixação com formaldeído a 3,7% em PBS, o ADN foi corado com DAPI e o tamanho relativo de cada um halogénio núcleo foi determinada como relatado por Guillou

et ai. [13].

(A) diagrama de Venn mostra o número de manchas de proteínas visualizadas em cada linha celular. Números das regiões de sobreposição representam pontos comuns. Gráficos (B-D) Pie que mostra a percentagem de manchas que se ligam a sequência XmnI em três linhas de células. As cores ciano e amarelo, indicam os pontos que eram, com células respeito LNCaP, expressa de forma diferente ou com nenhuma diferença, em 22Rv1 (C) ou PC3 (D), respectivamente.

Para examinar a distribuição das sequências XmnI em nucleoids, foi aplicada a técnica de halo-FISH. Após extracção halo e fixação, as lâminas foram incubadas com 70% de formamida, 2x citrato de salina de sódio (SSC) e 50 mM de fosfato de sódio, pH 7,0 a 73 ° C durante 3 min, seguido por 50% de formamida, 2x SSC e de sódio 50 mM fosfato, pH 7,0, a 73 ° C durante 1 min. A mistura de hibridização (4 ng /sonda XmnI pi biotinilado, 2x SSC, 1 mg /mL de ADN competidor, 10% de sulfato de dextrano e 25% de formamida) foi desnaturado pelo calor em separado durante 5 min a 73 ° C, rapidamente arrefecido em gelo e aplicadas a o espécime. Após uma incubação durante a noite a 37 ° C, as lâminas foram lavadas três vezes com 50% de formamida e SSC 2x, pH 7,0, a 42 ° C durante 5 minutos, seguido por mais três lavagens com SSC 0,1X a 60 ° C durante 5 min. detecção de FISH foi realizada com estreptavidina conjugada com FC

TM555 (diluição 1:100, Biotium, Hayward, CA), enquanto ADN total foi contrastadas com DAPI. As amostras foram analisadas por microscopia de luz usando um microscópio Leica DM LB2 epifluorescência (Wetzlar, Alemanha) equipado com uma objectiva de 40x. As imagens foram capturadas com uma câmera Olympus DP70 e processados ​​com software v1.43 WCIF ImageJ (https://www.uhnresearch.ca/facilities/wcif/imagej/).

Gel Eletroforese

1D e 2D-PAGE das proteínas nm foram realizados como previamente descrito [14]. Os géis foram quer corados para análise do padrão de proteína ou processados ​​para Western Blot (WB) ou SWB. O padrão de fosforilação lamina B foi realizada por uma análise proteomic multiplexado. Os géis foram inicialmente incubadas com Pro-Q diamante (Molecular Probe Inc., Eugene, OR, EUA), um corante específico da fosfoproteína, seguido por incubação com SYPRO rubi corante (Molecular Probe Inc.) para a visualização da proteína total, tal como recomendado pela o fabricante.

SWB e WB Procedimentos

SWB foi realizada conforme relatado anteriormente [4]. Resumidamente, um gel 1D ou 2D-PAGE foi electrotransferidas para uma membrana de Hybond-P (GE Healthcare, Piscataway, NJ). A membrana foi incubada em tampão A (150 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de MgCl

2 e 0,5% de Tween-20) durante 2 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 37 ° C em o mesmo tampão contendo 50 ng /ml de sonda de ADN e um excesso de 500 vezes de um competidor não específico (ADN de esperma de arenque sonicado). A membrana foi então lavada com três mudanças de tampão A, durante um período de 60 min. Antes de detecção, as membranas sondadas com ADN biotinilado foram incubadas durante 30 min com estreptavidina de rábano ligada a peroxidase (Invitrogen, Carlsbad, CA) diluída 1:1200 em tampão A e foram em seguida lavadas quatro vezes com o mesmo tampão durante 15 min à temperatura ambiente . detecção de não-radioativo de DNA ligado ao NM foi realizado com os ECL Mais de Western Blotting Reagentes aprimorados e revelou usando Hyperfilm ECL (GE Healthcare), com as mesmas condições de exposição.

As ordenadas representam a média ± SE de as quantidades relativas destas proteínas, tal como determinada por análise quantitativa de três a seis PEP efectuados utilizando pelo menos três preparação diferente de NM (* P ≤ 0,05; ** P 0,0005). WBS representativos são mostrados à direita; os principais fragmentos proteolíticos de PARP1 e SATB1 são marcadas por pontos completos. Os pesos moleculares relativos de proteínas padrão em kDa são relatados.

Para WB, as proteínas separadas por 1D ou 2D-PAGE foram transferidas para uma membrana Hybond-P (GE Healthcare), e a imunodetecção foi realizada utilizando os anticorpos apresentados na Tabela 1. as manchas imunoreactivas foram detectadas bandas ou utilizando ECL. Após análise WB 1D, a quantidade relativa de cada proteína sob estudo foi obtida através da normalização da densidade óptica integrada por ECL com a densidade óptica integrada da quantidade total de proteínas nm, determinado por coloração do gel roxo profundo como anteriormente [4] descrito. Resumidamente, quantidades iguais (8 ug) da mesma preparação foram carregados dois géis em 1D-PAGE e submetidos a electroforese. Um gel foi corado com Deep Purple e varrimentos densitométricos foram realizados em um scanner Molecular Imager FX (Bio-Rad) e as quantidades totais de proteína (

A

) foram avaliados pela integração da curva de densidade óptica. O segundo gel foi transferido e as bandas imunorreactivas foram detectadas utilizando filmes Hyperfilm ECL (GE Healthcare), os quais exibem uma resposta linear à luz produzida a partir de quimioluminescência aumentada. As quantidades relativas de proteínas Understudy foram obtidos através da normalização da densidade óptica integrada por ECL (

B

) com a densidade óptica integrada (

Um

) do gel manchado roxo-Profunda correspondente. Este método permitiu-nos obter resultados quantitativos. A comparação entre as quantidades relativas de proteínas foi realizada por exportar os valores individuais de cada filme e analisá-los utilizando o teste t de Student dentro do software OriginPro 7.5.

Análise

Imagem de padrões 2D Gel spot

Todos os géis 2D corados com prata foram digitalizados com um densitómetro de GS-800 (Bio-Rad), utilizando as mesmas condições de digitalização. detecção de ponto, o alinhamento gel e normalização foram realizadas utilizando o pacote de software PDQuest (Ver. 7.3.0, BioRad). análise diferencial foi realizada agrupando géis 2D em três classes, cada um contendo quatro a seis géis obtidos a partir de quatro a cinco preparações NM diferentes isolados a partir de células LNCaP ou 22Rv1 ou células PC3. Reprodutibilidade dos géis, expressa como uma percentagem média de pontos correspondentes dentro de cada classe ± SD, foi de 87 ± 5% de LNCaP, 83 ± 3% para 22Rv1 e 83 ± 1% para PC3. O teste de Mann-Whitney foi usado para detectar pontos sobre ou sub-expressos; P 0,05 foi considerado estatisticamente significativas e manchas de proteínas cuja expressão foi apenas duas vezes ou mais desregulado foram analisados. Para compensar as diferenças subtis no carregamento de amostra e coloração de gel, o volume de cada mancha foi normalizada de acordo com a quantidade total de pontos válidos em cada gel.

O software de análise de PDQuest foi também utilizado para detectar proteínas que se ligam a anticorpos em 2D WB, combinando os pontos de antígeno em autorradiografias com manchas de proteína na réplica 2D SWB. células inteiro de

(a, D) corados por imunofluorescência dual-cores. (B, E) NM preparado

in situ

e corados pela imuno-FISH. (A, B) Análise de microscópio confocal da localização da PARP (verde) e sequência de ADN ou XmnI (azul). (D, E) Localização dos SATB1 (verde) e DNA ou sequência XmnI (azul). Na parte inferior dos painéis B e E os varrimentos das linhas de perfil de intensidade, realizado entre as cruzes brancas do NM como indicado nas imagens confocais de intercalação em B e E, são mostrados. A ordenada representa a intensidade de fluorescência em unidades arbitrárias, a abcissa representa a distância em pixels. As barras correspondem a 5 um. (C, F) Gráficos de dispersão que mostra a quantificação da análise de co-localização de PARP /ADN (a), a PARP /XmnI (b), SATB1 /ADN (a), ou SATB1 /XmnI (b), respectivamente. R corresponde ao coeficiente de correlação de Pearson; M1 para a fracção de proteína a ser estudada sobrepondo-se ao ADN ou XmnI e M2 a fracção de ADN XmnI ou sobrepondo-se à proteína. As linhas horizontais apresentam os valores médios ± SE de 20 campos (122-226 NMS total) replicadas em dois experimentos diferentes (* P≤0.03, ** P 0,001).

Confocal Laser Scanning Microscopy e análise de imagem

Em células LNCaP e PC3 inteiros, a análise da relação espacial entre as proteínas em estudo e o ADN total foi realizada por coloração de imunofluorescência dupla cor como relatado anteriormente [15]. As proteínas foram marcadas usando um anticorpo primário contra qualquer especial proteína rica em AT-1 (SATB1) (diluição de 1:20, Santa Cruz) ou poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) de ligação de sequência (1:50, Santa Cruz) com FC

TM555 de cabra anti-IgG de coelho (diluição 1:200, Biotium) como o anticorpo secundário, ao passo que o ADN foi marcado com 5 uM SYTOX laranja (Molecular Probes). A fim de estudar as interacções entre as proteínas NM e sequências MAR, foi realizada imuno-FISH em NM extraído diretamente em lâminas seguindo o procedimento descrito acima. Esta técnica de imuno-coloração de peixes em causa simultânea das proteínas nm e sequências de ADN e é constituído por duas partes. Na primeira parte (FISH), as sequências de MAR foram visualizados utilizando uma sonda biotinilada XmnI como relatado acima (ver secção halo-FISH). Na segunda parte, as proteínas nm foram detectados por imunofluorescência usando o anti-coelho SATB1 (1:15 diluição, Santa Cruz), anticorpo de coelho anti-PARP (01:40, Santa Cruz) ou anticorpo de cabra anti-lamina B (diluição de 1:20 , Santa Cruz). A imunolocalização dos complexos proteína-Mar foi levada a cabo usando um cocktail de anticorpos secundários marcados (CF

TM633 anti-Ig de coelho, diluição 1:100 e Alexa 488 anti-Ig de cabra, 1:100 diluição) e estreptavidina conjugada com CF

TM555 (1:100 diluição). Todas as imagens confocais foram coletados de acordo com o critério de Nyquist como conjuntos de dados 3D (Z-pilhas) com um tamanho de passo de 250 nm usando um Olympus FV-500 varredura a laser microscópio confocal equipado com uma NA objectiva de imersão em óleo 60 × /1,4. processamento de imagem e análise de co-localização foram realizados conforme descrito anteriormente [15], utilizando software v1.43 WCIF ImageJ que fornece o coeficiente de correlação de Pearson (R) e a co-ocorrência Manders ‘coeficientes (M1 e M2).

(a) imagens de microscopia confocal representativos de lamina B (vermelho) e sequência XmnI (azul) no NM extraído

in situ

e corados pela imuno-FISH. As barras correspondem a 5 um. (B) seção ampliada de 2D-PAGE corado com SYPRO Ruby (a, c) ou Pro-Q diamante que mancha seletivamente apenas fosfoproteínas (B, D). As setas indicam as diversas isoformas de lamina B. A mesma cor corresponde à mesma isoforma em duas linhas celulares. Em células PC3, o peptídeo não-fosforilada presente em células LNCaP desapareceu (setas vermelhas).

Resultados

A expressão das proteínas de ligação NM Marte dependerá de Diferenciada Estado da Linha celular CaP

NM as proteínas extraídas a partir de células LNCaP, células 22Rv1 e PC3 foram separados por 1D-PAGE e um ecrã de se ligar à sequência de XmnI foi realizada. Em todas as linhas celulares examinadas, três grupos de proteínas (centrada em torno de 107, 71 e 55 kDa, respectivamente) que liga fortemente o ADN foram identificadas (Fig. 1A, setas). Não há mudanças qualitativas foram apreciável entre as três linhas celulares; No entanto, a quantidade de ligação de ADN das proteínas nm foi significativamente mais elevada nas células menos agressivas (Fig. 1B).

(A) nucleoids representativos coradas quer por DAPI (azul) para visualizar o ADN total única (esquerda painéis ) ou por halo-FISH para destacar a sequência XmnI (vermelho) e contrastadas com DAPI para detectar DNA total (azul) .O bar corresponde a 10 mm. parcela (B) de dispersão que mostra a distribuição de tamanho de ADN de halo. As linhas horizontais indicam as médias dos valores obtidos de medição para cada linha celular, pelo menos, 100 nucleoids. O tamanho médio de ADN de halo ± SE foi de 6,8 ± 0,2 para as células LNCaP e 7,5 ± 0,2 para as células PC3, respectivamente (p = 0,009). O painel inferior mostra a distribuição dos raios de halo agrupados em intervalos de 2 uM de frequência. (C) Um modelo esquemático da inter-relação entre os loops e do NM na desdiferenciação de células APC. Em células mais diferenciadas (LNCaP) do NM é bem organizados com várias proteínas ligadas a sequências MAR. Em PC3, onde algumas regularidades estruturais do NM desaparecer, um menor número de espécies de proteínas ligadas a Marte e assim um laço de ADN maior é ancorada ao NM.

polipeptídeos, caracterizamos ainda mais a expressão de as proteínas nm, por 2D-PAGE seguido por análise de 2D SWB. Os perfis de expressão total obtido a partir dos geles 2D eram bastante semelhantes; No entanto, uma análise em profundidade mostrou que a complexidade do padrão de proteína foi inversa ao grau de diferenciação celular. células PC3 mostraram o padrão de proteína NM mais complexo e 22Rv1 apresentado um padrão intermediário entre LNCaP e células PC3 (Fig. 1C, E e G). Em média, 725 manchas de proteína foram detectadas no NM isolado a partir de células LNCaP (intervalo 598-781), 847 (intervalo 808-909) a partir de células 22Rv1 e 918 (gama 727-1142) a partir de células PC3. O diagrama de Venn relatado na Fig. 2A mostra que a maior parte dos pontos visualizados em jogo 2D-PAGE em três linhas de células, de acordo com o resultado, já relatadas, que mais de 70% das proteínas NM são comuns entre as linhas de células e tecidos APC; estas proteínas são o componente de NM-tipo de célula específico [9], [16]. As manchas diferencialmente expressos em 22Rv1 e PC3, no que diz respeito às células LNCaP, foram de 98 e 155, respectivamente. Em particular, 22 pontos foram sobre-expressos e 76 estavam sub-expressos em células 22Rv1 e 98 foram sobre-expressos e 57 foram sub-expressos em PC3. Esta observação confirma os resultados anteriores indicam que o padrão de proteína NM sofre alterações com a diferenciação celular [16] e aumentos na complexidade na passagem de mais- de tumores menos diferenciadas [7], [8], [17].

p> Quando géis 2D foram analisados ​​por SWB, várias proteínas NM ligou-se fortemente a sequência XmnI (Fig. 1D, F e H). A ligação foi um, em vez de uma interacção inespecífica (electrostática) específica da sequência porque após incubação das membranas durante a noite em NaCl 2 M a ligação ainda era detectável (dados não mostrados). De acordo com a análise 1D, uma diminuição global em DNA foi observada obrigatório em função da diferenciação celular: cerca de 136 pontos MAR vinculativos foram visualizados em LNCaP, 79 em 22Rv1 e 63 em células PC3. Como um todo, a análise mostra que um aumento na complexidade do padrão de proteína NM é síncrono com um decréscimo do número de proteínas de ligação a sequência XmnI. Com efeito, estes últimos foram de 19, 9 e 7% da proteína total expressa por NM LNCaP, 22Rv1 e células PC3, respectivamente (Fig. 2 B-D).

As manchas principais de ligação XmnI foram identificados pela WB e por isso, foi possível atribuir uma identidade com as proteínas detectadas por 1D SWB. O primeiro grupo, com peso molecular mais elevado, corresponde à co-migração de PARP1, ribonucleoprote�a nuclear heterogênea (RNPhn) U, Marpa e Matrin3; o segundo grupo corresponde a MARPb, Lamin A, lamin B e RNPhn M; e o terceiro grupo corresponde a PARP2, hnRNP I, hnRNP K e os fragmentos de PARP1 e SATB1.

A comparação entre os SWBS 2D das diferentes linhas de células de apresentação de suplente que, além de uma alteração do número de proteínas também expressa a intensidade do sinal de ligação a ADN de alguma da sua mudança. As alterações mais evidentes foram entre as células LNCaP e PC3 que, também neste caso, o comportamento das células 22Rv1 foi intermediária. Portanto, as seguintes análises foram realizadas comparando os dois celulares mais diferentes ou seja PC3 LNCaP vs..

a expressão e localização de PARP e SATB1 depender do nível de Diferenciação de Células CaP

células PC3 com relação LNCaP, a intensidade do sinal de DNA ligação a Matrin3, fragmento SATB1, RNPhn U e todos os hnRNPs básicos diminuiu. Este decréscimo pode ser devido ao baixo-expressão dos hnRNPs de base (que estão entre os 57 pontos encontrados para ser sub-expressos em células PC3), uma mudança na razão da expressão de diferentes isoformas (por exemplo, para hnRNP L e Matrin3) ou um padrão diferente de fragmentação (por SATB1). Vice-versa, a expressão de PARP2, Marpa e MARPb aumentada. Embora estas duas últimas proteínas estavam presentes em uma quantidade tão pequena que muitas vezes não foram detectadas por coloração com prata (Fig. 1C e G), eles ligados muito fortemente ao Marte. Infelizmente, como já foi relatado [4], e Marpa MARPb ainda não foram identificados e que são muito susceptíveis de serem novas proteínas não caracterizadas. Assim, temos quantificada a expressão das proteínas que diferencialmente ligados a sequência XmnI por análise de WB 1D utilizando anticorpos disponíveis comercialmente.

diagramas que ilustram as quantidades relativas de proteínas e WB experiências representativas são mostrados na Fig. 3. Para hnRNP L e Matrin3, apenas uma tendência para uma diminuição pode ser observada em PC3 com respeito às células LNCaP; vice-versa, tanto PARP e SATB1 sofrer modificações significativas em sua expressão. Maior expressão de PARP foi detectada em células PC3, e a proteína era no seu estado nativo com apenas uma pequena quantidade (cerca de 19%) da repartição característica de 89 kDa [18] detectada. maior expressão desta proteína em células PC3 (que representam um fenótipo mais indiferenciada em relação às células LNCaP) está de acordo com a correlação inversa entre o grau de diferenciação celular e actividade de PARP [18].

Em relação aos SATB1, duas faixas bem visíveis de quase igual intensidade em 89 (SATB1 nativa) e 54 kDa são detectáveis ​​em células LNCaP. Em células PC3, a expressão da proteína de comprimento completo e diminui em três fragmentos de 62, 54 e 43 kDa estão presentes. Adicionalmente, a intensidade destas três bandas diminui para 60% em relação ao SATB1 intactas, o que indica que não só era a proteína diferencialmente expressas entre as duas linhas celulares, mas que tanto a intensidade e o padrão de fragmentação eram diferentes, bem como (Fig. 3). Os produtos de degradação mais comuns SATB1 são dois fragmentos de cerca de 70 e 30 kDa [19], embora outros fragmentos, com pesos moleculares muito próximas às observadas nas nossas experiências, também são relatados [20], [21]. O anticorpo policlonal de cabra utilizado neste estudo reconhece a extremidade N-terminal SATB1; portanto, que se espera para detectar as bandas correspondentes a full-length SATB1 e os péptidos mais curtos. Em vez disso, em células LNCaP o principal produto de degradação foi um fragmento de kDa 54 que podem corresponder à deleção C-terminal de amino ácido 494 (Mr calculada 54915) que contém os domínios necessários para a localização no NM e para a ligação a MARS [22 ]. Como uma confirmação do que acima disse, em 2D SWB (Fig. 1D), detectamos um fragmento SATB1 ligação a sequência XmnI a cerca de 54 kDa. Além disso, a existência de um padrão de fragmentação de proteína diferente em PC3 com respeito ao LNCaP não é devido à presença de populações apoptóticas porque não detectar qualquer fragmentação de ADN nem corpos apoptóticos em preparações de células (dados não apresentados). Por conseguinte, é possível que os padrões de clivagem são altamente dependente do estado de diferenciação e proliferativa particular de uma célula de [21], [23]. A razão pela qual toda a SATB1 não migra em 2D, apesar migrando em experiências 1D WB é ainda desconhecida. Pode depender da baixa concentração da proteína na solução utilizada para carregar as amostras em tiras de gel de focagem isoeléctrica, mesmo se problemas de solubilidade não pode ser excluída.

Para determinar se a distribuição e a interacção da PARP e SATB1 com o ADN de sequências e /ou danificar mudar como uma função do grau de diferenciação celular, foi realizada análise por microscopia confocal.

em células LNCaP e PC3 inteiros, PARP (visualizada em verde na Fig. 4A) estava presente no nucleoplasma onde ele exibiu uma coloração granular homogêneo, de acordo com investigações anteriores [24]. [25].